Das wachsende Interesse am Studium großer, multizellulärer Strukturen führte zur Entwicklung dieser optischen Clearing-Technik, die eine dreidimensionale Visualisierung und Quantifizierung großer Strukturen innerhalb transparenter Organe ermöglicht. Dieses Protokoll bietet ein einfaches, kostengünstiges, einfach einzurichtendes und umfassendes Werkzeug zur Untersuchung von Gewebe in drei Dimensionen. Die vielschichtige Natur einer Krankheit kann nicht immer mit traditionellen zweidimensionalen Techniken simuliert werden.
Die dreidimensionale Analyse von Gewebe kann helfen, Krankheiten besser zu diagnostizieren und zu überwachen. Diese Methode ist nicht auf Nierengewebe beschränkt und kann auf jedes normale und kranke Gewebe angewendet werden. Dieses einfache Protokoll ist für jeden Wissenschaftler mit etwas Erfahrung im Umgang mit Tieren einfach zu befolgen.
Es ist wichtig, verschiedene Antikörper bei schlechter Antikörperkennzeichnung zu testen und nur sekundäre Antikörperkontrollen durchzuführen. Beginnen Sie mit der Zubereitung von Heparin mit PBS und 3,0% Paraformaldehyd in 1X PBS gemäß den Manuskriptrichtungen und übertragen Sie die Lösungen in separate 50 ml Kunststoffspritzen. Paraformaldehyd ist giftig und sollte in der Dunstabzugshaube hergestellt werden.
Sammeln und überziehen Sie die Niere nach den Manuskriptanweisungen. Dann entfernen Sie die Kapsel und schneiden Sie die Niere in ein mm dicke koronale Scheiben. Die Nierenscheiben mit der vorbereiteten Paraformaldehydlösung in ein 15 ml konisches Rohr eintauchen.
Nach der Fixierung die Nierenscheibe zweimal mit 1X Waschpuffer für eine Stunde auf einer horizontalen Wippe waschen und dann mit Antigen-Retrieval fortfahren. Erhitzen Sie 300 ml 1X Antigen-Entlarmungslösung in einem 500 ml Becher. Dann eine Nierenscheibe in eine einbettbare Einbettkassette einschließen, die in den erhitzten Puffer durchlässig ist, und eine Stunde bei 92 bis 98 Grad Celsius umrühren.
Es ist wichtig, die Temperatur zwischen 92 und 98 Grad Celsius für diesen Antigen-Retrieval-Schritt stabil zu halten. Dann die Scheibe in 10 ml 1X Waschpuffer mit 0.1%Triton X-100 übertragen und über Nacht schaukeln. Am nächsten Tag die Scheibe zweimal mit 10 ml frischem 1X Waschpuffer für eine Stunde waschen.
Verdünnen Sie den primären Antikörper in 500 Mikroliter normales Antikörperverdünnungsmittel. Die Nierenscheibe in verdünntem Primärantikörper vier Tage lang bei 37 Grad Celsius sanft schaukeln. Nach der Inkubation die Nierenscheibe in 10 ml 1X Waschpuffer über Nacht bei Raumtemperatur waschen und den Puffer einmal nach acht Stunden wechseln.
Die sekundären Antikörper in 500 Mikroliter normaler Antikörperverdünnung verdünnen und vier Tage lang bei 37 Grad Celsius mit der Nierenscheibe bebrüten. Bitte beachten Sie, dass die Nierenscheibe von diesem Schritt an vor Licht geschützt werden sollte. Nach der Inkubation mit sekundären Antikörpern die Nierenscheibe in 10 ml 1X Waschpuffer über Nacht bei Raumtemperatur waschen.
Um die Nierenscheibe zu dehydrieren, übertragen Sie sie auf fünf ml hochwertiges 100%Ethanol und schaukeln Sie es für zwei Stunden bei Raumtemperatur, erfrischen Sie das Ethanol nach einer Stunde. Die Nierenscheibe in zwei ml Ethyl-Cinnamat eintauchen und über Nacht sanft schaukeln. Wenn Sie bereit sind, das Gewebe abzubilden, fügen Sie 600 bis 1000 Mikroliter Ethyl-Cinnamate in eine Glasbodenschale ein und geben Sie die Nierenscheibe in die Schale.
Legen Sie einen runden Deckelschlupf auf die Nierenscheibe und versiegeln Sie die Schale mit Paraffinfolie. Legen Sie die Schale auf die Mikroskop-Bildplattform und stellen Sie das Gewebe entsprechend den Manuskriptanweisungen ab. Dieses Protokoll wurde verwendet, um erfolgreich 3D-Analysen auf Nierengewebe durchzuführen und Zellfunktionen und Wechselwirkungen auszuwerten.
Die Methode kann fluoreszierende Reporter abschrecken verursachen, aber andere starke fluoreszierende Proteine können Signalabschreckung widerstehen. Abdominale Aortenfülle kann die Antikörperdiffusion verbessern. In einigen Fällen führt eine schlechte Antikörperdurchdringung zu einem oberflächlichen Signal.
Dies kann mit höheren Konzentrationen oder nachauffüllung von Antikörpern korrigiert werden. Die intravaskuläre Abgabe sollte in Betracht gezogen werden, wenn das Antigen von Interesse in der Nierenvaskulatur ausgedrückt wird. Antikörper, die auf Proteine in der apikalen Membran von Tubuleepithelzellen abzielen, überschreiten jedoch nicht die glomeruläre Filtrationsbarriere und verursachen unspezifische Signale.
Das Gewebe kann mit den Antikörpern beschriftet werden, um eine bestimmte Zellpopulation zu erkennen oder ganze Tubulesegmente zu visualisieren. Darüber hinaus kann die Kolokalisierung von Proteinen in 3D durch die Kombination mehrerer Antikörper erreicht werden. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Antikörperkennzeichnung mit guter Nierenfülle, der Verwendung von Antigen-Retrieval-Schritt und einer hohen Antikörperkonzentration verbessert werden kann.
Einige starke Reporterproteine können dem Abschrecken von Fluoreszenzsignalen nach diesem Protokoll widerstehen. Um dies zu testen, überspringen Sie die Antigen-Retrieval- und Antikörper-Etikettierungsschritte. Diese Technik respektiert die dreidimensionale Natur von Strukturen und eröffnet viele neue Forschungsbereiche.
Es eliminiert die erforderlichen Annahmen und Interferenzen, die mit der traditionellen zweidimensionalen Analyse verbunden sind.
