Dieses Protokoll bietet einen standardisierten Ansatz zur Abbildung und Quantifizierung der Veränderungen der mitochondrialen Morphologie in mehreren Geweben. Bei C elegance wird die mitochondriale Morphologie oft mit seiner Funktionalität in Verbindung gebracht. Veränderungen in der mitochondrialen Morphologie können unter verschiedenen Krankheitsbedingungen und mit dem Fortschreiten des Alterns beobachtet werden, die oft mit einer Dysregulation der mitochondrialen Funktion, verschiedenen Geweben und Eleganz korrelieren.
Weisen einzigartige mitochondriale Strukturen auf, die unterschiedliche Bildgebungsstrategien erfordern. Daher ist die Auswahl eines geeigneten Mikroskops und die Optimierung der Probenvorbereitung für eine erfolgreiche gewebespezifische Bildgebung von Mitochondrien und C Elegance unerlässlich. Hier haben wir uns entschieden, die transgenen Cele-Stämme zu verwenden, die mitochondrienlokalisiertes GFP exprimieren, anstelle von herkömmlichen mitochondrialen Farbstoffen.
Dies ermöglicht es uns, Off-Target-Effekte, onale Bi-Penetranz und die komplexen Probenvorbereitungsschritte zu vermeiden, die erforderlich sind, um Mitochondrien in verschiedenen Geweben mit einem Farbstoff sichtbar zu machen. Der Schwerpunkt unseres Labors liegt auf der Untersuchung der mitochondrialen Homöostase während Stress und Alterung. Die Standardisierung eines mitochondrialen Bildgebungsprotokolls ist unerlässlich, um extramentale Fehler zu minimieren und reproduzierbare Ergebnisse bezüglich Veränderungen der mitochondrialen Morphologie unter verschiedenen biologischen Bedingungen zu erzielen.
Besorgen Sie sich zunächst saubere Objektträger. Zur Probenvorbereitung geben Sie 10 bis 20 Mikroliter M neun Lösung auf den Objektträger und geben die gewünschte Anzahl adulter Würmer in einem bestimmten Alter in die Lösung. Decken Sie auf dem Objektträger die Würmer in der Lösung M neun mit einem Deckglas ab, um den Muskel abzubilden.
Mitochondrien, schieben Sie den Deckschirm an, um die Würmer zu rollen. Versiegeln Sie dann mit einem Nagellack die Seiten des Deckglases, um das Verdampfen der M nine Lösung zu verhindern. Verwenden Sie ein Standard-Weitfeldmikroskop, um Muskel- und epidermale Mitochondrien abzubilden, die die fluoreszierenden Markierungen exprimieren.
Verwenden Sie ein konfokales Mikroskop für die Darstellung der Darmmitochondrien und optimieren Sie die Bildgebungseinstellungen, um sie an den spezifischen Versuchsaufbau anzupassen. Um die Analyse zu starten, öffnen Sie nach der Installation die Anwendung Fiji, um das mimo mapper-Makro herunterzuladen und zu installieren. Laden Sie zunächst den Quellcode herunter.
Kopieren Sie den Code, der unter Ein IJM-Code für MIT-Mapper 1.0 aufgeführt ist. Öffnen Sie Fiji und gehen Sie zu Plugins, gefolgt von Neu und Makro Fügen Sie den kopierten Code in das Makrofenster ein. Speichern Sie dann das Makro für die zukünftige Verwendung per Datei und speichern Sie es unter.
Navigieren Sie zur Datei und öffnen Sie dann zum Öffnen eines mikroskopischen 3D-Bildes mit Zs.In Fidschi, erstellen Sie eine maximale Projektion unter dem Bild, gefolgt von Stapeln und Z-Projekt. Wählen Sie den Bereich der Slices in fokussierten Bildern für die maximale Projektion aus, und wählen Sie maximale Intensität als Projektionstyp aus, um das maximal projizierte Bild zu speichern. Gehen Sie als TIFF zu Datei und klicken Sie auf Speichern unter, gefolgt von tiff.
Klicken Sie auf Ausführen. Wenn Sie dazu aufgefordert werden, wählen Sie den Ordner aus, der die im vorherigen Schritt gespeicherte TIFF-Datei enthält. Wenn Sie aufgefordert werden, einen Bereich auszuwählen, erstellen Sie mit dem Rechteckwerkzeug ein Rechteck im Bild und drücken Sie zur Bestätigung auf OK.
Gehen Sie abschließend zur Datei und speichern Sie die Daten mit allen Werten, die sich auf die mitochondriale Morphologie beziehen, als Punkt-CSV-Datei. Die mitochondriale Morphologie war gewebespezifisch mit röhrenförmigen Mitochondrien, die sich an den Muskelfasern in den Muskeln ausrichteten, miteinander verbundenen netzartigen Strukturen im Darm und eher abgerundet oder oval waren. Die Bildgebung der Mitochondrien in der Hypodermis mit einem konfokalen Mikroskop verbesserte die Visualisierung der Darmmitochondrien, indem das unscharfe Licht im Vergleich zur Verbindungsmikroskopie reduziert wurde.
Auf den Objektträgern zeigten die Mitochondrien nach 30 Minuten im M neun-Puffer eine Fragmentierung, wobei die epidermalen Mitochondrien die ausgeprägteste Fragmentierung zeigten. Das Altern führte zu einer mitochondrialen Fragmentierung in allen Geweben, die als verkürzte und kugelförmige Strukturen erscheinen. Die Quantifizierung des MIT-Mappers zeigte, dass sich die Objektlänge in den Muskeln und der Verbindungspunkt in der Hypodermis änderten.
