Sandeep Khurana wird durch NIH (K08DKO81479) unterstützt. Vikrant Rachakonda durch (T32DK067872) unterstützt.

Die hier gezeigten Beispiele sind aus Experimenten von IACUC in Georgia Regents Universität zugelassen - Protokoll Nr: # 2011-0408 1. Vorbereitung der Reagenzien <ol><li> Bereiten Sezieren Lösung Lager: Für 500 ml Stammlösung Dissektion (5x), lösen sich 21,18 g NaCl, 0,875 g KCl, 0,739 g MgSO 4, 1,049 g MOPS und 0,019 g EDTA in 450 ml Milli-Q-Wasser. PH-Wert auf 7,3 bis 7,4 unter Verwendung von 1 N NaOH. Stellen Sie die Lautstärke auf 500 ml mit Milli-Q-Wasser. Stammlösung kann bis zu 7-10 Tage gelagert werden. Siehe Tabelle 1 für eine Liste von Chemikalien und deren Anbieter. Siehe Tabelle 2 Konzentration in mM. </li><li> Bereiten Sie Arbeits Dissektion Lösung: Bereiten Sie frische Arbeits Dissektion Lösung jeden Tag. Für 100 ml Arbeitslösung, aufzulösen 0,091 g Glucose, 0,016 g NaH 2 PO 4 und 0,022 g Natriumpyruvat in 79,8 ml Milli-Q-Wasser. 0,2 ml 1 M CaCl 2 und 20 ml Präparation Lösung Lager auf volu bringenmich zu 100 ml. </li><li> Vorbereitung physiologische Salzlösung (PSS): Zu 1000 ml PSS herzustellen, löse 0,365 g KCl, 6.545 g NaCl, 0,296 g MgSO 4, 0,163 g KH 2 PO 4, 2,072 g Glucose, 2,184 g NaHCO 3 und 2,383 g in 950 ml HEPES Milli-Q-Wasser. PH-Wert auf 7,3 bis 7,4 unter Verwendung von 1 N NaOH. Stellen Sie die Lautstärke auf 1000 ml mit Milli-Q-Wasser. Entfernen 2 ml Lösung und ersetzen Sie sie mit 2 ml 1 M CaCl 2. (Frische PSS muss täglich hergestellt werden) </li><li> Bereiten Calcium (Ca 2+) kostenlos PSS: Für 100 ml PSS ohne Ca 2+, lösen sich 0,036 g KCl, 0,654 g NaCl, 0,029 g MgSO 4, 0,016 g KH 2 PO 4, 0,207 g Glucose, 0,218 g NaHCO 3, 0,238 g HEPES, 0,015 g EGTA und 0,0026 g Natriumnitroprussid (SNP) in 95 ml Milli-Q-Wasser. PH-Wert auf 7,3 bis 7,4 unter Verwendung von 1 N NaOH. Stellen Sie die Lautstärke auf 100 ml mit Milli-Q-Wasser. </li></ol> 2. Herstellung von Glas Kanülen <ol><li> Ziehen Glaspipettenum die 100-150 um gekippt Kanülen mit einer Pipette Abzieher nach Herstellerrichtlinien zu erzeugen. </li><li> Bevel die Glaskanüle Spitzen mit einem Mikroelektrodenschweißkantenformer, Feuer polieren sie und biegen Sie die Glaskanüle Tipps von ~ 45 ° unter Verwendung eines Hitzesonde. </li><li> Laden Sie die Kanülen in die Mikropipette Halter und befestigen Sie die Mikropipette Halter an der Perfusionskammer. </li></ol> 3. Herstellung der Perfusionskammer <ol><li> Rinse Perfusionskammer mit Milli-Q-Wasser, gefolgt von Sezieren Lösung für jede 5 min. Laden Sie die Kammer mit 2 ml Lösung Dissektion. </li><li> Saug-Dissektion Lösung durch die Kanüle mit 10 ml Spritze und füllen Sie sorgfältig die gesamte Kanüle und den beigefügten Schlauch blasenfrei. Absaugen vorsichtig, um die Erzeugung von Blasen zu verhindern. </li><li> Bereiten Sie zwei Nähte mit einem halben Knoten jeweils mit stumpfen Pinzette. Da ophthalmische Monofilament Nylonnaht (10-0, 0,2 metrische) verwendet werden, um die Knoten, die nur vorzubereiten1-2 mm im Durchmesser, kann Dissektionsmikroskop benötigt. </li><li> Visualisierung unter Dissektionsmikroskop Verwenden Dissektion Zange beide Kanülen mit teilweise geschlossenen Naht Knoten ein wenig weg von der Spitze zu laden. Später wurden diese Knoten wird vorsichtig auf die arterielle Durchbohrte Enden geschoben werden kann und vollständig geschlossen ist. </li></ol> 4. Sammlung von Mesenterialarterie Arcade von Sprague-Dawley Ratten <ol><li> Suchen Genehmigung der örtlichen Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) vor der Durchführung dieser Experimente. Haus Tiere in der Tierhaltung mit kontrollierter Temperatur und Beleuchtung und ermöglicht freien Zugang zu Wasser und einer kommerziellen Nagerfutter. </li><li> Ratten anästhesiert durch intraperitoneale Injektion von Ketamin (80 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg). Bestätigen tiefer Narkose durch Zehen Prise und bei Bedarf weitere Anästhetika verabreichen. </li><li> Nach der Bestätigung der chirurgischen Anästhesie, einschläfern das Tier durch Enthauptung. Folgen Sie AAALAC Richtlinien für utiLizing geeignete Methoden für die Tier Euthanasie. </li><li> Verwenden Sie eine Dissektion Schere und eine Zange, eine Mittellinie Laparotomie vom Becken bis Brustbein durchzuführen. Dies wird in zwei Schritten: Zuerst die Haut einzuschneiden und zweiten, einzuschneiden die zugrunde liegende Muskelschicht. Es ist darauf zu achten, dass die intra-abdominalen Organe verletzen werden. </li><li> Schneiden Sie das proximale Ende des Darms in der Nähe des Pylorus und das distale Ende in der Nähe des ileo-cecal Kreuzung. Binden Sie beide Enden getrennt des Lecks der Chymus und Kot wodurch Kontamination der extrazellulären Badlösung zu verhindern. Einzuschneiden Mesenterium an seiner Basis in der Nähe des Futtergefäß dh A. mesenterica superior und überweisen Sie den gesamten Dünndarm-mesenterica Bett in ein 50 ml Becherglas mit eiskaltem Sezieren Lösung. </li><li> Erlauben gewonnene Gewebe in eiskaltes Dissektion Lösung für 5 Minuten bleiben und spülen Sie mit frischem Dissektion Lösung loswerden Blut zu bekommen. </li></ol> 5. Isolierung und Kanülierung von 4 th </sup&gt; Sortieren Mesenterialarterie <ol><li> Festzunageln das proximale Ende des Darms auf der rechten Seite in einem Sylgard-beschichtete Schale. Verlängern Sie die verbleibenden Darm in einer gegen den Uhrzeigersinn Weg, Pinning das Segment unten, um die Mesenterium verteilt und das Aussetzen der Blutgefäße (Abbildung 1). Beachten Sie: Sie isolieren arterielle Segmente bei Raumtemperatur. Ansonsten legen wir mesenterica Arcade-Schüssel auf Eis enthält. Einige Labors, einschließlich derjenigen, an unserer Hochschule, verwenden Kühleinheiten zu Arterien bei 4 ° C zu sezieren. </li><li> Unter einem Stereo-Zoom-Mikroskop sezieren 3. und 4. Ordnung kleinen Mesenterialarterien (~ 260 &amp; mgr; m), die parallel zu den Dünndarm mit einer kleinen Schere. Erste sezieren entfernt all die Abdeckung Fett. Dann sezieren die Vene und zu isolieren, die Arterie mit V-förmigen Verzweigungspunkt. Achten Sie darauf, um das ausgewählte Segment zu punktieren. Starten Sie sezieren das Fett in der Nähe eines 2. Ordnung Zweig und finden Sie den Weg zu 3. oder 4. order Gefäße. <ol><li> Hinweis: Arterien und Venen können auf der Grundlage ihrer Wandstärke unterscheiden - Arterienwand dicker als die Vene. Außerdem, wenn angrenzende Bindegewebe sanft senkrecht zur Gefäße, Venen Zusammenbruch leicht, während Arterien nicht gezogen. Seit Arterien mit Lumendurchmesser &lt;400 &amp; mgr; m großen Standorten der systemischen Gefäßwiderstand, für dieses Protokoll verwendeten wir 4. Ordnung Ratte Mesenterialarterien (Lumendurchmesser &lt;300 &amp; mgr; m). </li></ol></li><li> Isolieren einer 4-5 mm Schnitt der Arterie parallel an den Dünndarm. Visualisieren Sie alle 5. Ordnung Branchen Einbettung in Dünndarm und schneiden Sie sie leicht von der Herkunft der Filialen und einen Teil zu bewahren. Diese erhaltenen Teile der Äste dienen als Haltestellen (mit Dissektion Zange) für die Übertragung von arteriellen Segmenten zu einer Perfusionskammer und anschließend führen ihre Kanülierung. </li><li> Dann schneiden Sie die arterielle Segmente, indem sie 2 Einschnitte distal5. Um Zweige auf jeder Seite der Arterie und überträgt es auf der Perfusionskammer (siehe Abbildung 1C und Legende). </li><li> Kanülieren einem Ende der Gefäße auf einem Glas-Mikropipette (Durchmesser: 100 bis 150 &amp; mgr; m) mit einer Pinzette Dissektion, indem die Spitzen der Arteriensegment mit Dissektion Pinzette. Schieben Sie den zuvor geladenen teilweise geschlossene Naht auf den kanülierten Ende und sichern. Hinweis: Das proximale Ende der Arterie kann auf die Glaskanüle, die servo-gesteuerten Druckregeleinrichtung verbunden ist, um in situ-Umgebung nachahmen kanüliert werden. </li><li> Anhängen einer Präparierlösung geladen 10 ml Spritze mit dem Sperrhahn in diese Kanüle, so daß Präparierlösung im Schlauch verbindet die Kanüle und Hahn übergeht, daß in der Spritze verbunden ist. Erhöhen Sie vorsichtig die Spritze. Die Gravitationskraft auf die Lösung, die intra vaskulären Blut von dem offenen Ende des Behälters zu entfernen. Nach dem Entfernen der intraarterieller BlutSchließen Sie den Wasserhahn. Hinweis: Alternativ legen Sie den Wasserhahn, um den Druckregler, einschalten und vorsichtig erhöhen den Druck auf 5-10 mm Hg, um das gleiche Ergebnis zu erzielen. </li><li> Binden das distale Ende der Gefäße auf eine zweite Glaskanüle durch vorsichtiges Bringen des anderen Kanüle so dicht wie möglich an der ungebundene Ende des Arteriensegment. Schieben Sie den zuvor geladenen teilweise geschlossene Naht auf den kanülierten Ende und sichern. Es muss darauf geachtet nicht zu zerren oder zu ziehen auf den arteriellen Segmenten werden. Stellen Sie sicher, dass Hähne auf beide Kanülen angebracht sind geschlossen. </li><li> Übertragen Perfusionskammer auf der Stufe der inversen Mikroskop mit Live-Videoaufzeichnungsgeräte. </li><li> Schließen Sie den Absperrhahn der Kanüle mit dem proximalen Ende der arteriellen Segment zu einem servogesteuerten Druckregelgerät gebunden und stellen Sie sicher, dass Hahn in die andere Kanüle befestigt bleibt geschlossen, um eine stabile intraluminale Druck aufrecht zu erhalten. </li><li> Als nächstes befestigen Sie den Vakuumschlauch, um die Ansaugöffnung einnd der Infusionsschlauch an die Perfusionsöffnung der Kammer. Hinweis: abgeschrägte Nadel-Port wird für Saug- und stumpfen Nadel-Port für die Perfusion verwendet. </li><li> Beginnen Perfusion Gefäß mit warmem PSS durch Einreihen-Lösung Heizer (37 ° C, wobei Gasgemisch äquilibriert: 5% CO 2, 5% O 2 und 90% N auf einen neutralen pH und eine angemessene Sauerstoffversorgung 17 zu erhalten) bei 2 ml / min unter Verwendung von eine peristaltische Pumpe. Drehen Sie das Vakuum auf auch. Legen Sie einen Thermistor in der Kammer auf Temperatur kontinuierlich zu überwachen. </li><li> Als die Temperatur der PSS in der Kammer nähert ~ 37 ° C (in der Regel innerhalb von 5 min), langsam steigern intraluminale Druck von 20 bis 100 mmHg und überprüfen Schiffe auf Dichtheit. Dies wird mit Hilfe der automatischen Druckeinstellung des Druckreglers erfolgen. Entsorgen Sie Gefäße mit Leck und Ersetzen mit einem anderen Segment. Die Schiffe mit Leckagen nicht in der Lage, um den Druck zu halten. </li><li> Beurteilen Sie die arterielle Segment biegt, während der Druck bei 100 mmHg beibehalten.Mit der Schraube-Hebel, bewegen Sie die Kanüle, um den arteriellen Segment zu begradigen. Nicht zu strecken die arterielle Segmente; das Ziel ist, in vivo arteriellen Segmentlänge zu imitieren. </li><li> Reduzieren Sie den Druck auf 70 mmHg (in vivo Druck im mesenterialen arcade 18 imitieren) und lassen Sie den arteriellen Segment zu stabilisieren und zu entwickeln myogenic Ton. Arterien variabel (40-70 mmHg) nach Versuchsstrategie und Gefäßbett unter Druck gesetzt werden. Ein zuvor veröffentlichten Aufsatz gibt einen hervorragenden Überblick über die Variabilität in MT in arterielle Segmente aus verschiedenen Gefäßbetten 8. </li></ol> 6. Messung der Arteriendurchmesser <ol><li> Ansicht Arterien 10X-Objektiv auf einem Mikroskop mit einem Schwarzweiß-Videoladungsgekoppelte Einrichtung Kamera ausgestattet. Messen Lumendurchmesser mit Hilfe von Video-Framegrabber und Echtzeit-Rand-Erkennungssystem. Eine Liste von Geräten verwendet wird, die in Tabelle 3 vorgesehen. </li><li> Überwachung und Aufzeichnung Gefäß diameter kontinuierlich. </li><li> Beachten Sie für die Entwicklung von MT. Hinweis: Es wird festgestellt, dass bei Ratten mesenterischen Arterien Widerstand bei 70 mmHg, Entwicklung von MT wird von ~ 20% Abnahme des Durchmessers gekennzeichnet. MT variiert je nach Gefäßbett und Tierarten. </li><li> Bestätigen Gefäß Lebensfähigkeit durch die Beurteilung Vasokonstriktor und gefäßerweiternde Reaktionen auf 1 uM Phenylephrin (Phe) und 1 &amp; mgr; M Acetylcholin (ACh). </li><li> Am Ende jedes Experiments bestimmen passive Durchmesser (PD) durch Inkubation von Arterien in Ca 2+ -freiem PSS für 20 min. </li></ol> 7. Myogenic Antwort <ol><li> Reduzieren Sie den Druck auf 20 mm Hg und damit der Durchmesser zu stabilisieren. Erhöhen Sie die intraluminale Druck in kleinen Schritten (20, 40, 60, 80 und 100) und bei jeder Druckstufe ermöglichen Arterien, um eine stabile Durchmesser (in der Regel innerhalb von 5 Minuten) zu erreichen. </li><li> Reduzieren Sie die intraluminale Druck auf 20 mmHg und Inkubation des arteriellen Segment in Ca 2+ -freien PSS enthält 0,39 mMEGTA und 0,1 mM SNP. Ermöglichen die arterielle Durchmesser zu stabilisieren (normalerweise 15 min). </li><li> Wiederholen Sie den Drucksprungantwort in Ca 2+ -freien PSS enthält 0,39 mM EGTA und 0,1 mM SNP. </li></ol> 8. Interpretation der Ergebnisse und Berechnung von Daten <ol><li> Berechnen Sie die MT als die prozentuale Differenz der für Ca 2+ beobachtet Durchmesser enthaltenden gegen Ca 2+ -freien PSS bei jedem Druck nach folgender Berechnung: <img alt="Gleichung 1" fo:src="/files/ftp_upload/50997/50997eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50997/50997eq1.jpg" /></li><li> Für Arterien unterziehen Gefäßbewegung des Durchmessers kann durch Mittelung der Plateauphase 1 min berechnet werden. Exprimieren die gesammelten Daten als Prozent der maximalen Erholung (% PD) gemäß der Beziehung:% PD = 100 x [&amp; Delta; D / PD]; &amp; Delta; D die Differenz zwischen dem Durchmesser vor und nach der Zugabe von jedem Untersuchungswirkstoff (z Phe); PD ist passive Durchmesser (auch diemaximaler Durchmesser). </li></ol>

<ol>
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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+and+passive+mechanical+properties+of+isolated+arterioles+from+STZ-induced+diabetic+rats.+Effect+of+aminoguanidine+treatment.">Active and passive mechanical properties of isolated arterioles from STZ-induced diabetic rats. Effect of aminoguanidine treatment.</a> Diabetes. 43, 1450-1456 (1994).</li><li>Osol, G., Cipolla, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+myogenic+and+adrenergic+mechanisms+in+isolated,+pressurized+uterine+radial+arteries+from+late-pregnant+and+nonpregnant+rats.">Interaction of myogenic and adrenergic mechanisms in isolated, pressurized uterine radial arteries from late-pregnant and nonpregnant rats.</a> Am J Obstet Gynecol. 168, 697-705 (1993).</li><li>Cipolla, M. J., McCall, A. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noradrenaline-induced+depolarization+is+smaller+in+isobaric+compared+to+isometric+preparations+of+rat+mesenteric+small+arteries.">Noradrenaline-induced depolarization is smaller in isobaric compared to isometric preparations of rat mesenteric small arteries.</a> Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 431, 794-796 (1996).</li><li>Khurana, S., Raina, H., Pappas, V., Raufman, J. P., Pallone, T. 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Autoren haben keine finanziellen Konflikte.

Kritischen Schritte, Fehlersuche und Änderungen In einem typischen isobaren Gefäß Vorbereitung wird die Arterie bei 70 mmHg zwischen zwei Glas Kanülen mit warmem (37 ° C) PSS perfundiert Druck gesetzt. Nach 30-45 min, Arterien entwickeln MT, gekennzeichnet durch spontane Abnahme des Durchmessers, die in 20-30 Minuten stabilisiert. Die Widerstandsarterien aus verschiedenen Gefäßbetten entwickeln variablen MT. Zum Beispiel Ratte Widerstand Mesenterialarterien entwickeln MT ~ 25% der PD, w?...

Kleinen Widerstand Arterien sind entscheidend für SVR und spielen eine wichtige Rolle in der Pathophysiologie von vielen Krankheiten 1,2. Erkrankungen wie Diabetes 3, Schwangerschaft 4, Ischämie-Reperfusion 5, Fettleibigkeit und Bluthochdruck 6,7 werden häufig mit veränderten Mikrogefäßfunktion. Vascular Myographie können nicht nur wichtige Erkenntnisse über Änderungen der mikrovaskulären Funktion bei verschiedenen Krankheiten, sondern auch dazu beitragen, therapeutische Ziele und bewerten die Wirksamkeit von vasoaktiven Verbindungen. Kreislauf-Funktion wurde unter Verwendung von isolierten kleinen Arterien unter isometrischen oder isobaren Bedingungen Gefäß 8 untersucht. Detaillierte Beschreibung der isometrischen Myographie anderswo 9 vorgesehen. Jedoch gibt es Unterschiede in den Daten aus isometrischen gegen isobaren Präparationen 10-12 erhalten. Da unter Druck Arterienpräparate erlauben die Untersuchung der mikrovaskulären Funktion in nahezu physiologischen Bedingungen, diegewonnenen Erkenntnisse können besser mit In-vivo-Verhalten der Gefäßbett 8,13 korrelieren. Im Jahr 1902 die Wirkung von transmuralen Druck zuerst beschrieben Bayliss auf Gefäßdurchmesser 14. Er beobachtete, in kleinen Widerstand Arterien von verschiedenen vaskulären Betten von Kaninchen, Katzen und Hunden, die eine Abnahme des Drucks wurde durch Vasodilatation gefolgt, und eine Zunahme der Druck wurde durch Vasokonstriktion gefolgt. Dieses Phänomen ist als myogenen Reaktion bekannt. Bayliss und nachfolgende Forscher festgestellt, dass in isobaren Bedingungen geringen Widerstand Arterien entwickeln nachhaltige Verengung als MT 15,16 bekannt. Sowohl myogenen Antwort und MT kann durch Verwendung von Druck Myographie (PM) -Verfahren bewertet. PM wird in erster Linie verwendet, um Vasoaktivität der kleinen Arterien, Venen und anderen Fahrzeugen zu bestimmen. Neben der Beurteilung der Wirkung von vasoaktiven Verbindungen auf Gefäßdurchmesser, PM - wie der Name sagt - wird verwendet, um intravaskuläre Druck-vermittelte ch bewertenanges auf Gefäßdurchmesser. In den letzten Jahrzehnten Fortschritte in der Computer-Software, die eine verbesserte Videomikroskopie und Glaspipette Ziehen, haben PM leichter durchzuführen hat. Jedoch bleibt Dissektion von lebensfähigem intaktem Segmente kleiner Blutgefäße mühsam und manchmal schwierig. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur myogenen Reaktion in kleinen mesenterialen Widerstandsarterien von Ratten isoliert studieren.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chemical</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Acetylcholine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A6625</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetra acetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3784</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M5162</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Phenylephrine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6126</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Potassium phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium bicarbonate (NaHCO3 )</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium nitroprusside</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>13451</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8574</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 1.</td>
		 </tr>
		 <tr>
		 <td></td>
		 <td></td>
		 <td></td>
		 <td>
 <table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Physiological salt solution (1000 ml)</td>
			<td> mM</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>KCl</td>
			<td>4.9</td>
			<td>0.365 g</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>112</td>
			<td>6.545 g</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MgSO4.7H2O</td>
			<td>1.2</td>
			<td>0.296 g</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>1.2</td>
			<td>0.163 g</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>11.5</td>
			<td>2.072 g</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>26</td>
			<td>2.184 g</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>10</td>
			<td>2.383 g</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>2</td>
			<td>2 ml (1M stock)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>De-ionized water</td>
			<td></td>
			<td>998 ml</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ca2+ free physiological salt solution (100 ml)</td>
			<td> mM</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>KCl</td>
			<td>4.9</td>
			<td>0.036 g</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>112</td>
			<td>0.645 g</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MgSO4.7H2O</td>
			<td>1.2</td>
			<td>0.029 g</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>1.2</td>
			<td>0.016 g</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>11.5</td>
			<td>0.207 g</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>26</td>
			<td>0.218 g</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>10</td>
			<td>0.238 g</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>EGTA </td>
			<td>0.39</td>
			<td>0.015 g</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium nitroprusside </td>
			<td>0.1</td>
			<td>0.0026 g</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>De-ionized water</td>
			<td></td>
			<td>100 ml</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dissection solution, stock (500 ml)</td>
			<td> mM</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>145</td>
			<td>21.18 g</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>KCl</td>
			<td>4.7</td>
			<td>0.875 g</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>1.2</td>
			<td>0.739 g</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>2</td>
			<td>1.049 g</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>0.02</td>
			<td>0.019 g</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>De-ionized water</td>
			<td></td>
			<td>500 ml</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Working dissection solution (100 ml)</td>
			<td> mM</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dissection solution stock</td>
			<td>20 ml</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>1.2</td>
			<td>0.091 g</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>5</td>
			<td>0.016 g</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>2</td>
			<td>0.022 g</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>2</td>
			<td>0.2 ml (1M stock)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>De-ionized water</td>
			<td></td>
			<td>79.8 ml</td>
		 </tr>
	 </tbody>
</table>
 </td>
	 </tr>
		 <tr>
		 <td></td>
		 <td></td>
		 <td></td>
		 <td>Table 2. Composition of Experimetnal solutions</td>
	 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>CCD Monochrome Camera</td>
			<td>The imaging Source</td>
			<td>DMK 21AU04</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Single inline solution heater</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0102</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Thermistor</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0108</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dual automatic temperature controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-344B</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Flaming/Brown micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments </td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fluorescence System Interface</td>
			<td>IonOptix</td>
			<td>model FSI-700</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Forceps and scissors </td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ion Wizard-Core and Analysis</td>
			<td>IonOptix</td>
			<td>Ion Wizard 6.0</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Laboratory tubing</td>
			<td>Silastic </td>
			<td>508-005</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Male Sprague Dawley rat</td>
			<td>Harlan Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Master flex console drive</td>
			<td>Cole-parmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Milli-Q Plus Ultrapure Water System</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ZD5211584</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ophthalmic monofilament nylon suture </td>
			<td>Ethicon </td>
			<td>9007G</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Photometry and Dimensioning Microscope</td>
			<td>Motic</td>
			<td>AE31</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pressure Servo Controller with peristaltic pump and pressure transducer</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>PS-200</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon Instruments Inc</td>
			<td>SMZ660</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Vessel Chamber</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>CH-1</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dissection dish</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>DD-90-S</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Thin Wall Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW120-6</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51550</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 3.</td>
		 </tr>
	 </tbody>
</table>

assessing myogenic response and vasoactivity in resistance mesenteric arteries using pressure myography

Geringen Widerstand Arterien verengen und zu dilatieren bzw. in Reaktion auf erhöhte oder verringerte intraluminale Druck; Dieses Phänomen, das als myogene Reaktion bekannt ist ein Schlüsselregulator der lokalen Durchblutung. In isobar kleinen Widerstand Arterien anhaltend in Verengung als myogene Tonus (MT), die eine wichtige Determinante für den systemischen Gefäßwiderstand (SVR) ist bekannt. Daher ex vivo unter Druck stehende Präparate von kleinen Widerstand Arterien sind wichtige Werkzeuge, um mikrovaskulären Funktion in nahezu physiologische Zustände zu studieren. Um dies zu erreichen, wird eine frisch isolierte intakte Segment eines kleinen Widerstandsader (Durchmesser ~ 260 &amp; mgr; m) auf beiden Glas Kanülen und unter Druck gelagert ist. Diese Arterienpräparate behalten die meisten in vivo Eigenschaften und Genehmigung Beurteilung der Gefäßtonus in Echtzeit. Hier bieten wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für die Beurteilung Vasoaktivität in Druck kleiner Widerstand Mesenterialarterien von Ratten; diese Arterien entwickelnpermanente Vasokonstriktion - etwa 25% des maximalen Durchmessers - wenn sie bei 70 mm Hg Druck. Diese arterielle Zubereitungen können verwendet werden, um die Wirkung der Verbindungen auf die experimentellen Verhältnis zwischen intra-arteriellen Blutdruck und Vasoaktivität untersuchen und zu bestimmen, Änderungen der mikrovaskulären Funktion in Tiermodellen von verschiedenen Krankheiten.

Schematische Darstellung eines typischen Druck Myographions Aufbau ist in Abbildung 1 dargestellt. Die beiden Enden des Schiffes sind mit einer Glasmikropipette kanüliert und mit Nähten auf beiden Seiten gesichert. Über eine Rohrleitung und einer offenen Absperrhahn wird eine Kanüle in eine servogesteuerte Druckregler verbunden ist; die andere Kanüle in einen geschlossenen Absperrhahn verbunden. Die Kammer ist mit PSS und Gefäßdurchmesser Änderungen werden durch ein umgekehrtes Mikroskop, um ein...

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Assessing Myogenic Response and Vasoactivity In Resistance Mesenteric Arteries Using Pressure Myography

Druck Myographie wird verwendet, um Vasoaktivität der kleinen Arterien, die anhaltende Verengung zu entwickeln, wenn unter Druck zu bewerten. Diese Handschrift ein detailliertes Protokoll, um in isolierten Segmenten der kleinen Mesenterialarterien von Ratten, Vasoaktivität und die Wirkung der intraluminale Druck auf die Gefäßdurchmesser zu bewerten.

Beurteilung Myogenic Antwort und Vasoaktivität In Resistance Mesenterialarterien Mit Druck Myographie

Small resistance arteries constrict and dilate respectively in response to increased or decreased intraluminal pressure; this phenomenon known as myogenic ...

assessing-myogenic-response-vasoactivity-resistance-mesenteric

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

16.7K Aufrufe.  Georgia Regents University.  Druck Myographie wird verwendet, um Vasoaktivität der kleinen Arterien, die anhaltende Verengung zu entwickeln, wenn unter Druck zu bewerten. Diese Handschrift ein detailliertes Protokoll, um in isolierten Segmenten der kleinen Mesenterialarterien von Ratten, Vasoaktivität und die Wirkung der intraluminale Druck auf die Gefäßdurchmesser zu bewerten. 

Serie: Assessing Myogenic Response and Vasoactivity In Resistance Mesenteric Arteries Using Pressure Myography

Mesenteric Artery Contraction and Relaxation Studies Using Automated Wire Myography

Proximal resistance vessels, such as the mesenteric arteries, contribute substantially to the peripheral resistance. These small vessels of between 100-400 &mu;m in diameter function primarily in directing blood flow to various organs according to the overall requirements of the body. The rat mesenteric artery has a diameter greater than 100 &mu;m. The myography technique, first described by Mulvay and Halpern1, was based on the method proposed by Bevan and Osher2. The technique provides information about small vessels under isometric conditions, where substantial shortening of the muscle preparation is prevented. Since force production and sensitivity of vessels to different agonists is dependent on the extent of stretch, according to active tension-length relation, it is essential to conduct contraction studies under isometric conditions to prevent compliance of the mounting wires. Stainless steel wires are preferred to tungsten wires because of oxidation of the latter, which affects recorded responses3.The technique allows for the comparison of agonist-induced contractions of mounted vessels to obtain evidence for normal function of vascular smooth muscle cell receptors.
We have shown in several studies that isolated mesenteric arteries that are contracted with phenylyephrine relax upon addition of cumulative concentrations of extracellular calcium (Ca2+e). The findings led us to conclude that perivascular sensory nerves, which express the G protein-coupled Ca2+-sensing receptor (CaR), mediate this vasorelaxation response. Using an automated wire myography method, we show here that mesenteric arteries from Wistar, Dahl salt-sensitive(DS) and Dahl salt-resistant (DR) rats respond differently to Ca2+e. Tissues from Wistar rats showed higher Ca2+-sensitivity compared to those from DR and DS. Reduced CaR expression in mesenteric arteries from DS rats correlates with reduced Ca2+e-induced relaxation of isolated, pre-contracted arteries. The data suggest that the CaR is required for relaxation of mesenteric arteries under increased adrenergic tone, as occurs in hypertension, and indicate an inherent defect in the CaR signaling pathway in Dahl animals, which is much more severe in DS.
The method is useful in determining vascular reactivity ex vivo in mesenteric resistance arteries and similar small blood vessels and comparisons between different agonists and/or antagonists can be easily and consistently assessed side-by-side6,7,8.

An automated myography method for force measurements in isolated mesenteric arteries is described. It employs a Mulvany-Halpern Auto Dual Wire Myograph 510A to determine responses to phenylephrine and extracellular calcium. The method allows consistent determination of isometric responses to agonists in small vessels of diameters of 60 - 300 &mu;m, independently.

A. mesenterica Kontraktion und Entspannung Studies Verwendung automatisierter Draht Myographie

Proximal resistance vessels, such as the mesenteric arteries, contribute substantially to the peripheral resistance. These small vessels of between ...

Forschung

Medizin

Epidural Intracranial Pressure Measurement in Rats Using a Fiber-optic Pressure Transducer

Elevated intracranial pressure (ICP) is a significant problem in several forms of ischemic brain injury including stroke, traumatic brain injury and cardiac arrest. This elevation may result in further neurological injury, in the form of transtentorial herniation1,2,3,4, midbrain compression, neurological deficit or increased cerebral infarct2,4. Current therapies are often inadequate to control elevated ICP in the clinical setting5,6,7 . Thus there is a need for accurate methods of ICP measurement in animal models to further our understanding of the basic mechanisms and to develop new treatments for elevated ICP.
In both the clinical and experimental setting ICP cannot be estimated without direct measurement. Several methods of ICP catheter insertion currently exist. Of these the intraventricular catheter has become the clinical 'gold standard' of ICP measurement in humans8. This method involves the partial removal of skull and the instrumentation of the catheter through brain tissue. Consequently, intraventricular catheters have an infection rate of 6-11%9. For this reason, subdural and epidural cannulations have become the preferred methods in animal models of ischemic injury. 
Various ICP measurement techniques have been adapted for animal models, and of these, fluid-filled telemetry catheters10 and solid state catheters are the most frequently used11,12,13,14,15. The fluid-filled systems are prone to developing air bubbles in the line, resulting in false ICP readings. Solid state probes avoid this problem (Figure 1). An additional problem is fitting catheters under the skull or into the ventricles without causing any brain injury that might alter the experimental outcomes. Therefore, we have developed a method that places an ICP catheter contiguous with the epidural space, but avoids the need to insert it between skull and brain. 
An optic fibre pressure catheter (420LP, SAMBA Sensors, Sweden) was used to measure ICP at the epidural location because the location of the pressure sensor (at the very tip of the catheter) was found to produce a high fidelity ICP signal in this model. There are other manufacturers of similar optic fibre technologies13 that may be used with our methodology. Alternative solid state catheters, which have the pressure sensor located at the side of the catheter tip, would not be appropriate for this model as the signal would be dampened by the presence of the monitoring screw. 
Here, we present a relatively simple and accurate method to measure ICP. This method can be used across a wide range of ICP related animal models.

A novel technique to record the pressures within the skull is described. The minimally invasive method uses a fibre-optic pressure sensing system to accurately measure intracranial pressure (ICP) in anaesthetized rats without causing significant brain trauma. The technique may be used in a wide range of experimental models.

Epidurale Intrakranielle Druckmessung in Ratten mit einem LWL-Druckaufnehmer

Elevated intracranial pressure (ICP) is a significant problem in several forms of ischemic brain injury including stroke, traumatic brain injury and ...

Assessing Teratogenic Changes in a Zebrafish Model of Fetal Alcohol Exposure

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, including mental retardation due to disordered and damaged brain development. Fetal alcohol spectrum disorder (FASD) is a term used to cover a continuum of birth defects that occur due to maternal alcohol consumption, and occurs in approximately 4% of children born in the United States. With 50% of child-bearing age women reporting consumption of alcohol, and half of all pregnancies being unplanned, unintentional exposure is a continuing issue2. In order to best understand the damage produced by ethanol, plus produce a model with which to test potential interventions, we developed a model of developmental ethanol exposure using the zebrafish embryo. Zebrafish are ideal for this kind of teratogen study3-8. Each pair lays hundreds of eggs, which can then be collected without harming the adult fish. The zebrafish embryo is transparent and can be readily imaged with any number of stains. Analysis of these embryos after exposure to ethanol at different doses and times of duration and application shows that the gross developmental defects produced by ethanol are consistent with the human birth defect. Described here are the basic techniques used to study and manipulate the zebrafish FAS model.

In order to understand the molecular mechanisms of the ethanol-induced developmental damage, we have developed a zebrafish model of ethanol exposure and are exploring the physical, cellular, and genetic alterations that occur after ethanol exposure1. We then seek to find potential interventions and rapidly test them in this animal model.

Die Beurteilung Teratogene Änderungen in einem Zebrafisch-Modell der Fetal Alcohol Exposure

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, ...

Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that system. Changes in blood flow to the small intestine can result in effects on the absorptive functions of the organ. Particular interest in toxins liberated from feedstuffs through fermentative and digestive processes has developed in ruminants as an area where productive efficiencies could be improved. The video associated with this article describes an in vitro bioassay developed to screen compounds for vasoactivity in isolated cross-sections of bovine mesenteric artery and vein using a multimyograph. Once the blood vessels are mounted and equilibrated in the myograph, the bioassay itself can be used: as a screening tool to evaluate the contractile response or vasoactivity of compounds of interest; determine the presence of receptor types by pharmacologically targeting receptors with specific agonists; determine the role of a receptor with the presence of one or more antagonists; or determine potential interactions of compounds of interest with antagonists. Through all of this, data are collected real-time, tissue collected from a single animal can be exposed to a large number of different experimental treatments (an in vitro advantage), and represents vasculature on either side of the capillary bed to provide an accurate picture of what could be happening in the afferent and efferent blood supply supporting the small intestine.

The small intestine is frequently exposed to toxins that can influence blood flow and negatively impact nutrient absorption. Using a multimyograph and mesenteric artery and vein isolates, compounds or toxins of interest can be screened for vasoactivity.

Isolierung und Verwendung von Rinder Abschnitte A. und V. mesenterica als Bioassay für Vasoaktivität im Dünndarm Testen

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. Despite the discovery of key regulators of uterine contractility, this process is still not fully understood. Transgenic mice provide an ideal model in which to study parturition. Previously, the only method to study uterine contractility in the mouse was ex vivo isometric tension recordings, which are suboptimal for several reasons. The uterus must be removed from its physiological environment, a limited time course of investigation is possible, and the mice must be sacrificed. The recent development of radiometric telemetry has allowed for longitudinal, real-time measurements of in vivo intrauterine pressure in mice. Here, the implantation of an intrauterine telemeter to measure pressure changes in the mouse uterus from mid-pregnancy until delivery is described. By comparing differences in pressures between wild type and transgenic mice, the physiological impact of a gene of interest can be elucidated. This technique should expedite the development of therapeutics used to treat myometrial disorders during pregnancy, including preterm labor.

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

This manuscript provides a protocol for implanting telemeters in the mouse for the purpose of measuring intrauterine pressures during pregnancy.

Intrauterine Telemetrie zur Maus Kontraktionsdruck messen<em&gt; In-vivo-</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Trabecular Meshwork Response to Pressure Elevation in the Living Human Eye

The mechanical characteristics of the trabecular meshwork (TM) are linked to outflow resistance and intraocular pressure (IOP) regulation. The rationale behind this technique is the direct observation of the mechanical response of the TM to acute IOP elevation. Prior to scanning, IOP is measured at baseline and during IOP elevation. The limbus is scanned by spectral-domain optical coherence tomography at baseline and during IOP elevation (ophthalmodynamometer (ODM) applied at 30 g force). Scans are processed to enhance visualization of the aqueous humor outflow pathway using ImageJ. Vascular landmarks are used to identify corresponding locations in baseline and IOP elevation scan volumes. Schlemm canal (SC) cross-sectional area (SC-CSA) and SC length from anterior to posterior along its long axis are measured manually at 10 locations within a 1 mm segment of SC. Mean inner to outer wall distance (short axis length) is calculated as the area of SC divided by its long axis length. To examine the contribution of adjacent tissues to the effect IOP elevations, measurements are repeated without and with smooth muscle relaxation with instillation of tropicamide. TM migration into SC is resisted by TM stiffness, but is enhanced by the support of its attachment to adjacent smooth muscle within the ciliary body. This technique is the first to measure the living human TM response to pressure elevation in situ under physiological conditions within the human eye.

Trabecular meshwork (TM) migration into Schlemm&#8217;s canal space can be induced by acute pressure elevation by ophthalmodynamometer, and observed by spectral domain optical coherence tomography. The goal of this method is to quantify the morphometric response of the living outflow tract to acute pressure elevation in living tissues in situ.

Trabekelnetzwerk Reaktion auf den Druck in der Elevation Wohnzimmer Menschliches Auge

The mechanical characteristics of the trabecular meshwork (TM) are linked to outflow resistance and intraocular pressure (IOP) regulation. The rationale ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study vasculogenesis, (tumor) angiogenesis, and atherosclerosis. The current standard for in vitro research on human endothelial cells (ECs) is the use of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and Human Umbilical Artery Endothelial Cells (HUAECs). For canine endothelial research, only one cell line (CnAOEC) is available, which is derived from canine aortic endothelium. Although currently not completely understood, there is a difference between ECs originating from either arteries or veins. For a more direct approach to in vitro functionality studies on ECs, we describe a new method for isolating Canine Primary Endothelial Cells (CaPECs) from a variety of vessels. This technique reduces the chance of contamination with fast-growing cells such as fibroblasts and smooth muscle cells, a problem that is common in standard isolation methods such as flushing the vessel with enzymatic solutions or mincing the vessel prior to digestion of the tissue containing all cells. The technique we describe was optimized for the canine model, but can easily be utilized in other species such as human.

Novel isolation methods of primary endothelial cells from blood vessels are needed. This protocol describes a new technique that completely inverts blood vessels of interest, exposing only the endothelial side to enzymatic digestion. The resulting pure endothelial cell culture can be used to study cardiovascular diseases, disease modelling, and angiogenesis.

Isolierung und Kultur von primären Endothelzellen von Canine Arterien und der

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant CFTR channel in subjects with cystic fibrosis (CF). Identification of subjects that may benefit from these drugs is challenging because of the extensive heterogeneity of CFTR mutations, as well as other unknown factors that contribute to individual drug efficacy. Here, we describe a simple and relatively rapid assay for measuring individual CFTR function and response to CFTR modulators in vitro. Three dimensional (3D) epithelial organoids are grown from rectal biopsies in standard organoid medium. Once established, the organoids can be bio-banked for future analysis. For the assay, 30-80 organoids are seeded in 96-well plates in basement membrane matrix and are then exposed to drugs. One day later, the organoids are stained with calcein green, and forskolin-induced swelling is monitored by confocal live cell microscopy at 37 &#176;C. Forskolin-induced swelling is fully CFTR-dependent and is sufficiently sensitive and precise to allow for discrimination between the drug responses of individuals with different and even identical CFTR mutations. In vitro swell responses correlate with the clinical response to therapy. This assay provides a cost-effective approach for the identification of drug-responsive individuals, independent of their CFTR mutations. It may also be instrumental in the development of future CFTR modulators.

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

This protocol describes an assay for measuring CFTR function and CFTR modulator responses in cultured tissue from subjects with cystic fibrosis (CF). Biopsy-derived intestinal organoids swell in a cAMP-driven fashion, a response that is defective (or strongly reduced) in CF organoids and can be restored by exposure to CFTR modulators.

Forskolin-induzierte Quellung in Intestinale Organoide: Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Assay für Fibrosis Patienten in Cystic Drug Response-Beurteilung

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Laparoscopic Technique for Serial Collection of Liver and Mesenteric Lymph Nodes in Macaques

The mesenteric lymph nodes (MLN) and the liver are exposed to microbes and microbial products from the gastrointestinal (GI) tract, making them immunologically unique. The GI tract and associated MLN are sites of early viral replication in human immunodeficiency virus (HIV) infection and the MLN are likely important reservoir sites that harbor latently-infected cells even after prolonged antiretroviral therapy (ART). The liver has been shown to play a significant role in immune responses to lentiviruses and appears to play a significant role in clearance of virus from circulation. Nonhuman primate (NHP) models for HIV and Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS) closely mimic these aspects of HIV infection and serial longitudinal sampling of primary sites of viral replication and the associated immune responses in this model will help to elucidate critical events in infection, pathogenesis, and the impact of various intervention strategies on these events. Current published techniques to sample liver and MLN together involve major surgery and/or necropsy, which limits the ability to investigate these important sites in a serial fashion in the same animal. We have previously described a laparoscopic technique for collection of MLN. Here, we describe a minimally invasive laparoscopic technique for serial longitudinal sampling of liver and MLN through the same two port locations required for the collection of MLN. The use of the same two ports minimizes the impact to the animals as no additional incisions are required. This technique can be used with increased sampling frequency compared to major abdominal surgery and reduces the potential for surgical complications and associated local and systemic inflammatory responses that could complicate interpretation of results. This procedure has potential to facilitate studies involving NHP models while improving animal welfare.

Here, we describe a minimally invasive laparoscopic technique for serial sampling of liver and mesenteric lymph nodes (MLN) in macaques that allows for increased sampling frequency, and reduces the potential for surgical complications when compared to performing a laparotomy.

Die laparoskopische Technik zur Serien Sammlung von Leber und mesenterischen Lymphknoten in Makaken

The mesenteric lymph nodes (MLN) and the liver are exposed to microbes and microbial products from the gastrointestinal (GI) tract, making them ...

A Cell Culture Model of Resistance Arteries

The myoendothelial junction (MEJ), a unique signaling microdomain in small diameter resistance arteries, exhibits localization of specific proteins and signaling processes that can control vascular tone and blood pressure. As it is a projection from either the endothelial or smooth muscle cell, and due to its small size (on average, an area of ~1 &#181;m2), the MEJ is difficult to study in isolation. However, we have developed a cell culture model called the vascular cell co-culture (VCCC) that allows for in vitro MEJ formation, endothelial cell polarization, and dissection of signaling proteins and processes in the vascular wall of resistance arteries. The VCCC has a multitude of applications and can be adapted to suit different cell types. The model consists of two cell types grown on opposite sides of a filter with 0.4 &#181;m pores in which the in vitro MEJs can form. Here we describe how to create the VCCC via plating of cells and isolation of endothelial, MEJ, and smooth muscle fractions, which can then be used for protein isolation or activity assays. The filter with intact cell layers can be fixed, embedded, and sectioned for immunofluorescent analysis. Importantly, many of the discoveries from this model have been confirmed using intact resistance arteries, underscoring its physiological relevance.

A cell culture model of resistance arteries is described, allowing for the dissection of signaling pathways in endothelium, smooth muscle, or between endothelium and smooth muscle (the myoendothelial junction). The selective application of agonists or protein isolation, electron microscopy, or immunofluorescence can be utilized using this cell culture model.

Eine Kultur Zellmodell der Widerstand Arterien

The myoendothelial junction (MEJ), a unique signaling microdomain in small diameter resistance arteries, exhibits localization of specific proteins and ...