Diese Forschung wurde von Grant 105AS-13.2.3-BQ-B1 aus dem Bureau of Tier- und Pflanzengesundheit Inspektion und Quarantäne, der Rat für Landwirtschaft, Exekutiv-Yuan und Grant 103-2313-B-197-002-MY3 vom Ministerium unterstützt für Wissenschaft und Technologie (MOST).

1. Vorbereitungen <ol><li> Machen 1 L 50% Zuckersirup. Man löst 1 kg Saccharose in 1 l ddH 2 O. </li><li> Bereiten Pyriproxyfen (PPN) -Lösung in BLD. Make 1,1 L von 10.000 ppm PPN - Stammlösung und verdünnte 100 ml PPN - Lösung in 1 l sterilisierten ddH 2 O. Lagerung bei 4 ° C. </li><li> Verdünne die PPN-Stammlösung auf Endkonzentrationen von 0,1, 1, 10 und 100 mg / kg (ppm) in dem BLD für das folgende Experiment. </li><li> Machen PPN-Sirup (für die Kolonie-Ebene). Verdünne die PPN Lager auf Endkonzentrationen von 10 und 100 ppm in 50% Zuckersirup für das folgende Experiment. </li><li> Honigbienenhaltung. Hinweis: Hier ist die experimentelle Lage ist die National Ilan University (NIU) Imkerei, Yi-Lan City, Taiwan; (GPS - Koordinaten: N24.747278, E121.746200). <ol><li> Überprüfen Honigbiene (Apis mellifera L.) für die Lebensmittelmenge wöchentlich Kolonien und Futtermittel mit 1 Liter 50% Zuckersirup , falls erforderlich (der Honig - Speicherbereich ist leer). Definieren Sie eine gesundeKolonie als 9 Bilder von Bienenwaben in jeder Kolonie mit einem Queen-Eier normalerweise legen. </li></ol></li><li> Bereiten Sie 100 ml Grund Larvaldiät (BLD). Man löst 6% D-glucose, 6% Fructose und 1% Hefeextrakt in sterilisiertem destilliertem deionisiertem Wasser (ddH 2 O) und ergänzt mit 50% Gelee royale. Lagerung bei 4 ° C, jedoch nicht länger als 3 Tage. Hinweis: Pre-warm bis 35 ° C vor dem Experiment und innerhalb von 3 Tagen haben. </li></ol> 2. In - vivo - Fütterungsmethode Hinweis: In - vivo - Fütterungsmethode wurde von Hanley et al modifiziert. 20 <ol><li> Honigbienenlarven Auswahl und Kennzeichnung. <ol><li> Legen Sie eine Königin excluder 9 Rahmen einer gesunden Kolonie in 4 Rahmen und 5 Rahmen zu unterteilen, während die Königin zu dem Rahmenprofil 4 zu begrenzen. Verlassen mindestens einen leeren Rahmen in dem Rahmenteil 4 zur Eiablage. </li><li> Nachdem die Königin Eier für 1 Tag VerlegungÜberprüfen, den Rahmen für das Auftreten von Eiern und halten Sie die Eier in den Bienenstöcken für 72 h (4. Tag) bis zum 1. Tag alten Larven schlüpfen. Nehmen Sie einen der Rahmen, die 1-Tage alten Arbeiterinnenlarven (innerhalb von 24 h schraffiert) aus dem Testbienenstock von Hand und entfernen Sie die Honigbiene Arbeiter aus dem Rahmen mit einer Biene Pinsel. </li><li> Bedecken den Rahmen mit einer transparenten Rutsche (Size = Länge x Breite x Dicke = 29,7 mm x 21 mm x 0,1 mm) und Nagel die transparente Folie auf dem Rande des Rahmen mit thumbtacks (1A). </li><li> Für jede Behandlung wählen zufällig 50 1 Tag alten Larven (4. Tag) und jede Brutzelle unter Verwendung von Permanentmarker Stifte auf dem transparenten Schieber (1A und 1B) markieren. Hinweis: Schreiben Sie die Informationen jeder Behandlung auf dem Rahmen und transparente Folie als auch durch Permanentmarker Stifte mit der Verwirrung zwischen den verschiedenen Behandlungen zu vermeiden. Entfernen Sie die markierten Folien und halten für die in vivo &lt;/ Em&gt; Fütterung und Beobachtung. </li></ol></li><li> In - vivo - Zuführung. <ol><li> Fügen unterschiedliche Konzentrationen von PPN-BLD (0,1, 1, 10 und 100 ppm) zu jeder markierten Brutzelle durch Pipettieren am Tag 1, 2 und 3 mit 10 ul, 10 ul und 20 ul, das jeweils entsprechend den Ansaugmenge der Larven Alter. Fügen Sie die gleiche Menge an BLD (kein PPN) zu einer Kontrollgruppe. Dadurch reichert sich die Gesamtdosis von PPN-BLD in jeder markierten Brutzelle bis 4, 40, 400 und 4000 pg. HINWEIS: Erkennen Sie die markierten Brutzellen durch die markierten transparenten Folien und entfernen Sie die markierten transparenten Folien nach der Fütterung. Verwenden Sie frische BLD zum Zuführen der Reinigung der Brutzellen von den Arbeiterinnen zu verhindern. </li><li> Bringen Sie die PPN-behandelten Rahmen auf die ursprünglichen Kolonien für weitere Beobachtungen. HINWEIS: Jede Behandlung hat vier biologische Wiederholungen in vier Kolonien. </li></ol></li><li> Die Beobachtung der behandelten Larven am Tag 7. <ol><li> Zu beobachten the PPN-behandelten Larven, kehren die markierten transparenten Folien an den Rahmen die Sterblichkeit und Verschließmaschinen Raten in den markierten Brutzellen zu erfassen. </li></ol></li><li> Die Beobachtung der behandelten Puppen und Schlüpfen Raten am Tag 13. <ol><li> Entfernen Sie das Bienenwachs gedeckelter Brutzellen. </li><li> Setzen Sie die weiche kippte Pinzette in Brutzelle und klemmen die Puppen sehr leicht dann Puppen nehmen vorsichtig aus. </li><li> Übertragen der Puppen in 24-Well-Gewebekulturplatten mit einer Doppelschicht von Laborgewebe unterhalb jeder Vertiefung. Notieren Sie sich den Schaden und Mortalität während pupal Übertragung. </li><li> Halten Sie die 24-Well - Gewebekulturplatten in einem Inkubator bei 34 ° C und 70% relative Luftfeuchtigkeit , bis Auftauchen (ca. 8 Tage). </li><li> Bitte beachten und die Puppen und tauchte Honigbienen aufzunehmen. </li></ol></li><li> Statistiken <ol><li> Berechnen Sie die aufgezeichneten Daten und Gegenwart als Mittelwert ± SD </li><li> Analysieren der Daten unter Verwendung der Varianzanalyse (ANOVA) durch SAS und verwenden den niedrigstwertige Unterschied (LSD) -Test die Unterschiede zwischen zwei mittels verschiedener Behandlungen zu analysieren. Definieren statistisch signifikant als P - Wert &lt;0,05. Verschiedene Buchstaben in der gleichen Spalte der Tabelle zeigten einen signifikanten Effekt, der durch die statistische Analyse. </li></ol></li></ol> 3. Toxizität von PPN bei Colony Ebene in Beehive <ol><li> Stellen Sie die Honigbiene Gruppen auf. <ol><li> Senkrecht eine Königin excluder 9 Frames eines gesunden Kolonie in 4 Rahmen (Teil A) und 5-Rahmen (Teil B) zu unterteilen, während die Königin zu dem Rahmenprofil 4 zu begrenzen. Verläßt mindestens einen leeren Rahmen in dem 4-Rahmenprofil für die Eiablage. Hinweis: Legen Sie eine andere Königin EXCLUDER die auf der Oberseite der Königin Teil der Königin zu verhindern, zwischen den Teilen bewegt. </li><li> Nachdem die Königin Eier für 1 Tag legt, überprüfen Sie den Rahmen für das Auftreten von Eiern. Nehmen Sie die entsprechenden Rahmen Eier aus Teil A von Hand enthält, und entfernen Sie die Honigbiene Arbeitervon dem Rahmen mit einer Biene Bürste. </li><li> Bedecken den Rahmen mit transparenter Rutsche und Nagel die transparente Folie in der Kante des Rahmens mit Reißzwecken. </li><li> wählen zufall 100 Brutzellen Eier und markieren jede Brutzelle unter Verwendung von Permanent-Marker auf der transparenten Folie enthalten. Ordnen diese 100 Brutzellen als Gruppe 1, die Information von jeder Behandlung auf dem Rahmen und transparente Objektträger unter Verwendung von Permanent-Marker schreiben die Verwirrung zwischen den verschiedenen Behandlungen zu vermeiden. </li><li> Bringen Sie den markierten Rahmen zu Teil A für 3 Tage und dann übertragen die Königin zu Teil B, Eier zu legen. </li><li> Nach 1 Tag, überprüfen die Rahmen von Teil B, einen geeigneten Rahmen wählen und 100 Brutzellen enthaltende Eier Etikett als in Schritt 3.1.4 beschrieben. Ordnet diese 100 Brutzellen als Gruppe 2. </li><li> Bringen Sie den markierten Rahmen zu Teil B für 3 Tage und dann die Königin übertragen, um ein Teil Eier zu legen. </li><li> Wiederholen Sie die Königin Austausch zwischen Teil A und Teil B 6 weitere Male, und weisen Gruppen numerisch,jeweils (Abbildung 2). Es sollte von 9 Gruppen insgesamt sein. </li></ol></li><li> T reat Honigbienenvolk mit PPN Zuckersirup am Tag 13 (Abbildung 2). <ol><li> 1 L 50% PPN Zuckersirup, der 10 oder 100 ppm in einem Kunststoffbienenbeschickungskasten (W x L x H = 20 cm x 30 cm x 3,5 cm) und setzen den Kasten oben auf den Rahmen in den experimentellen Kolonien. Hinweis: Gruppe 1 nicht die PPN erhält an 13 Tagen, da die Brutzellen versiegelt wurden. </li><li> Futtermittel die Kontrollgruppe mit 1 L 50% Zuckersirup (kein PPN), wie in Schritt 2.2 beschrieben. </li></ol></li><li> Anzahl 1 Tage alte Larven und Aufzeichnung als die Bruteies Rate von 100 markierten Brutzellen für jede Gruppe am Tag 5 (Abbildung 2). Honigbiene Eier nehmen normalerweise 3 Tage in 0 Tagen Larven zu schlüpfen; Deshalb überprüfen und 5 für jede Gruppe am Tag 100 Eier haltigen Brutzellen am Tag 1 und zählen die Anzahl von 1 Tag alter Larven bezeichnen den Prozentsatz der Schlupfrate zu erhalten. </li><li> Count die verkappten Brutzellen und Aufzeichnung als die Larven- Capping Rate von 100 markierten Brutzellen für jede Gruppe an Tag 11 (Abbildung 2). 6 bis 7 Tage alten Larvenbrutzellen werden mit Bienenwachs von Honigbienenlarven Arbeiter für Verpuppung begrenzt. </li><li> Beobachten Puppen Reifung und notieren Sie die eclosion Rate von 100 markierten Brutzellen für jede Gruppe an Tag 17 (Abbildung 2). <ol><li> Entfernen Sie das Bienenwachs gedeckelter Brutzellen und nehmen Puppen aus mit weichen Spitzen versehenen Pinzette vorsichtig. Übertragen der Puppen in einer 24-Well-Gewebekulturplatten mit einer Doppelschicht von Laborgewebe unterhalb jeder Vertiefung. </li><li> Halten Sie die 24-Well-Gewebekulturplatten in einem Inkubator bei 34 ° C und 70% RH bis zum Auftauchen. </li><li> Bitte beachten und notieren Sie die Puppen und tauchte Honigbienen für jede Gruppe bis Gruppe 9 (49 Versuchstagen). Hinweis: Jede Behandlung hat vier biologische wiederholt. </li></ol></li><li> Statistiken <ol><li> Berechnen Sie die aufgezeichneten Daten und Gegenwart als Mittelwert± SD. </li><li> Analysiert die signifikanten Unterschiede zwischen Paaren von Behandlungen (zB 0 ppm / 10 ppm, 10 ppm / 100 ppm und 0 ppm / 100 ppm) in jeder Gruppe durch den Zwei-tailed t - Test nach Student verwendet. Definieren Sie als statistisch signifikant , wenn P - Wert &lt;0,05. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Die Königin begrenzte Eiablage Methode und Queen-Austauschverfahren sind wichtige Schritte zur Einstellung innerhalb dieses Protokolls Honigbiene Gruppen für den Feldtest auf. Die Königin begrenzte Eiablage Verfahren ermöglicht die Synchronisation des Lebenszyklus von Honigbienen. Folglich können die Forscher wählen Sie 1 Tage alte Larven der gleichen Altersgruppe für die Behandlung mit verschiedenen Dosen des Pestizids. Für die Königin-Austauschverfahren wurde die Königin zwischen Teil A (4 Rahmen) und B (5 F...

Das Vorhandensein von Pestiziden in der Umwelt ist eines der gravierendsten Probleme , die Auswirkungen auf das Leben einer Honigbiene 1, 2, 3. Mehrere Studien haben die gemeinsame Präsenz von Pestizidrückständen in Bienenvölkern und Bienenprodukten unter Beweis gestellt. In Taiwan war die durchschnittliche Anwendung von Pestiziden 11-12 kg / ha pro Jahr (2005-2013). Die Menge an Pestiziden in Taiwan verwendet wird , ist höher als die der EU - Länder und die lateinamerikanischen Länder 4, 5. Mit anderen Worten, leidet die Bienenzucht Umwelt ernst Pestizid Stress, vor allem in Taiwan und möglicherweise in anderen Ländern. Die Honigbiene Apis mellifera ist eine der wichtigsten Bestäuber in landwirtschaftlichen Systemen 6 und produziert auch wertvolle Produkte wie Honig. Expos jedoch Honigbienen sinded auf verschiedene Pestizide und diese Pestizide können nach Nahrungssuche auf Blumen zu beehives zurückgebracht werden , die mit Pestiziden besprüht wurden , wenn 7 Nektar und Pollen zu sammeln, 8. Sie können auch durch die Imker Pestizide ausgesetzt werden , sich Schädlingsprobleme zu steuern das Ziel, innerhalb der Nesselsucht 9, 10, 11. Da Honigbienenlarven von Ammenbienen gefüttert werden für ihre Entwicklung, Larven, Drohnen und sogar die Königin kann 12 dieser Pestizid-kontaminierten Nektare und Pollen ausgesetzt werden. Die Toxizität von verschiedenen Pestiziden Honigbienen muss 13 angesprochen werden. Viele Anstrengungen wurden unternommen, um die Probleme der Umweltpestizidrückstände zu bewerten. Yang et al. den Einfluss des neurotoxischen Insektizid Imidacloprid auf der Entwicklung von Honigbienenlarven getestet in derBienenstock und berichtet , dass eine subletale Dosis von Imidacloprid in olfaktorischen assoziativen Verhalten der erwachsenen Bienen ergab 14. Auch Urlacher et al. die subletale Wirkungen eines Organophosphat - Pestizid geprüft, Chlorpyrifos, auf einer Lernleistung der Honigbiene Arbeiter unter Laborbedingungen 15. In unserer früheren Studie haben wir die Auswirkungen eines Insektenwachstumsregulator (IGR), Pyriproxyfen (PPN), auf Larvenhonigbienen 16. In diesem Beitrag stellen wir Methoden für die chemischen Auswirkungen auf die Entwicklung von Honigbienen zu bewerten. Honigbiene Fütterungsmethoden wurden beschrieben und angewandt, um entweder einzelne Honigbienen oder zu einer Kolonie. Zunächst testeten wir verschiedene Konzentrationen von Pestiziden kontaminierte Grundlarvenfutter (BLD) auf Larven in den Kolonien , die Auswirkungen des Pestizids auf einzelne Honigbienen in vivo zu bewerten. Wir gingen dann die natürliche condit zu simulierenIonen des Pestizids durch pestizid kontaminierten Sirup des beehives verwenden. Bei diesem Verfahren wird PPN, die weit gegen Schadinsekten verwendet wird , 17 und sind schädlich für die Entwicklung von Honigbienenlarven und Puppen 16, 18, 19, wird ein Indikator sein , um die negative Wirkung des Pestizids auf dem Gebiet darstellen.

<table><tbody><tr><td>Honey bee box</td><td>SAN-YI Honey Factory</td><td>W1266</td><td>Honeybees rearing</td></tr><tr><td>Queen excluder (between frames)</td><td>SAN-YI Honey Factory</td><td>I1575</td><td>Queen limitation&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Queen excluder (on top)</td><td>SAN-YI Honey Factory</td><td>I1566</td><td>Queen limitation on top&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Bee brush</td><td>SAN-YI Honey Factory, Taiwan</td><td>W1414</td><td>clean the bees on frame gently</td></tr><tr><td>Bee feeder</td><td>SAN-YI Honey Factory, Taiwan</td><td>P0219</td><td>feed sugar syrup to colony</td></tr><tr><td>Transparent slide</td><td>Wan-Shih-Chei, Taiwan (http://www.mbsc.com.tw/a01goods.asp?s_id=40)</td><td>1139</td><td>Mark the larval area on the frames (Material: Polyethylene Terephthalate, PET) (Size = Length*Width*thick = 29.7 mm * 21 mm * 0.1 mm)</td></tr><tr><td>24 well tissu culture plate</td><td>Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd</td><td>TCP011024</td><td>Rearing pupae from extraction</td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Tomin medical equipmenco., LTD.</td><td>TM-321</td><td>Make sterilized distilled deionized water (ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td></tr><tr><td>P20 pipetman</td><td>Gilson</td><td>F123600</td><td>Add PPN into bee larval food pool</td></tr><tr><td>Incubator&amp;nbsp;</td><td>Yihder Co., Ltd.</td><td>LE-550RD</td><td>Rearing pupae from extraction</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>COW LUNG INSTRUMENT CO., LTD</td><td>KCS34155</td><td>Rearing pupae from extraction</td></tr><tr><td>Royal jelly</td><td>National Ilan University (NIU)</td><td>NIU</td><td>Make basic larval diet (BLD)</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td>Make basic larval diet (BLD)</td></tr><tr><td>D-(-)-Fructose</td><td>Sigma</td><td>F0127</td><td>Make basic larval diet (BLD)</td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>CONDA, pronadisa</td><td>1702</td><td>Make basic larval diet (BLD)</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Taiwan sugar coporation</td><td>E01071010</td><td>Make sugar syrup for bee food</td></tr><tr><td>Pyriproxyfen (11%)</td><td>LIH-NUNG CHEMICAL CO.. LTD.</td><td>Registration No. 1937</td><td>Insect growth regulator (IGR) used in the experiment</td></tr></tbody></table>

evaluating the effect of environmental chemicals on honey bee development from the individual to colony level

The presence of pesticides in the beekeeping environment is one of the most serious problems that impacts the life of a honey bee. Pesticides can be brought back to the beehive after the bees have foraged on flowers that have been sprayed with pesticides. Pesticide contaminated food can be exchanged between workers which then feed larvae and therefore can potentially affect the development of honey bees. Thus, residual pesticides in the environment can become a chronic damaging factor to honey bee populations and gradually lead to colony collapse. In the presented protocol, honey bee feeding methods are described and applied to either an individual honey bee or to a colony. Here, the insect growth regulator (IGR) pyriproxyfen (PPN), which is widely used to control pest insects and is harmful to the development of honey bee larvae and pupae, is used as the pesticide. The presenting procedure can be applied to other potentially harmful chemicals or honeybee pathogens for further studies.

Für die Honigbiene Feldtest wurde eine Königin auf den für Eiablage 4-Rahmenabschnitt begrenzt. Dieser Schritt könnte die Brutdichte in einem Rahmen erhöhen und nachfolgende Beobachtungen erleichtern. Jede Behandlung wurde markiert, und die Entwicklung in den Honigbienen wurde eindeutig durch ein transparentes Dia beobachtet. In - vivo - Zufuhr von PPN-BLD auf Honigbienenlarven in dem Bienenstock wurde durchgeführt , um genau den Einfluss von PPN auf der Entwicklu...

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Evaluating the Effect of Environmental Chemicals on Honey Bee Development from the Individual to Colony Level

Hier präsentieren wir ein Verfahren Pestizid kontaminierte Lebensmittel sowohl mit einer einzelnen Honigbiene und einer Bienenkolonie zu ernähren. Das Verfahren bewertet die Pestizid Auswirkungen auf die einzelnen Honigbienen durch in - vivo - Zufuhr von basischen Larven Ernährung und auch auf den natürlichen Zustand der Bienenkolonie.

Die Bewertung der Wirkung von Umweltchemikalien auf Honig-Bienen-Entwicklung von der Person zu Colony Ebene

The presence of pesticides in the beekeeping environment is one of the most serious problems that impacts the life of a honey bee. Pesticides can be ...

evaluating-effect-environmental-chemicals-on-honey-bee-development

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Environment

9.0K Aufrufe.  National Ilan University.  Hier präsentieren wir ein Verfahren Pestizid kontaminierte Lebensmittel sowohl mit einer einzelnen Honigbiene und einer Bienenkolonie zu ernähren. Das Verfahren bewertet die Pestizid Auswirkungen auf die einzelnen Honigbienen durch in - vivo - Zufuhr von basischen Larven Ernährung und auch auf den natürlichen Zustand der Bienenkolonie. 

Serie: Evaluating the Effect of Environmental Chemicals on Honey Bee Development from the Individual to Colony Level

Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA libraries are needed for optimal results from next-generation sequencing. Environmental samples such as water may have low quality and quantities of DNA as well as contaminants that co-precipitate with DNA. The mechanical and enzymatic processes involved in extraction and library preparation may further damage the DNA. Gel size selection enables purification and recovery of DNA fragments of a defined size for sequencing applications. Nevertheless, this task is one of the most time-consuming steps in the DNA library preparation workflow. The protocol described here enables complete automation of agarose gel loading, electrophoretic analysis, and recovery of targeted DNA fragments. 
In this study, we describe a high-throughput approach to prepare high quality DNA libraries from freshwater samples that can be applied also to other environmental samples. We used an indirect approach to concentrate bacterial cells from environmental freshwater samples; DNA was extracted using a commercially available DNA extraction kit, and DNA libraries were prepared using a commercial transposon-based protocol. DNA fragments of 500 to 800 bp were gel size selected using Ranger Technology, an automated electrophoresis workstation. Sequencing of the size-selected DNA libraries demonstrated significant improvements to read length and quality of the sequencing reads.

This manuscript describes an automated gel size selection approach for purifying DNA fragments for next-generation sequencing. The Ranger Technology provides complete automation of the entire process of agarose gel loading, electrophoretic analysis, and recovery of targeted DNA fragments allowing for high-throughput and high quality next-generation sequencing libraries.

Automatisierte Gel Größenauswahl, um die Qualität der nächsten Generation Sequencing Libraries von Umweltwasserproben vorbereitet verbessern

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA ...

Forschung

Umwelt

Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered &#34;bee-safe,&#34; there is mounting evidence that fungicide residues in pollen are associated with bee declines (for both honey and bumble bee species). While the mechanisms remain relatively unknown, researchers have speculated that bee-microbe symbioses are involved. Microbes play a pivotal role in the preservation and/or processing of pollen, which serves as nutrition for larval bees. By altering the microbial community, it is likely that fungicides disrupt these microbe-mediated services, and thereby compromise bee health. This manuscript describes the protocols used to investigate the indirect mechanism(s) by which fungicides may be causing colony decline. Cage experiments exposing bees to fungicide-treated flowers have already provided the first evidence that fungicides cause profound colony losses in a native bumble bee (Bombus impatiens). Using field-relevant doses of fungicides, a series of experiments have been developed to provide a finer description of microbial community dynamics of fungicide-exposed pollen. Shifts in the structural composition of fungal and bacterial assemblages within the pollen microbiome are investigated by next-generation sequencing and metagenomic analysis. Experiments developed herein have been designed to provide a mechanistic understanding of how fungicides affect the microbiome of pollen-provisions. Ultimately, these findings should shed light on the indirect pathway through which fungicides may be causing colony declines.

Microbial consortia within bumble bee hives enrich and preserve pollen for bee larvae. Using next generation sequencing, along with laboratory and field-based experiments, this manuscript describes protocols used to test the hypothesis that fungicide residues alter the pollen microbiome, and colony demographics, ultimately leading to colony loss.

Empirische, metagenomischen und Computertechniken beleuchten die Mechanismen, durch welche Fungizide Kompromiss Bienengesundheit

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered ...

In Vitro Rearing of Solitary Bees: A Tool for Assessing Larval Risk Factors

Although solitary bees provide crucial pollination services for wild and managed crops, this species-rich group has been largely overlooked in pesticide regulation studies. The risk of exposure to fungicide residues is likely to be especially high if the spray occurs on, or near host plants while the bees are collecting pollen to provision their nests. For species of Osmia that consume pollen from a select group of plants (oligolecty), the inability to use pollen from non-host plants can increase their risk factor for fungicide-related toxicity. This manuscript describes protocols used to successfully rear oligolectic mason bees, Osmia ribifloris sensu lato, from egg to prepupal stage within cell culture plates under standardized laboratory conditions. The in vitro-reared bees are subsequently used to investigate the effects of fungicide exposure and pollen source on bee fitness. Based on a 2 &#215; 2 fully crossed factorial design, the experiment examines the main and interactive effects of fungicide exposure and pollen source on larval fitness, quantified by prepupal biomass, larval developmental time, and survivorship. A major advantage of this technique is that using in vitro-reared bees reduces natural background variability and allows the simultaneous manipulation of multiple experimental parameters. The described protocol presents a versatile tool for hypotheses testing involving the suite of factors affecting bee health. For conservation efforts to be met with significant, lasting success, such insights into the complex interplay of physiological and environmental factors driving bee declines will prove to be critical.

In Vitro Rearing of Solitary Bees: A Tool for Assessing Larval Risk Factors

Fungicide sprays on flowering plants may expose solitary bees to high concentrations of pollen-borne fungicide residues. Using laboratory-based experiments involving in vitro-reared bee larvae, this study investigates the interactive effects of consuming fungicide-treated pollen derived from host and non-host plants.

In-vitro- Aufzucht von Solitärbienen: ein Werkzeug für die Beurteilung der Larven Risikofaktoren

Although solitary bees provide crucial pollination services for wild and managed crops, this species-rich group has been largely overlooked in pesticide ...

RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees (Apis mellifera)

This video demonstrates novel techniques of RNA interference (RNAi) which downregulate two genes simultaneously in honey bees using double-stranded RNA (dsRNA) injections. It also presents a protocol of proboscis extension response (PER) assay for measuring gustatory perception.	
	RNAi-mediated gene knockdown is an effective technique downregulating target gene expression. This technique is usually used for single gene manipulation, but it has limitations to detect interactions and joint effects between genes. In the first part of this video, we present two strategies to simultaneously knock down two genes (called double gene knockdown). We show both strategies are able to effectively suppress two genes, vitellogenin (vg) and ultraspiracle (usp), which are in a regulatory feedback loop. This double gene knockdown approach can be used to dissect interrelationships between genes and can be readily applied in different insect species.	
	The second part of this video is a demonstration of proboscis extension response (PER) assay in honey bees after the treatment of double gene knockdown. The PER assay is a standard test for measuring gustatory perception in honey bees, which is a key predictor for how fast a honey bee's behavioral maturation is. Greater gustatory perception of nest bees indicates increased behavioral development which is often associated with an earlier age at onset of foraging and foraging specialization in pollen. In addition, PER assay can be applied to identify metabolic states of satiation or hunger in honey bees. Finally, PER assay combined with pairing different odor stimuli for conditioning the bees is also widely used for learning and memory studies in honey bees.

RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees Apis mellifera

In this protocol, we describe two strategies that simultaneously suppress two genes (double gene knockdown) in honey bees. Then we present how to use the proboscis extension response (PER) assay to study the effect of double gene knockdown on honey bee gustatory perception.

RNAi-vermittelte Gene Knockdown Doppelzimmer und Gustatorisch Perception Measurement in Honey Bees (<em&gt; Apis mellifera</em&gt;)

This video demonstrates novel techniques of RNA  interference (RNAi) which downregulate two genes simultaneously in honey bees  using double-stranded RNA ...

Neurowissenschaften

Evaluating the Effect of Pesticides on the Larvae of the Solitary Bees

Current ecological risk assessments of pesticides on pollinators have primarily considered only laboratory conditions. For the larvae of solitary bees, ingestion of provisions contaminated with pesticides may increase the mortality rate of the larvae, decrease the collection rate and the population of adult solitary bees in the next year from a demographic perspective. But there are limited studies on the effects of pesticides on the larvae of solitary bees. Therefore, understanding how pesticides influence the larvae of solitary bees should be considered an integral part of pesticide ecological risk assessment. This study presents a method to expose the larvae of solitary bee, Osmia excavata, to lethal or sublethal doses of pesticide, tracking larval weight gain, developmental duration, eclosion ability, and food consumption efficiency conversion of ingested food. To demonstrate the effectiveness of this method, the larvae of O. excavata were fed with provisions containing acute lethal and sublethal doses of chlorpyrifos. Then, the above indexes of the treated larvae were investigated. This technique helps to predict and mitigate the risk of pesticides to pollinators.

The present protocol explains a method to feed pesticide-contaminated provisions to the larvae of the solitary bees, Osmia excavata. The procedure examines the ecotoxicity of the pesticide to the larvae of the solitary bees.

Bewertung der Wirkung von Pestiziden auf die Larven der Solitärbienen

Current ecological risk assessments of pesticides on pollinators have primarily considered only laboratory conditions. For the larvae of solitary bees, ...

Biochemie

Preparation of Single-cohort Colonies and Hormone Treatment of Worker Honeybees to Analyze Physiology Associated with Role and/or Endocrine System

Honeybee workers are engaged in various tasks related to maintaining colony activity. The tasks of the workers change according to their age (age-related division of labor). Young workers are engaged in nursing the brood (nurse bees), while older workers are engaged in foraging for nectar and pollen (foragers). The physiology of the workers changes in association with this role shift. For example, the main function of the hypopharyngeal glands (HPGs) changes from the secretion of major royal jelly proteins (MRJPs) to the secretion of carbohydrate-metabolizing enzymes. Because worker tasks change as the workers age in typical colonies, it is difficult to discriminate the physiological changes that occur with aging from those that occur with the role shift. To study the physiological changes in worker tissues, including the HPGs, in association with the role shift, it would be useful to manipulate the honeybee colony population by preparing single-cohort colonies in which workers of almost the same age perform different tasks. Here we describe a detailed protocol for preparing single-cohort colonies for this analysis. Six to eight days after single-cohort colony preparation, precocious foragers that perform foraging tasks earlier than usual appear in the colony. Representative results indicated role-associated changes in HPG gene expression, suggesting role-associated HPG function. In addition to manipulating the colony population, analysis of the endocrine system is important for investigating role-associated physiology. Here, we also describe a detailed protocol for treating workers with 20-hydroxyecdysone (20E), an active form of ecdysone, and methoprene, a juvenile hormone analogue. The survival rate of treated bees was sufficient to examine gene expression in the HPGs. Gene expression changes were observed in response to 20E- and/or methoprene-treatment, suggesting that hormone treatments induce physiological changes of the HPGs. The protocol for hormone treatment described here is appropriate for examining hormonal effects on worker physiology.

Here we describe our detailed protocol for the preparation of single-cohort honeybee colonies&#160;&#8211; a useful tool for analyzing the role-associated worker physiology. We also describe detailed protocols for treating workers with juvenile hormone and ecdysone to evaluate the involvement of these hormones in the regulation of worker behavior and/or physiology.

Erstellung von Einzel-Kohorte Kolonien und Hormonbehandlung von Arbeitshonigbienen Physiologie Assoziierte Analysieren mit Rolle und / oder endokrine System

Honeybee workers are engaged in various tasks related to maintaining colony activity. The tasks of the workers change according to their age (age-related ...

SwarmSight: Real-time Tracking of Insect Antenna Movements and Proboscis Extension Reflex Using a Common Preparation and Conventional Hardware

Many scientifically and agriculturally important insects use antennae to detect the presence of volatile chemical compounds and extend their proboscis during feeding. The ability to rapidly obtain high-resolution measurements of natural antenna and proboscis movements and assess how they change in response to chemical, developmental, and genetic manipulations can aid the understanding of insect behavior. By extending our previous work on assessing aggregate insect swarm or animal group movements from natural and laboratory videos using the video analysis software SwarmSight, we developed a novel, free, and open-source software module, SwarmSight Appendage Tracking (SwarmSight.org) for frame-by-frame tracking of insect antenna and proboscis positions from conventional web camera videos using conventional computers. The software processes frames about 120 times faster than humans, performs at better than human accuracy, and, using 30 frames per second (fps) videos, can capture antennal dynamics up to 15 Hz. The software was used to track the antennal response of honey bees to two odors and found significant mean antennal retractions away from the odor source about 1 s after odor presentation. We observed antenna position density heat map cluster formation and cluster and mean angle dependence on odor concentration.

This protocol describes steps for using the novel software, SwarmSight, for frame-by-frame tracking of insect antenna and proboscis positions from conventional web camera videos using conventional computers. The free, open-source software processes frames about 120 times faster than humans and performs at better than human accuracy.

SwarmSight: Echtzeit-Tracking von Insekten Antenne Bewegungen und Rüssel Erweiterung Reflex mit einem gemeinsamen Vorbereitung und konventioneller Hardware

Many scientifically and agriculturally important insects use antennae to detect the presence of volatile chemical compounds and extend their proboscis ...

Monitoring Colony-level Effects of Sublethal Pesticide Exposure on Honey Bees

The effects of sublethal pesticide exposure to honey bee colonies may be significant but difficult to detect in the field using standard visual assessment methods. Here we describe methods to measure the quantities of adult bees, brood, and food resources by weighing hives and hive parts, by photographing frames, and by installing hives on scales and with internal sensors. Data from these periodic evaluations are then combined with running average and daily detrended data on hive weight and internal hive temperature. The resulting datasets have been used to detect colony-level effects of imidacloprid applied in a sugar syrup as low as 5 parts per billion. The methods are objective, require little training, and provide permanent records in the form of sensor output and photographs.

Sublethal doses of pesticides may affect colonies in ways that are difficult to detect using only periodic or visual methods. Methods to measure total adult bee mass, brood, and food resources by weighing hives and hive parts, photographing frames, and installing sensors, are provided. Data analysis is also addressed.

Überwachung der Kolonie-Ebene Auswirkungen der subletalen Schädlingsbekämpfungsmittelbelichtung auf Honigbienen

The effects of sublethal pesticide exposure to honey bee colonies may be significant but difficult to detect in the field using standard visual assessment ...

Biologie

Assessing Agrochemical Risk to Mated Honey Bee Queens

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not accurately capture the effects of agrochemical exposure on honey bee queens. As the sole producer of fertilized eggs inside a honeybee colony, the queen is arguably the most important single member of a functioning colony unit. Therefore, understanding how agrochemicals affect queen health and productivity should be considered a critical aspect of pesticide risk assessment. Here, an adapted method is presented to expose honey bee queens and worker queen attendants to agrochemical stressors administered through a worker diet, followed by tracking egg production in the laboratory and assessing first instar eclosion using a specialized cage, referred to as a Queen Monitoring Cage. To illustrate the method&#39;s intended use, results of an experiment in which worker queen attendants were fed diet containing sublethal doses of imidacloprid and effects on queens were monitored are described.

This protocol was developed to enhance the understanding of how agrochemicals affect honey bee (Apis mellifera) reproduction by establishing methods to expose honey bee queens and their worker caretakers to agrochemicals in a controlled, laboratory setting and carefully monitoring their relevant responses.

Bewertung des agrochemischen Risikos für gepaarte Honigbienenköniginnen

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not ...

Histology Basics and Cell Death Detection in Honeybee Tissue

Honeybees (Apis mellifera L.) inside the hive (nurse workers and other hive bees) and outside the hive (foragers) are exposed to climate and weather changes, various pesticides, pathogens, and malnutrition, mainly entering through the mouth and primarily affecting the digestive tracts of adult bees. To understand and prevent the effects of such external and internal stressors on honeybees, one useful research method is the immunohistochemical method. A basic protocol is described to prepare the midgut (ventriculus) and hypopharyngeal glands (HPGs) of adult bees for histological analysis. A detailed methodology is described to assess the level of cell damage and distinguish necrosis from programmed cell death (apoptosis) as a natural process of tissue regeneration. The results of adult honeybee treatment with oxalic acid and pesticides (insecticide and acaricide) and the determination of cell death in the ventriculus and HPGs are presented. The pros and cons of the methodology are also discussed.

Immunohistochemical methods are useful in honeybee research to detect and assess the level of apoptosis and necrosis in the midgut and hypopharyngeal glands of adult bees.

Histologische Grundlagen und Zelltodnachweis in Honigbienengewebe

Honeybees (Apis mellifera L.) inside the hive (nurse workers and other hive bees) and outside the hive (foragers) are exposed to climate and weather ...