RAN-Peptide sind ein Merkmal der wiederholten Expansion neurodegenerative Erkrankungen wie Die Huntington-Krankheit, amyotrophe Lateralsklerose, und frontotemporale Demenz. Diese Protokolle bieten einen wichtigen standardisierten Ansatz zur Quantifizierung der RAN-Peptidtoxizität im C.elegans-Modellsystem. Die beschriebenen Techniken sind einfach zu erlernen und kostengünstig, können schnell durchgeführt werden und nutzen die reproduzierbaren Eigenschaften des C.elegans-Systems wie Bewegung und Reproduktion.
Beim Versuch dieses Protokolls besteht die größte Herausforderung darin, eine konsistente RAN-Peptidtoxizität und -expression zu erhalten. Die wichtigsten Faktoren zu kontrollieren sind Die Medikamententemperatur, das Timing von Temperaturverschiebungen und die Vorbereitung von Assayplatten. Für Experimentatoren ist es wichtig, die Phänotypen der Tiere in diesem altersabhängigen Prozesstest konsequent zu klassifizieren.
Die visuelle Demonstration dieser Technik zeigt ihre Klassifizierungskriterien. Beginnen Sie mit dem Gießen von Standard-Nematoden-Wachstumsmedium mit einem Millimolaren IPTG und 25 Mikrogramm pro Milliliter Carbenicillin in 24-Well-Platten. Streifen Sie RNAi Fütterung Klone in HT115 Bakterien auf LB Carbenicillin Agar und wachsen sie bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden.
Am nächsten Tag, pflücken Sie eine einzelne Kolonie in einem Milliliter LB Carbenicillin flüssige Medien und wachsen die Bakterien für 18 Stunden bei 37 Grad Celsius beim Schütteln bei 250 Rpm. Entdecken Sie vier einzelne Brunnen der NGM RNAi 24-Well-Platte mit 20 Mikrolitern über Nacht bakterienkulturen, wie im Textmanuskript beschrieben, und ermöglichen RNAi-Bakterien, über Nacht eine doppelsträngige RNA-Produktion zu induzieren. Verwenden Sie die Standard-Hypochlorit-Methode, um Eier vom ersten Tag an zu isolieren, in dem erwachsene C.elegans das integrierte RAN-Peptidtransgen exemittiert.
Dann säen Sie etwa 30 Eier in jeden Brunnen der 24-Well-Platte und bebrüten den Teller bei 20 Grad Celsius für sieben Tage. Um eine Videogeschwindigkeitsanalyse durchzuführen, können Sie zwei Videos von zwei separaten Bohrungen für jede RNAi-Bedingung mit einem Stereo-Sezierendes Mikroskop mit einer monochromen Kamera erfassen. Stellen Sie sicher, dass konsistente Erfassungseinstellungen zwischen Brunnen verwendet werden.
Legen Sie für jedes Video die Dauer von 10 Sekunden und das Zeitintervall auf 76 Millisekunden fest. Legen Sie die Belichtungszeit für das Bild auf vier Millisekunden fest, und verwenden Sie die Zoomeinstellung 1,49. Wählen Sie dann zwei durch zwei Binning.
Stellen Sie sicher, dass die Auflösung 800 x 600 Pixel beträgt, und starten Sie die Aufnahme. Nach der Erfassung, beschriften Sie jedes Video sofort mit der Sorte, RNAi Zustand und Well-Nummer. Messen Sie dann die zurückgelegte Strecke und die Länge jedes Tieres für 20 verschiedene Tiere pro Video, wobei insgesamt etwa 40 Würmer für jede RNAi-Bedingung untersucht werden.
Wählen Sie in der Software die Schaltfläche "Anmerkungswerkzeuge" aus. Dann das Zeichnen Textwerkzeug. Klicken Sie auf einen Punkt in der Mitte des Wurms, der im ersten Frame des Videos gemessen wird, und markieren Sie ihn mit einer Zahl.
Fördern Sie das Video bis zum Ende, während Sie den Wurm visuell verfolgen. Klicken Sie dann darauf und markieren Sie es mit der nächsten entsprechenden Zahl. Verwenden Sie das Werkzeug Zeichnungsmaßstab, um eine Linie von der ersten Zahl zur zweiten Zahl zu zeichnen und die zurückgelegte Strecke in einer Kalkulationstabelle aufzuzeichnen.
Wiederholen Sie diese Messung für 19 andere Würmer im Video, während jede einzelne Messung im Analysefenster beibehalten wird. Sobald die Messungen abgeschlossen sind, machen Sie eine Momentaufnahme des endgültigen Videorahmens, der alle Messlinien veranschaulicht, so dass die Daten auf das Tier zurückverfolgt werden können, von dem sie stammen. Analysieren Sie als Nächstes die Daten mit einer vierspaltigen Kalkulationstabelle, wobei Spalte eins der Wurmbezeichner und Spalte zwei die Geschwindigkeit ist.
Die Uhrzeit jedes Videos kann durch Rechtsklick auf das Video unter dem Experiment und gehen zu den Eigenschaften gefunden werden. Um die Geschwindigkeitsmessung zu normalisieren, finden Sie die Länge jedes Tieres. Verwenden Sie das Werkzeug Polylinien zeichnen, um die C.elegans von der Kopfspitze bis zur Schwanzspitze frei zu verfolgen.
Dann machen Sie einen Schnappschuss des endgültigen Videoframes, der alle Polylinien veranschaulicht. Die Länge der Zeilen wird statistisch erfasst. Fügen Sie der Kalkulationstabelle zwei Spalten hinzu, eine für die Tierlänge und eine für normalisierte Geschwindigkeit.
Analysieren Sie schließlich die normalisierten Geschwindigkeitsdaten mithilfe einer einwegigen ANOVA mit Post-hoc-Tests im Vergleich zu leeren Vektor-RNAi. Legen Sie vier bis sechs transgene L4 C.elegans, die RAN-Peptid GFP exdrücken, auf eine sechs Zentimeter große GFP-RNAi-Platte und wachsen Sie sie bei 20 Grad Celsius. Wenn das Experiment RNAi nutzt, um genetische Auswirkungen auf die RAN-Peptidtoxizität zu testen, bewegen Sie 10 transgene gravid Erwachsene zu jedem der beiden leeren Vektor-RNAi-GFP-RNAi- oder genspezifischen RNAi-Platten.
Wenn Mutanten verwendet werden, um genetische Auswirkungen auf die RAN-Peptidtoxizität zu analysieren, platzieren Sie 10 gravid wild type oder mutierte Tiere, die das gleiche RAN-Transgen auf zwei leere Vektor-RNAi- oder GFP-RNAi-Platten ausdrücken. Wachsen Sie sie bei 20 Grad Celsius für 48 Stunden. Wählen Sie 10 Sätze mit 10 transgenen L4s aus den RNAi-Platten und legen Sie jedes Set auf eine drei Zentimeter große RNAi-Platte.
Stellen Sie sicher, dass die würmer, die für den Test ausgewählt wurden, alle oberflächlich normale Beweglichkeit haben. Legen Sie die Platten in eine Plastiktüte, um Feuchtigkeit zu behalten und sie bei 25 Grad Celsius zu bebrüten. Analysieren Sie nach 24 Stunden die Tiere auf Ihre Mobilität, indem Sie auf die Platten am Sezierendes Mikroskop tippen und die Bewegung überprüfen.
Bewegt sich ein Wurm mehr als eine Körperlänge, zählen Sie ihn als mobil und übertragen Sie ihn auf eine neue drei Zentimeter große RNAi-Platte. Verwenden Sie einen Platin-Pick, um die verbleibenden Würmer auf Kopf und Schwanz zu tippen. Bewegt sich das Tier mehr als eine Körperlänge, zählen Sie das Tier als mobil und übertragen Sie es auf eine neue drei Zentimeter RNAi-Platte.
Wenn in der leeren Vektorsteuerung am zweiten Tag keine signifikante Lähmung beobachtet wird, beenden Sie den Test und beginnen Sie von vorn. Gruppieren Sie alle nicht beweglichen Würmer so, dass die Bewegung von mehr als einer Körperlänge leicht erkannt werden kann. Zählen Sie alle gelähmten, verpackten oder toten Würmer und entsorgen Sie die Platte.
Setzen Sie die Tiere für lähmungserhin jeden Tag für fünf bis sieben Tage. Der Wachstumstest wurde verwendet, um die Wirkung von Genhemmungen auf die Toxizität von RAN-Dipeptiden zu messen, die bei ALS-Patienten mit einer G4C2-Wiederholungsexpansion gefunden werden. Die Expression von PR50 GFP allein führte zu einem vollständigen Wachstumsstillstand, aber der Abbau mehrerer Gene unterdrückte die Entwicklungstoxizität.
Die Wirkung spezifischer Genknockdowns auf die Entwicklungsmotilität von PR50-exemittierenden Tieren wurde mit der Videogeschwindigkeitsanalysemethode gemessen. Wie erwartet führte die Hemmung der PR50 GFP-Expression zu einer starken Erhöhung der Beweglichkeit im Vergleich zu leeren Vektor RNAi. Darüber hinaus führte die RNAi gegen die Proteasomen-Untereinheit RPN7 zu einer signifikanten Erhöhung der PR50-Motilität.
Wenn erwachsene Phänotypen mit dem altersabhängigen Lähmungstest analysiert wurden, zeigte PR50 GFP bis zu 80% Lähmung bis zum Alter von fünf Tagen. RNAi, das sich jedoch auf die Gen-Cul-6 richtete, verzögerte die Lähmung signifikant, was darauf hindeutet, dass cul-6 für die PR50 GFP-Toxizität erforderlich ist. Um festzustellen, ob RAN-Proteine Neuropathologie verursachen, wenn sie in C.elegans-Neuronen exprimiert werden, wurde die neuronspezifische Toxizität mit dem Commissure-Assay untersucht.
In Tag zwei Erwachsene, PR50 GFP-Expression in den motorischen Neuronen führte zu einem signifikanten Anstieg der motorischen Neuronbleblessur. Diese Neuropathologie wurde signifikant durch eine Mutation im Insulin-IGF-Rezeptor-Gen Homolog DAF-2 unterdrückt, die die toxischen Eigenschaften mehrerer neurodegenerativer Proteine verzögert. Für den Verhaltenstest ist es wichtig, dass die RAN-Peptide einen stark penetrativen Phänotyp produzieren.
Solche Gene oder Medikamente könnten neue Biomarker oder therapeutische Optionen für RAN-Peptiderkrankungen bieten. Mit diesen Assays haben wir einen genomweiten RNAi-Bildschirm für Unterdrücker des C9ORF72-assoziierten RAN-Peptidprolinins durchgeführt. Zu den in diesem Bildschirm identifizierten Genen gehören viele neue und konservierte Gene, die Gegenstand zukünftiger mechanistischer Studien sein werden.
