Ce protocole fournit une approche standardisée pour imager et quantifier les changements de morphologie mitochondriale dans plusieurs tissus. Dans l’élégance C, la morphologie mitochondriale est souvent associée à sa fonctionnalité. Des changements dans la morphologie mitochondriale peuvent être observés dans diverses conditions de maladie et avec la progression du vieillissement, qui sont souvent corrélées avec une dysrégulation de la fonction mitochondriale, Différents tissus et voir l’élégance.
Présenter des structures mitochondriales uniques qui nécessitent des stratégies d’imagerie distinctes. Par conséquent, la sélection d’un microscope approprié et l’optimisation de la préparation des échantillons sont essentielles pour une imagerie tissulaire spécifique réussie des mitochondries et de C Elegance. Ici, nous avons choisi d’utiliser les souches de céle transgéniques exprimant la GFP localisée des mitochondries au lieu des colorants mitochondriaux conventionnels.
Cela nous permet d’éviter les effets hors cible, la pénétration onale et les étapes complexes de préparation des échantillons nécessaires pour visualiser les mitochondries dans différents tissus à l’aide d’un colorant. L’objectif principal de notre laboratoire est d’étudier l’homéostasie mitochondriale pendant le stress et le vieillissement. La standardisation d’un protocole d’imagerie mitochondriale est essentielle pour minimiser les erreurs extra-mentales et générer des résultats reproductibles concernant les changements de morphologie mitochondriale dans diverses conditions biologiques.
Pour commencer, procurez-vous des lames de verre propres. Pour la préparation de l’échantillon, ajoutez 10 à 20 microlitres de solution de M neuf sur la lame de verre et placez le nombre souhaité de vers adultes à des âges spécifiques dans la solution. Sur la diapositive, couvrez les vers de la solution M neuf avec un verre de couverture pour imager le muscle.
Mitochondries, poussez la lamelle pour rouler les vers. Ensuite, avec un vernis à ongles, scellez les côtés du verre de protection pour éviter l’évaporation de la solution M nine. Utilisez un microscope standard à grand champ pour imager les mitochondries musculaires et épidermiques exprimant les marqueurs fluorescents.
Utilisez un microscope confocal pour imager les mitochondries intestinales et optimisez les paramètres d’imagerie en fonction de la configuration expérimentale spécifique. Pour commencer l’analyse, ouvrez l’application Fidji après l’installation pour télécharger et installer la macro mito mapper. Tout d’abord, téléchargez le code source.
Copiez le code répertorié sous Code A IJM pour MIT mapper 1.0. Ouvrez Fiji et allez dans plugins, puis nouveau et collez le code copié dans la fenêtre de macro. Enregistrez ensuite la macro pour une utilisation ultérieure via un fichier et enregistrez-la sous.
Naviguez jusqu’au fichier, puis ouvrez pour ouvrir une image microscopique 3D avec Zs.In Fidji, créez une projection maximale sous l’image, suivie des piles et du projet Z. Sélectionnez la plage de tranches dans les images nettes pour la projection maximale et choisissez l’intensité maximale comme type de projection pour enregistrer l’image projetée maximale. En tant que tiff, allez dans fichier et cliquez sur enregistrer sous suivi de tiff.
Recadrez les zones d’intérêt de l’image complète à l’aide de l’outil rectangle et accédez à l’image et recadrez. Allez dans le fichier suivi de Enregistrer sous et tiff pour enregistrer l’image de recadrage au format Tiff. Faites glisser et déposez la carte mito ou le fichier macro précédemment enregistré dans la barre d’outils Fidji.
Cliquez sur Exécuter. Lorsque vous y êtes invité, sélectionnez le dossier contenant le fichier TIFF enregistré à l’étape précédente. Lorsque vous êtes invité à sélectionner une zone, créez un rectangle dans l’image à l’aide de l’outil Rectangle et appuyez sur OK pour confirmer.
Enfin, allez dans fichier et enregistrez les données avec toutes les valeurs liées à la morphologie mitochondriale dans un fichier CSV à points. La morphologie mitochondriale était spécifique aux tissus, les mitochondries tubulaires s’alignant avec les fibres musculaires des muscles, les structures interconnectées en forme de toile dans l’intestin et plus arrondies ou ovales. L’imagerie des mitochondries de l’hypoderme avec un microscope confocal a amélioré la visualisation des mitochondries intestinales en réduisant la lumière floue par rapport à la microscopie composée.
Sur les lames, les mitochondries présentaient une fragmentation après 30 minutes dans le tampon M nine, les mitochondries épidermiques montrant la fragmentation la plus importante. Le vieillissement a entraîné une fragmentation mitochondriale dans tous les tissus, apparaissant comme des structures tronquées et sphériques. La quantification de l’outil MIT a indiqué que la longueur de l’objet changeait dans les muscles et que le point de jonction changeait dans l’hypoderme.
