Dieses mikroskopische Erweiterungsprotokoll ermöglicht es dem Forscher, glomeruläre Proteine mit nanoskaliger Auflösung auf einem herkömmlichen Mikroskop zu visualisieren. Der Hauptvorteil der Erweiterungsmikroskopie besteht darin, dass sie für eine große Forschungsgemeinschaft zugänglich ist. Beginnen Sie damit, Abstandshalter für die Gelationskammer herzustellen.
Schneiden Sie Nummer eins und Nummer 1,5 Glasabdeckung rutscht in fünf Millimeter Streifen, mit einem Diamantmesser. Legen Sie eine Glasrutsche in eine Färbekammer und positionieren Sie die Zahl 1,5-Abdeckungsstreifen auf der Glasrutsche, so dass sie ein Quadrat von 2,5 Zentimetern bilden. Pipette ein Tröpfchen von doppelt destilliertem Wasser in die Ecken des Quadrats, um die Glasabdeckung Rutschen Streifen zueinander und auf die Glasrutsche zu haften.
Warten Sie ca. 20 Minuten, damit die Abdeckungsbelege der Nummer 1,5 stabil befestigt sind. Pipette ein Tröpfchen Wasser auf jeder Zahl 1.5 Abdeckung Slip Streifen. Legen Sie vier Glasabdeckungsstreifen Nummer eins auf die Nummer 1.5-Abdeckungsslips.
Für den Gelationskammerdeckel ein Deckglas mit Paraffinfolie wickeln, um Falten oder Schmutz auf der Folie zu vermeiden. Für die Verankerungsbehandlung, entfernen Sie PBS aus den immungefärbten Zellen und fügen Sie 250 Mikroliter Ankerpuffer pro Brunnen direkt auf die Glasabdeckung Schlupf. Inkubieren Sie die Platte für drei Stunden bei Raumtemperatur.
Halten Sie das Substrat im Dunkeln mit einer Box. Nach der Inkubation den Verankerungspuffer entfernen und den Deckelschlupf einmal mit 1,5 Milliliter PBS pro Brunnen waschen. Um Aktinfasern zu färben, tauen Sie eine EXM-kompatible Phalloidin-Lösung auf und inkubieren Sie sie 45 Minuten bei Raumtemperatur.
In der Zwischenzeit Natriumacrylat in doppelt destilliertem Wasser mit einem Rührgerät auflösen und die Monomerlösung auf Eis vorbereiten. Entfernen Sie Phalloidin aus den Zellen und waschen Sie sie mit 1,5 Milliliter PBS, zweimal, bei Raumtemperatur. Lassen Sie 1,5 Milliliter PBS im Brunnen nach der letzten Wäsche.
Verwenden Sie Zange und eine Kanüle, um den Deckelglasschlupf von der sechs Brunnenplatte zu heben und in die Gelationskammer zu legen. Fügen Sie APS der Gelierlösung hinzu und wirbeln Sie kurz. Pipette 200 Mikroliter Gelierlösung auf der Probe und vorsichtig schließen Sie die Kammer, Luftblasen innerhalb des Geles zu vermeiden.
Fügen Sie Wasser in die Färbekammer, und bebrüten Sie die Färbekammer für mindestens eine Stunde bei 37 Grad Celsius, um das Gel zu polymerisieren. Nehmen Sie die Färbekammer aus dem Inkubator. Um den Gelationskammerdeckel zu öffnen, führen Sie eine Rasierklinge zwischen Deckel und Abstandshalter ein und entfernen Sie den Deckel vorsichtig.
Entfernen Sie die Abstandshalter mit der Rasierklinge und schneiden Sie alle zusätzlichen Gel ab. Verwenden Sie einen Pinsel, um die Ränder des Gels zu lösen. Setzen Sie die Folie mit dem Gel und Deckenglas in eine Schale mit PBS gefüllt.
Dann entfernen Sie das abgetrennte Deckglas aus dem Gel, indem Sie es sanft schütteln. Setzen Sie die Folie unter das Gel, um das Gel an der Folie zu befestigen. Mit dem Gel auf der Folie, teilen Sie das Gel in kleine Stücke mit der Rasierklinge.
Drücken Sie vorsichtig ein Stück Gel in einen Brunnen einer sechs Brunnenplatte mit einem Glasboden und entfalten Sie es mit einem Pinsel. Verwenden Sie den Pinsel, um das Gel mit einer kleinen Menge PBS mit Feuchtigkeit zu befeuchten. Nehmen Sie mit einem invertierten Mikroskop Übersichtsbilder mit niedriger numerischer Blende für Vorerweiterungsbilder auf.
Proteinase K auf vier Einheiten pro Milliliter im Verdauungspuffer verdünnen, um die Verdauungslösung herzustellen. Fügen Sie 500 Mikroliter der Verdauungslösung zu jedem Brunnen hinzu und tauchen Sie das Gel in die Lösung ein. Lassen Sie es über Nacht bei Raumtemperatur mit geschlossenem Deckel verdauen, um die Proben im Dunkeln zu halten.
Entfernen Sie die Verdauungslösung mit einer Pipette und entsorgen Sie sie. Fügen Sie einen Milliliter doppelt destilliertes Wasser hinzu und inkubieren Sie das eingetauchte Gel 10 Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie das Wasser und fügen Sie einen Milliliter frisches, doppelt destilliertes Wasser hinzu.
Tauschen Sie das Wasser alle 10 Minuten weiter, bis ein Plateau der Ausdehnung erreicht ist, wodurch das Gel optisch klar wird. Entfernen Sie das Wasser aus dem Gel und beginnen Sie sofort mit der Mikroskopie. Verwenden Sie ein invertiertes Mikroskop, verwenden Sie ein Luftobjektiv bei geringer Vergrößerung, um Zellen im Zustand vor der Ausdehnung zu finden.
Wechseln Sie zu 40 X und 63 X Objektiven für eine bessere Auflösung. Erregen Sie mit der Wellenlänge des Interesses und nehmen Sie das Bild über die Kamera. Dieses EXM-Protokoll ermöglicht eine Erweiterung um das Vierfache.
Um den Expansionsfaktor zu bestimmen, ist es wichtig, Zellen vor und nach der Expansion abzubilden. Unzureichende Verankerung und Homogenisierung können zu Verzerrungen und Brüchen der Zellen führen. Repräsentative Beispiele für gebrochene Zellen werden hier gezeigt.
Diese Methode kann verwendet werden, um die Kolokalisierung von F-Actin- und Actin-Adapterproteinen wie Podocin und Nephrin zu untersuchen. Podocin ist in Grün, Actin in Blau und Nephrin in Rot dargestellt. Weiße Bereiche weisen auf die Kolokalisierung hin.
Die fluoreszierende Signalintensität und Fülle sind der Schlüssel für ein erfolgreiches EXM. Eine effiziente Verankerung der Fluoreszenzfarbstoffe über ACX ist für dieses Protokoll von entscheidender Bedeutung. In unseren Händen ist solubilized ACX gut für bis zu drei bis vier Monate.
