Das Ziel dieses Films ist es, das Verfahren unseres neuen Ansatzes für Patientinnen mit Ovarialfunktionsstörungen zu demonstrieren. Die Eierstockfunktion nimmt während des Alterns und einiger pathophysiologischer Zustände, einschließlich Karyotyp-Anomalien, Autoimmunerkrankungen, Chemo- und Strahlentherapien sowie Eierstockoperationen, progressiv ab. Die meisten Frauen mittleren Alters mit einer niedrigen ovariellen Reserve zeigten eine schlechte ovarielle Reaktion auf die Stimulation der Eierstöcke, um reife Eizellen hervorzurufen.
Darüber hinaus zeigten junge Patientinnen mit einer geringen Anzahl von Antralfollikeln auch eine schlechte ovarielle Reaktion auf die Stimulation der Eierstöcke. Die Erhaltung der Fruchtbarkeit ist wichtig, um das potenzielle OCS für zukünftige Schwangerschaften zu speichern. Zur Erhaltung der Fruchtbarkeit wurde die Kryokonservierung von Eizellen eingerichtet.
Diese Patientinnen mit schlechter Ovarialreaktion konnten jedoch auch nach richtiger Stimulation der Eierstöcke eine sehr begrenzte Anzahl von Eizellen abrufen, was zu wiederholten teuren Verfahren führte, um eine ausreichende Anzahl von Eizellen zu gewährleisten, um ein Baby zu garantieren. Um diese Probleme zu lösen, haben wir kürzlich das In-vitro-Aktivierungsverfahren IVA entwickelt, mit dem wir das frühstadium der Eierstockfollikel stimulieren können, um sich zum präantralen Follikelstadium zu entwickeln. Das ursprüngliche IVA-Verfahren kann das primordiale, primäre und sekundäre Follikelwachstum durch Fragmentierung des Eierstockkortex fördern, was zu einer Störung der Nilpferdsignalübertragung führt.
Es folgen zwei Tage Kultivierung mit Akt Signalstimulator. Dieses Verfahren ist für POI-Patienten mit wenigen Restfollikeln geeignet. Dieses Verfahren ist jedoch eine übermäßige Behandlung für patienten mit mehreren sekundären follikeln.
Für die Patienten, die einige verbleibende sekundäre Follikel haben, haben wir die Methode namens medikamentenfreie IVA etabliert und bereits die Möglichkeit getestet, das sekundäre Follikelwachstum zu fördern, indem nur der Hippo-Signalweg gestört wird. Wir hatten auch einige erfolgreiche Fälle von Verabreichung durch medikamentenfreie IVA. Wir haben bereits den chirurgischen Eingriff der medikamentenfreien IVA und das Protokoll der folgenden ovariellen Stimulation veröffentlicht.
In diesem Video stellen wir die Details der Labormethoden vor, die für eine medikamentenfreie IVA erforderlich sind. Wir rekrutierten die Patienten für eine medikamentenfreie IVA auf der Grundlage der Bologna-Kriterien. Die Patienten könnten mehrere sekundäre Follikel haben.
Zunächst wurde ein Teil des Kortex durch Laparoskopie aus einem oder beiden Eierstöcken entfernt. POR-Patienten sind diejenigen, die mittelgroße Eierstöcke hatten. Bei den meisten Patientinnen extrahierten wir nur einen Teil des kortikalen Gewebes ein- oder beidseitig aus den Eierstöcken.
Extrahiertes kritisches Gewebe wurde sofort in eine Kulturschale mit Kulturmedium mit HEPES-Puffer übertragen und dieses kleine Gewebe in kleine Würfel zerlegt, um die Signalstörung von Flusspferden zu stören. Details zum Verfahren werden in diesem Video gezeigt. Der Hippo-Signalweg ist unerlässlich, um eine optimale Organgröße aufrechtzuerhalten.
Dieser Weg besteht aus mehreren negativen Wachstumsregulatoren. Sobald die Hippo-Signalisierung gestört ist, wird der Phosphorylierungsspiegel von YAP, einem der negativen Wachstumsregulatoren, die in einer Kinasekaskade wirken, verringert und der nukleare YAP-Spiegel erhöht. YAP wirkt in Zusammenarbeit mit TEAD-Transkriptionsfaktoren, um den nachgelagerten CCN-Wachstumsfaktor zu erhöhen.
Auf der anderen Seite ist die Aktinpolymerisation von kugelförmig wirkendem G-Aktin zur filamentösen Form, F-Aktin, wichtig für die Aufrechterhaltung der Zellform und die Fortbewegung. Zuvor berichtete Induktion der F-Aktin-Bildung stört die Hippo-Signalübertragung und induziert Überwucherung in menschlichen HeLa-Zellen. Wir berichteten bereits, dass die Ovarialfragmentierung die F-Aktinbildung erhöht und zur Abnahme des Phosphorylierungsniveaus von YAP führt.
Es führt zu einer erhöhten Expression des CCN-Wachstumsfaktors. Nach dem Schneiden werden diese Würfel in den verbleibenden Eierstock gepfropft. Dieses Verfahren kann das verbleibende sekundäre Follikelwachstum fördern und zu einer erhöhten Anzahl von reifen Eizellen führen.
Die drogenfreie IVA besteht aus vier Schritten. Wir haben bereits das chirurgische Verfahren für medikamentenfreie IVA veröffentlicht. Bitte beachten Sie diese Literatur für die Extraktion des Ovarialkortex und die automatische Transplantation.
Hier zeigen wir die detaillierten Verfahren der Labormethoden, die für eine medikamentenfreie IVA erforderlich sind. Im ersten Schritt zeigen wir, wie die Fragmentierung des Eierstockkortex durchgeführt wird. In Schritt zwei zeigen wir, wie man die kortikalen Eierstockwürfel zur Transplantation in das Gerät lädt, Hier werde ich die Fragmentierung des Ovarialkortex zeigen.
Diese Studie wurde von der Ethikkommission unseres Instituts genehmigt und alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem Ethikkodex des Weltärztebundes durchgeführt. Fragmentierung des Ovarialkortex. Die folgenden Werkzeuge sind für diesen Schritt erforderlich: eine Schale, sterile Gaze, eine feine Schere, eine feine Zette und ein Skalpell.
Normalerweise verwenden wir diese Art von Schüssel und sterile Gaze, aber auch andere Produkte wie Petrischale aus Kunststoff, Glasschale usw. können für dieses Verfahren geeignet sein, und jede Art von steriler Gaze ist ebenfalls geeignet. Wir empfehlen jedoch dringend die Verwendung dieser Form von Zette und Skalpell. Verwenden Sie außerdem die Kochplatte, um die Temperatur des Geschirrs mit Taschentüchern aufrechtzuerhalten Legen Sie es unter den sterilen Vorhang.
Kortikales Gewebe wird sofort in die Schale übertragen, die mHTF enthält. Machen Sie ein Bild mit dem Namen des Patienten, um es mit den Daten des Patienten zu korrelieren. Notieren Sie die Größe, Dicke und den Zustand des Gewebes.
Entfernen Sie restliches Medulla-Gewebe. Vor der Gewebefragmentierung das Medulla-Gewebe entfernen. Legen Sie den Kortex auf die sterile Gaze.
Wie im Video gezeigt, ist die Gaze mit Medium befeuchtet. Tragen Sie während dieses Verfahrens das Medium mit einer Einwegpipette auf, bevor die Oberfläche des Kortex ausgetrocknet ist. Restgewebe mit einer Mikroschere entfernen, bis die Dicke ein bis zwei Millimeter erreicht.
Bei POR-Patienten befinden sich sekundäre Follikel tiefer als einen Millimeter von der Kortexoberfläche entfernt, so dass die Gewebe nicht weniger als einen Millimeter dick sind. Schneiden Sie eine Seite des Kortex jedes Gewebes in einen Streifen, der einen mal fünf Millimeter misst, um histologische Analysen durchzuführen, um das Vorhandensein von Restfollikeln zu bestimmen. Diesen Streifen in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen mit Kulturmedium geben und bis zur Fixierung bei vier Grad Celsius aufbewahren.
Vorbereitung von kortikalen Eierstockwürfeln. Nach der Entfernung von Medulla-Gewebe wird der kortikale Eierstock für eine Störung der Nilpferdsignalisierung fragmentiert. Schneiden Sie den Kortex zunächst mit einem Skalpell in einen nach dem anderen mal 10 Millimeter großen Streifen.
Dann schneiden Sie diese Streifen in einen Millimeter gewürfelte kleine Würfel. Im Medium ist das Gewebe rutschig und schwer zu schneiden. Für ein einfaches Schneiden schneiden Sie die Streifen, indem Sie auf das Skalpell drücken, anstatt daran zu ziehen.
Zählen Sie nach dem Schneiden die Anzahl der Würfel und bereiten Sie die automatische Veredelung vor. Um die Veränderungen des osmotischen Drucks im Medium zu vermeiden, fügen Sie das Medium in Maßen hinzu, bevor Sie das Gewebe automatisch transplantieren. Für die automatische Transplantation von Eierstöcken ermöglicht die Verwendung eines kanülenförmigen Geräts eine einfachere Beladung.
Dieser Schritt besteht aus zwei Schritten. Zuvor wurden Eierstockfragmente nacheinander mit einer Zette unter Laparoskopie transplantiert. Es dauerte jedoch etwa drei bis vier Stunden, bis die Operation abgeschlossen war.
Bei diesem Verfahren verwenden wir ein kanpuläres Gerät aus einer Innenspritze und einem Außenzylinder. Dies ist eine einfache Form und leicht. Darüber hinaus hat die Spitze dieses Geräts eine runde Form.
Es gibt keine scharfen Punkte, die Schäden an der Transplantationsstelle vermeiden. Die Verwendung dieser Art von Gerät ermöglicht es, bis zu 20 bis 30 Würfel gleichzeitig zur Implantationsstelle zu bringen. Dies führt zu einer effizienten Transplantation und Verkürzung der Operationszeit.
Laden von kortikalen Fragmenten der Eierstöcke. Vorbereitung von IVA-Kanüle. Bereiten Sie die IVA-Kanüle vor und waschen Sie dieses Gerät in mHTF.
Wiederholen Sie das Absaug- und Austragsmedium mehrmals. Füllen Sie die Spitze eines Kanpuliers, indem Sie etwa 100 Mikroliter des Mediums absaugen. Dadurch soll vermieden werden, dass sich die Würfel während der Beladung von Gewebefragmenten herausziehen.
Laden kortikaler Würfel. Wählen Sie einen Würfel mit einer feinen Zette und legen Sie ihn in die Spitze des Kanstells. Die Anzahl der automatisch transplantierten Würfel hängt von der Größe der Transplantationsstelle ab.
Wiederholen Sie das Laden der Cubes nacheinander, bis Sie die Zielzahl erreicht haben. Nachdem Sie die Würfel geladen haben, geben Sie die Kanüle vorsichtig an den Chirurgen weiter. Wenn die Transplantatstelle nicht fertig ist, ist der Teil des Kanpuliers, der Eierstockwürfel enthält, mit den Fingern zu berühren, um eine Abnahme der Temperatur der Würfel zu vermeiden.
Wir haben bereits über die klinischen Ergebnisse der medikamentenfreien IVA berichtet. Bitte beachten Sie das veröffentlichte Papier über klinische Ergebnisse. Dieses Laborprotokoll benötigte für einen Patienten 30 bis 50 Minuten.
Die durchschnittliche Zeit beträgt 10 bis 20 Minuten für die Fragmentierung des Eierstockkortex und 20 bis 30 Minuten für das Laden dieser Fragmente in die IVA-Kanüle. Dies hängt von der Gewebegröße ab, aber fast alle Patienten können in dieser durchschnittlichen Zeit fertig sein. Schlüsse. Die medikamentenfreie IVA ist ein neuer Ansatz der Unfruchtbarkeitsbehandlung für POR-Patientinnen mit abnehmender ovarieller Reserve.
Dieses Laborprotokoll führt sowohl zur Reduzierung der für die Operation erforderlichen Zeit als auch des Verlusts von Fragmenten während der Transplantation. Die Labortechnik der medikamentenfreien IVA könnte die Grundlage für die zukünftige Anwendung der Eierstockgewebekultur werden, um reife Eizellen ohne Transplantation zu erhalten.
