In diesem Protokoll werden drei Methoden beschrieben: Sammeln von korbikulären Pollen mit Pollenfallen, Sortieren von Pollen nach Farbe und Acetolyse. Diese Methoden werden häufig in Studien im Zusammenhang mit Bestäubern verwendet, wie Bestäubungseffizienz, Bestäuber-Nahrungsdynamik sowie Ernährungsqualität und -vielfalt. Pollenfang ist eine einfache Möglichkeit, große Mengen an Pollen von Honigbienenvölkern zu sammeln.
Die Sortierung von Pollenpellets nach Farbe ist eine erschwingliche Methode zur Klassifizierung von Pollen, die wenig Fachwissen erfordert, und die Acetolyse ermöglicht die Identifizierung des Pflanzentaxons, das mit jeder Pelletfarbe verbunden ist. Ellen Topitzhofer, wissenschaftliche Mitarbeiterin der Fakultät, und Emily Carson, eine wissenschaftliche Mitarbeiterin aus meinem Labor, demonstrieren das Verfahren. Bestimmen Sie zunächst, wann Pollen vom gewünschten Imkereistandort eingefangen werden sollen, und wählen Sie die optimalen Honigbienenvölker zum Einfangen von Pollen aus.
Bewerten Sie die Stärke der Kolonien, indem Sie die Sammler zählen, die zwei Minuten lang zum Kolonieeingang zurückkehren, und wählen Sie dann die Kolonien mit der höchsten Gesamtzahl der zurückkehrenden Sammler aus. Wählen Sie Bienenstöcke mit Holzwaren, die sich in gutem Zustand befinden, vorzugsweise ohne zusätzliche Eingänge und verzogene Deckel. Verwenden Sie Völker mit weniger alternativen Eingängen, da Sammlerbienen, die zu solchen Kolonien zurückkehren, sich eher zum Falleneingang umorientieren.
Wählen Sie nach Möglichkeit nach Süden ausgerichtete Bienenstockeingänge. Wenn Bienenstöcke palettiert werden, installieren Sie Pollenfallen auf jeder Kolonie, die auf einer bestimmten Palette in die gleiche Richtung zeigt, um das Abdriften von Sammlern in benachbarte Bienenstockeingänge zu vermeiden. Falls gewünscht, beurteilen Sie das Brutnest der Kolonie, indem Sie Rahmen auf das Vorhandensein von Larven untersuchen und Kolonien mit relativ großen Mengen an Larven auswählen.
Als nächstes installieren Sie Pollenfallen auf den ausgewählten Honigbienenvölkern. Bei Fallen an der Vorderseite befestigen Sie die Falle vor dem Eingang mit Klammern, Schrauben und Klebeband oder verbinden Sie die Falle mit Bungee-Kabeln, die um den Bienenstock gewickelt sind. Versiegeln Sie alle anderen möglichen Eingänge in die Kolonie mit einem nicht klebenden und formbaren Material wie Latex- oder Polyurethanschaum oder einem Hardwaretuch Nummer acht für Schneckenlöcher.
Verwenden Sie Klebeband für kleine Risse. Wenn Sie Fallen für die Frontmontage verwenden, die sich auf bodennahen Bienenstöcken befinden, platzieren Sie eine Barriere wie eine Gummimatte zwischen dem Sammelkorb und dem Gras, um Feuchtigkeitsschäden durch den Tau zu vermeiden. Aktivieren Sie den Fangmechanismus der Pollenfalle 24 Stunden nach der Installation und vor Beginn des Tagesflugs auf Nahrungssuche.
Sammeln Sie korbikulären Pollen aus der Auffangschale und legen Sie ihn in Plastikbeutel oder Zentrifugenröhrchen, dann lagern Sie ihn in einem Kühler mit Eis. Verwenden Sie die Schaufel oder einen großen Löffel, um 10 Gramm Pollen als repräsentative Teilprobe herauszuschöpfen. Entfernen Sie alle Bienenteile und Ablagerungen aus der Teilprobe und sortieren Sie dann jedes Pollenpellet aus der 10-Gramm-Unterprobe in eine Farbgruppe, wobei sowohl Pollenfarbe als auch Textur verwendet werden, um zwischen Gruppen zu unterscheiden.
Um mindestens 0,25 Gramm jeder Farbgruppe für nachgeschaltete Schritte zu gewährleisten, platzieren Sie alle Pellets, die nicht ausreichend sind, um eine Farbgruppe von mindestens 0,25 Gramm zu bilden, in eine verschiedene Gruppe. Benennen Sie jede einzelne Farbgruppe mithilfe des Pantone-Farbleitfadens. Wiegen Sie 0,25 Gramm Pollenpellets aus jeder Farbgruppe.
Legen Sie die entsprechende PSA an. Dann fügen Sie langsam 500 Mikroliter Eissäure zu jedem Mikrozentrifugenröhrchen hinzu, das 0,25 Gramm Farbgruppenpollen enthält. Während Sie die Röhre visuell untersuchen, rühren Sie den Pollen 10 bis 15 Sekunden lang mit einem sauberen Zahnstocher um.
Zentrifugieren Sie die Probe drei Minuten lang bei 1 100 mal G und dekantieren Sie dann den Überstand in das saure Abfallbecherglas. Um die Acetolysemischung herzustellen, fügen Sie 10,8 Milliliter Eissäure in die mit Becherglas markierte Acetolysemischung hinzu. Dann fügen Sie langsam 1.200 Mikroliter konzentrierte Schwefelsäure aus der Stammlösung hinzu.
Fügen Sie langsam 1.000 Mikroliter Acetolysemischung in jedes Röhrchen hinzu und rühren Sie mit einem sauberen Zahnstocher für 10 bis 15 Sekunden um. Legen Sie die Proben auf einen auf 80 Grad Celsius vorgeheizten Hitzeblock. Inkubieren Sie die Röhrchen fünf Minuten lang und rühren Sie jedes Röhrchen gründlich mit einem sauberen Zahnstocher nach der Hälfte der Inkubation.
Nach der Inkubation langsam 500 Mikroliter Eisessig in jedes Röhrchen geben und mit einem sauberen Zahnstocher 10 bis 15 Sekunden umrühren. Zentrifugieren Sie die Proben, dann dekantieren Sie den Überstand aus jedem Röhrchen in das saure Abfallbecherglas. Spülen Sie jede Probe dreimal mit Wasser ab, indem Sie 1.000 Mikroliter destilliertes Wasser in jedes Röhrchen geben und mit einem sauberen Zahnstocher rühren.
Zentrifugieren Sie die Proben und dekantieren Sie den Überstand aus den Röhrchen in das Becherglas aus Natriumbicarbonat. Wiederholen Sie dann die Wasserspülungen noch zweimal. Fügen Sie 1.000 Mikroliter 95% Ethanol aus dem Ethanolbecher zu jeder Tube hinzu und rühren Sie mit einem sauberen Zahnstocher um.
Dann zentrifugieren Sie die Proben und dekantieren Sie den Überstand aus den Röhrchen in das Ethanol-Abfallbecherglas. Mischen Sie die Safranin-O-Flecken-Stammlösung und fügen Sie 5 bis 10 Tropfen zu jeder Tube hinzu. Rühren Sie mit einem Zahnstocher für 10 bis 15 Sekunden um und lassen Sie den Zahnstocher in der Röhre.
Fügen Sie 1.000 Mikroliter 95% Ethanol aus dem Ethanolbecher in jedes Röhrchen und rühren Sie um. Nach dem Zentrifugieren der Proben wird der Überstand in das Ethanol-Abfallbecherglas dekantiert. Fügen Sie 10 bis 15 Tropfen Glycerin zu jeder Tube hinzu und rühren Sie den Inhalt für 10 bis 15 Sekunden um.
Lassen Sie die Röhrchen im Abzug offen, um das Ethanol mindestens zwei Stunden lang bei Raumtemperatur zu verdampfen. Etikettenmikroskop-Objektträger zur Pollenidentifikation. Entfernen Sie einen Tropfen Pollenreste aus einem Röhrchen und legen Sie ihn in die Mitte des beschrifteten Objektträgers, damit sich der Tropfen leicht ausbreiten kann.
Legen Sie einen sauberen Abdeckschein über den Tropfen auf den Objektträger und versiegeln Sie den Abdeckschein mit klarem Nagellack auf dem Objektträger. Mit den beschriebenen Methoden wurden korbikuläre Pollen gesammelt, nach Farbe sortiert und die Pflanzenquellen jeder Pelletfarbgruppe identifiziert, um die Pollendiversität zu bewerten. Jede Pollensammelprobe hatte mehrere unterscheidbare Farbgruppen.
In einigen Proben enthielten Pollenfarbgruppen nur vier bis fünf Pellets. Die meisten Gruppen hatten jedoch signifikant mehr und dienten als eigene markierte Farbgruppe für die Acetolyse. Nach der Acetolyse wurde die Hellfeldlichtmikroskopie verwendet, um jede Farbgruppe effektiv bis zu ihrem niedrigsten taxonomischen Rang zu identifizieren, indem die morphologischen Merkmale mit denen von Belegproben aus der Umgebung jedes Studienzentrums bestätigt wurden.
Der Pollen, der von Mandelkulturstandorten gesammelt wurde, hatte eine relativ geringere Pollenvielfalt als Pollen, die von anderen Kulturen gesammelt wurden, mit durchschnittlich drei Pelletfarben in 3,2 Pflanzentaxa pro Standort Sortierter Pollen kann auf Pestizide getestet werden, um die Agrochemikalien auf Honigbienenfutterpflanzen aufzuklären, oder auf chemische Zusammensetzung analysiert werden, um seinen Nährwert für Honigbienen zu bestimmen. Die Ergebnisse dieser Forschung lieferten wertvolle Einblicke in die Artenvielfalt, die in Pollen beobachtet wurde, die von Kolonien gesammelt wurden, und unterstreichen die wesentlich geringe Vielfalt von Pollen, die in Mandelanbausystemen gesammelt werden.
