Unser Protokoll für hohen Durchsatz, Hefezellen ermöglicht die Verfolgung von Wachstum und Genexpression für Tausende von Mikrokolonien gleichzeitig. Der Unterschied zwischen stämmen, zwischen Umgebungen und sogar zwischen genetisch identischen Zellen, die in einer gemeinsamen Umgebung angebaut werden, kann quantifiziert werden. Das Protokoll liefert genaue Schätzungen der durchschnittlichen Wachstumsrate und der durchschnittlichen Fluoreszenzintensität von Genexpressionsreportern.
Da so viele einzelne Mikrokolonien untersucht werden, werden zudem genaue Schätzungen der gesamten Verteilung enkundigen Wachstums- und Expressionswerte ermittelt. Dieses Protokoll folgt zwei Hauptschritten, der Vorbereitung der Versuchsplatte und der Vorbereitung der Zellen für die Bildgebung. Die Zellen müssen unmittelbar nach Verdünnung und Mischen plattiert werden.
Daher empfehlen wir Ihnen, zuerst Ihre Experimentelle Platte einzurichten. Sie werden die wiederholte Vermischung von Zellen während dieses Protokolls bemerken, was in den Schritten bis zur Beschichtung extrem wichtig ist. Am Tag des Experiments müssen alle Medien und andere Lösungen, die für den Test verwendet werden, mit einem Zwei-Mikron-Filter gefiltert werden, auch wenn sie bereits steril sind, um Kristalle zu entfernen, die in Mikroskopbildern erscheinen können.
Dazu gehören experimentelle Medien und die Concanavalin-A-Lösung. Als nächstes bereiten Sie die Mikroskopplatte vor. Um die Glasoberfläche der Brunnen frei von Schmutz und Kratzern zu halten, halten Sie immer eine Fussel und statische freie Wisch unter der Platte.
Verwenden Sie sterile Technik auf einer sterilisierten Bank. Filtern Sie 25 Milliliter 1X Concanavalin Eine Lösung und Pipette 200 Mikroliter in jeden Brunnen der Mikroskopplatte. Wir empfehlen, die Pipette zu stabilisieren, um die richtige Höhe zu gewährleisten.
Zentrifugieren Sie die Mikroskopplatte mit einem Fussel und statischem frei wischen darunter für zwei Minuten bei 411 mal G, um Luftblasen zu entfernen, die verhindern könnten, dass Concanavalin A den Boden der Brunnen gleichmäßig beschichtet. Lassen Sie die Platte mit der Concanavalin A Lösung für ein bis zwei Stunden ruhen. Seien Sie in Ihren Experimenten konsistent.
Nach der Inkubation Concanavalin A die Concanavalin A von der 96-Wellplatte entweder mit einer Saugvorrichtung oder durch gewaltsames Abwerfen der Lösung aus der Platte, wie hier gezeigt, löschen. Einige Tröpfchen bleiben erhalten. Als nächstes waschen Sie die Brunnen, indem Sie 400 Mikroliter steriles Wasser zu jedem Brunnen hinzufügen.
Fügen Sie das Wasser sofort nach dem Entfernen der Concanavalin A Lösung hinzu. Lassen Sie die Platte nicht trocken sitzen. Es ist wichtig, den beschichteten Boden der Platte nicht mit den Pipettenspitzen zu berühren, um Concanavalin A nicht von der Glasoberfläche der Brunnen zu verdrängen oder zu entfernen.
Entfernen Sie das Wasser auf die gleiche Weise wie die Concanavalin A-Lösung und fügen Sie sofort 185 Mikroliter experimentelle Medien in Ihre Mikroskopplatte ein. Lassen Sie die Platte nicht trocken sitzen. Die Platte ist nun bereit für die Zugabe von 50 Mikroliter verdünnter Zellen.
Holen Sie sich Ihre vorgewachsene randomisierte 96-Well-Platte. Ihre experimentelle Frage bestimmt, ob die Zellen gesättigt sind oder sich in der Protokollphase befinden und wie viele randomisierte Replikationen im Test verwendet werden sollen. Zentrifugieren Sie Ihre Platte für zwei Minuten bei 411 mal G, um die Wahrscheinlichkeit einer Kreuzkontamination beim Entfernen der Folienabdeckung zu minimieren.
Achten Sie darauf, Nie Ihre Platte zu kippen, wenn Sie es handhaben. Wenn Hefe und Medien mit der Folie, die die Platte bedeckt, in Berührung kommen, kann es zu Verunreinigungen über Brunnen kommen. Bereiten Sie zuerst die Platten vor, in die Sie Ihre seriellen Verdünnungen führen.
Fügen Sie 90 Mikroliter experimentellemedien zu jeder Ihrer Verdünnungsplatten hinzu. Als nächstes bereiten Sie Ihre Zellen vor. Seien Sie äußerst vorsichtig, wenn Sie die Folie von Ihrer 96-Well-Platte entfernen, um zu verhindern, dass Tröpfchen von einem Brunnen in einen anderen gelangen.
Die Hefe wird aufgrund der Zentrifugation an der Unterseite der Platte konzentriert. Um sicherzustellen, dass Zellen während der Verdünnung gut gemischt werden, fügen Sie immer ein kleines Volumen von Zellen zu einem größeren Medienvolumen hinzu. Fügen Sie dann eine weitere große Menge an Medien in die Mischung ein.
Achten Sie darauf, Pipette kräftig bei jedem Schritt mischen. In diesem Video führten wir Verdünnungen für Hefezellen bei Sättigung und synthetischen Komplettmedien durch, die wir 10.000-fach verdünnen werden, um eine Endkonzentration von etwa 4.000 Zellen pro Brunnen in der Mikroskopplatte zu erreichen. Um die Zellen wieder aufzuhängen, pipette nach oben und unten kräftig und bewegen Sie die Pipettenspitze um den Brunnen in einer kreisförmigen Bewegung.
Nach dem Mischen sollte es keine Spuren von besiedelter Hefe in einem gut verbleiben, wie hier in gut A1 gesehen. Alle anderen hier gezeigten Brunnen wurden nicht zum Vergleich wieder ausgesetzt. Zählen Sie die Zellen in Ihrer vorgewachsenen Platte, zum Beispiel, mit dem Hämozytometer, und kombinieren Sie mit jedem anderen Stamm, den Sie zu gleichen Anteilen zum gleichen Brunnen hinzufügen. Hier mischen wir die Zellen aus unserer vorgewachsenen Platte mit einem fluoreszierenden Referenzstamm im Verhältnis eins zu eins.
Sobald Ihre Zellkonzentrationen standardisiert sind, fügen Sie der ersten seriellen Verdünnungsplatte zehn Mikroliter Zellen hinzu. Dann fügen Sie 100 Mikroliter Medien zu einem Endvolumen von 200 Mikrolitern hinzu. Durch die Zugabe von Zellen und Medien mischen sich Pipette kräftig und bewegen die Pipettenspitze in einer kreisförmigen Bewegung um die Brunnen.
Von diesem Punkt an, bis die Zellen der Mikroskopplatte hinzugefügt werden, gehen Sie schnell durch das Protokoll. Als nächstes fügen Sie zehn Mikroliter Hefe von der ersten seriellen Verdünnungsplatte in die zweite serielle Verdünnungsplatte ein. Dann fügen Sie 100 Mikroliter experimentelle Medien hinzu.
Gut mischen. Wenn Ihre Hefe keine Tendenz zum Flocken hat, dann sind sie bereit, direkt nach diesem Schritt der Mikroskopplatte hinzugefügt zu werden. Fahren Sie sofort mit der Beschichtung fort.
Wenn jedoch die Hefestämme, die Sie verwenden, eine moderate Neigung zum Flocken haben, ist der folgende optionale Beschallungsschritt notwendig. Beim Beschallen mischen die erste Pipette die Hefelösung noch einmal vor der Beschallung. Legen Sie die verdünnte Hefe auf den Beschallungsgerät und tauchen Sie die 96-Well-Pins in die Lösung jedes Brunnens, berühren Sie aber nicht den Boden des Brunnens.
Stellen Sie das Beschallungsprogramm ein, das stark genug ist, um flockige Hefezellen zu zerlegen, aber keine Zellen abtötet oder erhöhte Stressreaktionen verursacht. Einige Tests sind möglicherweise erforderlich, um das beste Beschallungsprogramm für ein bestimmtes Experiment zu identifizieren. Sobald das Programm abgeschlossen ist, entfernen Sie die Zellen und fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort.
15 Mikroliter Hefe aus der zweiten seriellen Verdünnungsplatte in die Mikroskopplatte geben. Pipette nach oben und unten zu mischen, aber tun Sie dies sorgfältig, um zu vermeiden, stören die Concanavalin A an der Unterseite der Brunnen der Platte befestigt. Als nächstes fügen Sie 200 Mikroliter experimentellemedien zu einem Endvolumen von 400 Mikrolitern auf die Mikroskopplatte.
Pipette gemischt vorsichtig. Bedecken Sie die Platte mit einer atmungsaktiven Membran. Stellen Sie sicher, dass die Kanten der Platte gut versiegelt sind.
Zentrifugieren Sie die Mikroskopplatte mit einer Fussel und statischem Freigewebe darunter für zwei Minuten bei 411 mal G, damit die Hefezellen an der Unterseite der Platte an dem Concanavalin A befestigt werden können. Die Platte ist nun bereit, abgebildet zu werden. Wischen Sie am Mikroskop die Ober- und Unterseite der Platte mit einer Fussel und einem statischen freien Abwischen ab und blasen Sie Druckluft auf den Boden der Platte, um Schmutz zu entfernen.
Legen Sie die Platte auf das Mikroskop. Stellen Sie sicher, dass sich der A1-Brunnen in der oberen linken Ecke befindet und dass das Mikroskop auf die richtige Temperatur für das Zellwachstum erhitzt wird. Achten Sie auch darauf, dass die Platte sauber in das Mikroskop gesteckt ist und dass der Boden der Platte flach ist.
Wenn die Platte eine Kunststoffabdeckung hat, entfernen Sie diese, bevor Sie mit der Mikroskopie beginnen. Dies wird wichtig sein, um gute Bilder für die nachgelagerte Analyse zu erfassen. Wir laden eine automatisch generierte Datei mit den X- und Y-Koordinaten und den Brennpositionen, um die gesamte Mikroskopplatte abzubilden.
Wenn Sie eine vorgenerierte Datei verwenden, überprüfen Sie einige Positionen in der Mikroskopplatte, um sicherzustellen, dass sich die Zellen in der richtigen Brennebene befinden. Es ist hilfreich, dass sich die Brennebene leicht über den Zellen befindet, so dass sie von einem dunklen Rand umgeben sind und heller als der Hintergrund sind. Legen Sie die Anzahl der Zeitpunkte und den Zeitpunktabstand fest, den Sie für das Experiment verwenden möchten.
Wenn Sie sowohl Wachstumsraten- als auch Fluoreszenzintensitätsdaten erfassen, richten Sie auch ein Fluoreszenz-Bildgebungsprogramm ein. Passen Sie die Helligkeit in jedem zu bebildernden Kanal so an, dass keine Position auf der Mikroskopplatte überbelichtet ist. Testen Sie die Belichtung, die Sie verwenden werden, wenn Sie sich nicht im Live-Modus befinden.
Bei fluoreszierenden Bildern sollte die Fluoreszenz mit bloßem Auge sichtbar sein. Ansonsten empfehlen wir jedoch, niedrige Belichtungswerte festzulegen. Entsprechend verteilte Kolonien, die von einzelnen Zellen gesät werden, wachsen in einer Monoschicht entlang der Oberfläche der Platte.
Dadurch kann eine automatisierte Bildanalyse verwendet werden, um die Wachstumsrate vieler einzelner Mikrokolonien genau zu berechnen. Fluoreszierende Marker können verwendet werden, um mehrere Stämme zu unterscheiden, die im gleichen Brunnen wachsen. Dadurch können ganze Verteilungen der Wachstumsraten für einzelne Mikrokolonien berechnet werden, die in einer gemeinsamen Umgebung wachsen.
Die großen Stichprobengrößen, die mit diesem Experiment erreichbar sind, ermöglichen auch eine genaue Schätzung der durchschnittlichen Unterschiede zwischen verschiedenen Stämmen oder Wachstumsbedingungen. Hier werden Wachstumsraten für gepaarte Gruppen von Kolonien angezeigt, die in einzelnen Brunnen aus einer Reihe von Mutationsakkumulationslinien und den in-well GFP-Referenzkontrollkolonien angebaut werden. Wenn Zellen auf der Mikroskopplatte verklumpend beobachtet werden, müssen die Klumpen vor der Beschichtung durch Beschallung aufgebrochen werden.
Zellen in Klumpen, die nicht aufgebrochen werden, wachsen nicht in einer planaren Mikrokolonie entlang der Plattenoberfläche, was eine korrekte Berechnung der Wachstumsrate unmöglich macht. Nicht alle Medien sind mit dem Mikrokolonie-Wachstumsratentest kompatibel. Einige Medien, einschließlich Medien, die Hefeextrakt enthalten oder einen niedrigen pH-Wert haben, verhindern die Bindung von Zellen an Concanavalin A. Dies führt dazu, dass Zellen im Laufe des Experiments von wachsenden Mikrokolonien wegschwimmen und eine fehlerhafte Wachstumsrate messen.
Es ist wichtig, zellenzu vermeiden, zu dicht zu beschichten. Wenn Zellen zu eng plattiert werden, verschmelzen schneller wachsende Mikrokolonien zu früheren Zeitpunkten, die hier als Verlust der Farbverfolgung dargestellt werden. Dieser Effekt kann Schätzungen der Wachstumsrate verzerrt, da langsam wachsende Kolonien weniger wahrscheinlich mit ihren Nachbarn fusionieren, bevor Daten aus ausreichenden Zeitpunkten gesammelt werden.
Je nach Wachstumsbedingungen kann eine Teilmenge der Zellen eine Verzögerungsphase durchlaufen, bevor sie zu wachsen beginnt. Es ist wichtig, dies bei der Verwendung von Koloniegebieten zur Berechnung der Wachstumsrate zu berücksichtigen, anstatt eine Wachstumskurve an alle verfügbaren Zeitpunkte anzugleichen. Das beschriebene Protokoll kann verwendet werden, um eine Breite von Fragen im Zusammenhang mit Hefewachstum und -entwicklung zu untersuchen.
Sein flexibles Mikroplattenformat bedeutet, dass es an andere Hefearten, verschiedene Wachstumsbedingungen, andere Mikroben und potenziell andere Zellen in der Kultur angepasst werden kann.
