Wir demonstrieren die isometrische oder tensometrische Myographie als Goldstandardprotokoll, um die Reaktivität von kleinen Widerständen oder großen Blutgefäßen in einem gut kontrollierten physiologischen Zustand zu messen. Die Messungen sind sehr reproduzierbar und zuverlässig. Die Technik ist sehr wertvoll, um es Forschern zu ermöglichen, verschiedene Schichten von Blutgefäßen separat zu untersuchen oder die Interaktion zwischen verschiedenen Schichten der Blutgefäßwand gleichzeitig zu untersuchen.
Das Verfahren wird von Robert Folk, dem Forschungslaborspezialisten aus meinem Labor, demonstriert. Schalten Sie zunächst das Wasserbad ein und stellen Sie es auf 37 Grad Celsius ein. Geben Sie zwei Becher mit entsprechender Beschriftung in das Wasserbad, eines mit 600 Milliliter HEPES-PSS-Lösung und eines mit 150 Milliliter kaliumreicher Lösung.
Belüften Sie ein Becherglas mit 300 Milliliter HEPES-PSS-Lösung mindestens 10 Minuten lang mit Carbogengas. 30 Milliliter der belüfteten HEPES-PSS-Lösung in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen geben, entsprechend etikettieren und auf Eis legen. Bewahren Sie die verbleibende belüftete HEPES-PSS-Lösung auf Eis auf, um sie während der Aortendissektion zu verwenden.
Schalten Sie die Vierkammer-Myographeneinheit bei 5 Milliliter HEPES-PSS-Lösung in jede Myographenkammer ein und stellen Sie die Hitze auf 37 Grad Celsius ein. Lassen Sie die Lösung in jeder Kammer 30 Minuten lang belüften und prüfen Sie, ob die Kammern die gewünschten 37 Grad Celsius erreicht haben. Schalten Sie die Datenerfassungshardware und den Computer für die Datenerfassung für Myographen ein.
Den von den euthanasierten Mäusen ausgeschnittenen Brustkorb in eine klare, mit Silikonelastomer beschichtete Petrischale geben, die mit eiskalt belüftetem HEPES-PSS-Puffer gefüllt ist, und beidseitig festnageln. Unter dem Mikroskop das Herz und die befestigte Aorta vorsichtig aus dem Brustkorb schneiden und entfernen und in eine saubere, mit Silikonelastomer beschichtete Schale geben, dann sanft Fettbindegewebe und geronnenes Blut aus der Aorta entfernen. Mit einer scharfen kleinen Schere sezieren und isolieren Sie die gesamte Aorta vom Bogenbereich bis zum Boden der absteigenden Aorta.
Schneiden Sie die sezierte Aorta in vier Segmente von je 2 Millimetern. Verwenden Sie das Minilineal innerhalb der Schale als Referenz. In Kammern, die bereits 5 Milliliter erwärmtem und belüftetem HEPES-PSS-Puffer enthalten, schieben Sie jedes der 2-Millimeter-Aortensegmente vorsichtig mit einer Pinzette auf die beiden Montagestifte.
Wenn Sie die Kammer wieder in die Myographeneinheit einsetzen, bewegen Sie die Stifte langsam auseinander, indem Sie den Mikrometer gegen den Uhrzeigersinn drehen, damit das Aortensegment nicht von den Stiften rutscht. Bringen Sie jede Myographenkammer in das Gerät zurück und beginnen Sie mit der Belüftung der Kammern bei 37 Grad Celsius für 20 Minuten. Die Kammern abtropfen lassen und 5 Milliliter frische, warme, belüftete HEPES-PSS-Lösung in jede Kammer geben.
Passen Sie bei Bedarf die Kraftmessungen nach, um die optimale Spannung von 6 Millinewton abzulesen. Lassen Sie das Gewebe für weitere 15 bis 20 Minuten ruhen. Öffnen Sie die Datenerfassungssoftware.
Ändern Sie die Tracking-Nummern von 50 zu 1 zu 500 zu 1 und drücken Sie Start. Bevor Sie ein neues Experiment starten, stellen Sie sicher, dass Sie die entsprechende Bezeichnung auf der Datenerfassungssoftware hinzufügen. Lassen Sie die Kammern noch einmal abtropfen, bevor Sie 5 Milliliter kaliumreiche Lösung in jede Kammer geben.
Entleeren Sie die Kammern wieder, sobald die kontraktile Reaktion auf die kaliumreiche Lösung ein Plateau für die Krafterzeugung erreicht. Waschen Sie das Gewebe dreimal mit HEPES-PSS-Lösung. Fügen Sie 5 Milliliter kaliumreiche Lösung in jede Kammer hinzu.
Entleeren Sie die Kammern, sobald die kontraktile Reaktion auf kaliumreiche Lösung ein Plateau für die Krafterzeugung erreicht, und waschen Sie das Gewebe dreimal mit HEPES-PSS, dann ruhen Sie das Gewebe für 15 bis 20 Minuten. Die Aortensegmente mit dem Vasokonstriktormittel PE in einer submaximalen Dosis vorkontrahieren. Lassen Sie die PE-induzierte Kontraktionskurve ein Plateau für die Spannungsentwicklung erreichen.
Fügen Sie PE ein Plateau der Spannungsentwicklung bei 5 Mikrolitern steigender Dosen von Acetylcholin-Arbeitsmateriallösungen in 3-Minuten-Intervallen hinzu, um die endgültigen Konzentrationen von Acetylcholin von 50 Picomolar bis 10 Mikromolar in der Myographenkammer zu bestimmen, wie im Textmanuskript beschrieben. Nach Abschluss des Dosis-Wirkungs-Experiments die Kammern entleeren, die Aortensegmente dreimal mit warmer und belüfteter HEPES-PSS-Lösung waschen und das Gewebe 30 Minuten ruhen lassen. Nachdem Sie die Aortensegmente für 30 Minuten ruhen lassen, die Kammern entleeren und frische, warme kaliumreiche Lösung in jede Kammer geben, dann die Kammern abtropfen lassen und das Gewebe mit HEPES-PSS-Lösung waschen, wenn die Kontraktionsreaktion auf kaliumreiche Lösung ein F-Plateau erreicht, wie zuvor gezeigt.
Vorinkubation der Aortensegmente mit L-NAME durch Zugabe von 10 Mikrolitern der vorbereiteten 100-Millimolar-Arbeitsmateriallösung, um den Beitrag der Stickstoffmonoxidproduktion zur beobachteten Acetylcholin-induzierten Vasorelaxation zu beurteilen. Ohne den L-Namen zu entfernen, fügen Sie die submaximale Dosis von PE in die Kammer ein, um eine Aortenkontraktion zu induzieren. Warten Sie, bis die PE-induzierte Kontraktionskurve ein Plateau für die Spannungsentwicklung erreicht, und fügen Sie dann Acetylcholin in die Myographenkammer hinzu, um eine Endkonzentration von 500 Nanomolaren zu erreichen.
Warten Sie einige Minuten, um mögliche Änderungen in der Kraftentwicklung zu registrieren, bis das gebildete Plateau stabil ist. Die Kammern abtropfen lassen und das Gewebe dreimal mit warmer, belüfteter HEPES-PSS-Lösung waschen. Positionieren Sie die Myographenkammer unter dem Mikroskop und führen Sie vorsichtig einen kleinen Draht durch das Lumen der Aorta.
Bewegen Sie den Draht für kurze Zeit vorsichtig durch das Lumen. Schneiden Sie die Aorta in 2-Millimeter-Aortenringe und montieren Sie diese Ringe auf die Myographenkammer. Stellen Sie die optimale Spannung auf 6 Millinewton ein und lassen Sie das Gewebe 30 Minuten in belüftetem warmen HEPES-PSS-Puffer ruhen, dann die Kammern abtropfen lassen und 5 Milliliter frische, warme belüftete HEPES-PSS-Lösung in jede Kammer geben.
Null die Kraft für alle Myographenkammern und drehen Sie den Mikrometer langsam gegen den Uhrzeigersinn, um den Abstand zwischen den Pins zu vergrößern, bis die registrierte Kraft die gewünschte optimale Spannung für die Mausaorta erreicht. Drücken Sie das Gewebe für weitere 15 bis 20 Minuten bei optimaler Spannung, dann entleeren Sie die Kammern erneut, bevor Sie 5 Milliliter kaliumreiche Lösung in jede Kammer geben. Entleeren Sie die Kammern erneut und waschen Sie das Gewebe dreimal mit HEPES-PSS-Lösung, sobald die Kontraktionsreaktion auf die kaliumreiche Ionenlösung ein Plateau erreicht.
Ruhen Sie das Gewebe für 15 bis 20 Minuten, dann ziehen Sie die Aortensegmente mit PE, dem Vasokonstriktor, vor. Wenn die PE-induzierte Kraft ein Plateau erreicht, fügen Sie die submaximale Konzentration von Acetylcholin in die Myographenkammer hinzu, um eine Endkonzentration von 500 Nanomolaren zu erreichen. Warten Sie 3 Minuten, um sicherzustellen, dass sich das registrierte Plateau für die PE-induzierte Kraftentwicklung nicht ändert, bevor Sie das Experiment beenden.
Die Integrität und Lebensfähigkeit jedes isolierten Schiffes wurde durch die Aufzeichnung der kontraktilen Krafterzeugung bewertet. Der Höhepunkt der aufgezeichneten Kraft wurde später verwendet, um die Krafterzeugung für dasselbe Segment als Reaktion auf die Agonisten zu normalisieren. Die Endothel-vermittelten Vasorelaxationsmessungen zeigten die durch die glatte Muskulatur vermittelte Kontraktion und Krafterzeugung.
Wenn die PE-induzierte Kontraktion ein Plateau erreichte, erreichten steigende Dosen von Acetylcholin die maximale Vasorelaxation im isolierten Segment. Der Stickstoffmonoxid-Inhibitor L-NAME blockierte die Acetylcholin-induzierte Vasorelaxation in der vorkontrahierten Aorta vollständig, was darauf hindeutet, dass Acetylcholin durch Erhöhung der Stickstoffmonoxidproduktion eine Aortenvasorelaxation induziert. Darüber hinaus blockierte das Entfernen der Endothelschicht aus den Aortensegmenten auch die Acetylcholin-induzierte Vasorelaxation, was die Rolle des Endothels bei der Entspannung der Blutgefäße unterstreicht.
Achten Sie darauf, beim Behandeln, Reinigen und Sezieren des Blutgefäßes vorsichtig zu sein. Es ist wichtig, die pharmakologischen Agonisten und Inhibitoren mit Vorsicht hinzuzufügen, um die Blutgefäßringe an den Myographenkammern nicht zu stören. Die Informationen können helfen, Experimente zu entwerfen, um mögliche therapeutische Ansätze zur Behandlung der Funktionsstörung der Schichten eines bestimmten Blutgefäßes zu erforschen.
