بروتوكولنا لسرعة الإنتاجية العالية، خلايا الخميرة تمكن تتبع النمو والتعبير الجيني لآلاف المستعمرات الدقيقة في وقت واحد. ويمكن قياس الفرق بين السلالات، وبين البيئات وحتى بين الخلايا المتطابقة وراثيا التي تزرع في بيئة مشتركة كميا. يقدم البروتوكول تقديرات دقيقة لمتوسط معدل النمو ومتوسط كثافة الفلورسينس لمراسلي التعبير الجيني.
وبالإضافة إلى ذلك، ونظرا لأن العديد من المستعمرات الصغيرة الفردية يتم تقييمها، يتم الحصول على تقديرات دقيقة لتوزيعات كاملة من قيم النمو والتعبير. يتبع هذا البروتوكول خطوتين رئيسيتين ، إعداد اللوحة التجريبية وإعداد الخلايا للتصوير. يجب أن تكون الخلايا مطلية مباشرة بعد التخفيف والاختلاط.
لذلك نوصي بإعداد طبقك التجريبي أولا. ستلاحظ الاختلاط المتكرر للخلايا في جميع أنحاء هذا البروتوكول ، وهو أمر مهم للغاية في الخطوات حتى الطلاء. في يوم التجربة ، يجب تصفية جميع الوسائط والحلول الأخرى المستخدمة في الفحص باستخدام فلتر ميكرونين ، حتى لو كانت معقمة بالفعل ، من أجل إزالة أي بلورات قد تظهر في صور المجهر.
وهذا يشمل وسائل الإعلام التجريبية والحل Concanavalin A. بعد ذلك، قم بإعداد لوحة المجهر. من أجل الحفاظ على السطح الزجاجي للآبار واضحة من الحطام والخدوش، والحفاظ دائما على الوبر ومسح حر ثابت تحت لوحة.
استخدام تقنية معقمة على مقاعد البدلاء المعقمة. تصفية 25 ملليلتر من محلول 1X Concanavalin A وماصة 200 ميكرولتر في كل بئر من لوحة المجهر. نوصي بتثبيت ماصة لضمان الارتفاع السليم.
الطرد المركزي لوحة المجهر مع الوبر ومسحة حرة ثابتة تحته لمدة دقيقتين في 411 مرات G من أجل إزالة أي فقاعات الهواء التي يمكن أن تمنع Concanavalin A من طلاء بالتساوي الجزء السفلي من الآبار. دع اللوحة التي تحتوي على الكونكانافالين A الحل بقية لمدة ساعة إلى ساعتين. كن متسقا عبر تجاربك.
بعد حضانة Concanavalin A، مسح Concanavalin A من لوحة البئر 96 إما مع جهاز شفط أو عن طريق إلقاء بقوة الحل من لوحة كما هو مبين هنا. ستبقى بعض القطرات. بعد ذلك، اغسل الآبار بإضافة 400 ميكرولتر من المياه العقيمة إلى كل بئر.
إضافة الماء مباشرة بعد إزالة محلول Concanavalin A. لا تدع لوحة الجلوس الجافة. من المهم تجنب لمس الجزء السفلي المغلفة من لوحة مع نصائح ماصة من أجل عدم إزاحة أو إزالة Concanavalin A من السطح الزجاجي للأبار.
إزالة المياه بنفس الطريقة التي حل Concanavalin A وإضافة فورا 185 ميكرولتر من وسائل الإعلام التجريبية إلى لوحة المجهر الخاص بك. لا تسمح للطبق بالجلوس جافا. اللوحة جاهزة الآن لإضافة 50 ميكرولتر من الخلايا المخففة.
استرجع طبقك المعشاة التي تم زراعتها مسبقا من 96 بئرا. سيحدد سؤالك التجريبي ما إذا كانت الخلايا مشبعة أو في مرحلة السجل وعدد النسخ المتماثلة العشوائية التي يجب استخدامها في الفحص. طرد مركزي لوحة لمدة دقيقتين في 411 مرات G لتقليل فرصة التلوث المتبادل عند إزالة غطاء احباط.
تأكد من عدم إمالة لوحة الخاص بك عندما كنت التعامل معها. إذا الخميرة ووسائل الإعلام تأتي في اتصال مع احباط تغطي لوحة، يمكن أن يكون هناك تلوث عبر الآبار. أولا إعداد لوحات سوف تجري المخففات التسلسلية الخاصة بك في.
أضف 90 ميكرولتر من الوسائط التجريبية إلى كل لوحة من لوحات التخفيف الخاصة بك. المقبل إعداد الخلايا الخاصة بك. كن حذرا للغاية عند إزالة احباط من لوحة 96 جيدا لمنع قطرات من بئر واحد من دخول آخر.
وسوف تتركز الخميرة في الجزء السفلي من لوحة بسبب الطرد المركزي. للتأكد من أن الخلايا مختلطة جيدا أثناء التخفيف، قم دائما بإضافة حجم صغير من الخلايا إلى حجم أكبر من الوسائط. ثم إضافة حجم كبير آخر من وسائل الإعلام إلى الخليط.
مما لا شك فيه أن مزيج ماصة بقوة في كل خطوة. في هذا الفيديو، قمنا بإضعاف خلايا الخميرة عند التشبع والوسائط الكاملة الاصطناعية، والتي سنقوم بتخفيفها 10000 مرة لتحقيق تركيز نهائي من حوالي 4000 خلية لكل بئر في لوحة المجهر. لإعادة تعليق الخلايا، ماصة صعودا وهبوطا بقوة وتحريك طرف ماصة حول البئر في حركة دائرية.
بعد خلط، ينبغي أن يكون هناك أي آثار الخميرة استقر المتبقية في أي بئر كما رأينا هنا في A1 جيدا. جميع الآبار الأخرى المعروضة هنا لم يتم إعادة تعليقها للمقارنة. عد الخلايا في لوحة ما قبل نمت، على سبيل المثال، مع مقياس الدم، والجمع مع أي سلالة أخرى التي سوف تضيف إلى نفس البئر بنسب متساوية. هنا، نخلط الخلايا من صحننا المزروع مسبقا مع سلالة مرجعية فلورية بنسبة واحد إلى واحد.
بمجرد توحيد تركيزات الخلايا، أضف عشرة ميكرولترات من الخلايا إلى لوحة التخفيف التسلسلية الأولى. ثم أضف 100 ميكرولتر من الوسائط إلى مجلد نهائي من 200 ميكرولتر. مع إضافة الخلايا ووسائل الإعلام على حد سواء، ماصة مزيج بقوة، وتحريك طرف ماصة حول الآبار في حركة دائرية.
من هذه النقطة فصاعدا، حتى يتم إضافة الخلايا إلى لوحة المجهر، والمضي قدما بسرعة من خلال البروتوكول. بعد ذلك ، أضف عشرة ميكرولترات من الخميرة من لوحة التخفيف التسلسلية الأولى إلى لوحة التخفيف التسلسلية الثانية. ثم أضف 100 ميكرولتر من الوسائط التجريبية إلى ذلك.
تخلط جيدا. إذا الخميرة الخاصة بك لم يكن لديك ميل إلى flocculate، ثم أنها على استعداد لإضافتها إلى لوحة المجهر مباشرة بعد هذه الخطوة. المضي قدما على الفور إلى الطلاء.
ومع ذلك ، إذا كانت سلالات الخميرة التي تستخدمها لديها ميل معتدل إلى التخبط ، فإن خطوة سونيكيشن الاختيارية التالية ستكون ضرورية. إذا sonicating، أول ماصة خلط حل الخميرة مرة أخرى، قبل sonication. وضع الخميرة المخففة على sonicator وغمر دبابيس 96 جيدا في حل كل بئر، ولكن لا تلمس الجزء السفلي من البئر.
تعيين برنامج سونيكيشن، الذي هو قوي بما فيه الكفاية لكسر خلايا الخميرة flocculated، ولكن لا يقتل الخلايا أو يسبب استجابات الإجهاد مرتفعة. قد تكون هناك حاجة إلى بعض الاختبارات لتحديد أفضل برنامج سونيكيشن لتجربة معينة. بمجرد اكتمال البرنامج، قم بإزالة الخلايا ثم انتقل فورا إلى الخطوة التالية.
إضافة 15 ميكرولتر من الخميرة من لوحة تخفيف المسلسل الثاني في لوحة المجهر. ماصة صعودا وهبوطا لخلط، ولكن القيام بذلك بعناية لتجنب إزعاج Concanavalin A تعلق على الجزء السفلي من آبار لوحة. بعد ذلك ، أضف 200 ميكرولتر من الوسائط التجريبية إلى حجم نهائي من 400 ميكرولتر ، إلى لوحة المجهر.
ماصة مزيج بحذر. قم بتغطية اللوحة بغشاء قابل للتنفس. تأكد من أن حواف اللوحة مغلقة جيدا.
الطرد المركزي لوحة المجهر مع الوبر والأنسجة الحرة ثابتة تحته لمدة دقيقتين في 411 مرات G من أجل خلايا الخميرة لإرفاق Concanavalin A في الجزء السفلي من لوحة. اللوحة جاهزة الآن ليتم تصويرها. في المجهر، امسح الجزء العلوي والسفلي من اللوحة بمسحة حرة من الوبر والساكنة وانفخ الهواء المضغوط على الجزء السفلي من اللوحة لإزالة الحطام.
ضع اللوحة على المجهر. تأكد من أن بئر A1 في الزاوية اليسرى العليا وأن يتم تسخين المجهر إلى درجة الحرارة الصحيحة لنمو الخلية. تأكد أيضا من أن اللوحة مدسوسة بدقة في المجهر وأن الجزء السفلي من اللوحة مسطح.
إذا كانت اللوحة تحتوي على غطاء بلاستيكي، قم بإزالة هذا قبل بدء الفحص المجهري. وسيكون من المهم التقاط صور جيدة لتحليل المصب. نقوم بتحميل ملف تم إنشاؤه تلقائيا مع إحداثيات X و Y والمواقف البؤرية لتصوير لوحة المجهر بأكملها.
إذا كنت تستخدم ملفا تم إنشاؤه مسبقا، فتحقق من بعض المواضع في لوحة المجهر لضمان وجود الخلايا في المستوى البؤري الصحيح. من المفيد أن تكون الطائرة المحورية أعلى قليلا من الخلايا بحيث تكون محاطة بحافة داكنة وتكون أكثر إشراقا من الخلفية. تعيين عدد النقاط الزمنية وتباعد النقاط الزمنية التي ستستخدمها للتجربة.
إذا كنت تقوم بجمع كل من معدل النمو وبيانات كثافة الفلورسينس ، فقيم برنامجا للتصوير الفلوري أيضا. ضبط السطوع في كل قناة ليتم تصويرها بحيث لا يتعرض أي موضع على لوحة المجهر. اختبار التعرض سوف تستخدم عندما كنت لا في وضع العيش.
بالنسبة للصور الفلورية ، يجب أن تكون الفلورسينس مرئية للعين المجردة. ولكن بخلاف ذلك نوصي بتعيين قيم التعرض المنخفض. تنمو المستعمرات المتباعدة بشكل مناسب التي تزرعها الخلايا الفردية في طبقة أحادية على طول سطح اللوحة.
ونتيجة لذلك، يمكن استخدام تحليل الصور الآلي لحساب معدل النمو بدقة للعديد من الألوان الدقيقة الفردية. يمكن استخدام علامات الفلورسنت للتمييز بين سلالات متعددة تنمو في نفس البئر. ونتيجة لذلك، يمكن حساب التوزيعات الكاملة لمعدلات النمو لفرادى المستعمرات الدقيقة التي تنمو في بيئة مشتركة.
كما تسمح أحجام العينات الكبيرة التي يمكن تحقيقها مع هذه التجربة بتقدير دقيق لمتوسط الاختلافات بين السلالات المختلفة أو ظروف النمو. هنا ، تظهر معدلات نمو مجموعات المستعمرات المقترنة التي تزرع في آبار واحدة من مجموعة من خطوط تراكم الطفرات ومستعمرات التحكم المرجعية في GFP بشكل جيد. إذا لوحظ تكتل الخلايا على لوحة المجهر ، يجب تقسيم الكتل عن طريق سونيكيشن قبل الطلاء.
الخلايا في الكتل التي لم يتم تقسيمها لن تنمو في الكولونية الدقيقة على طول سطح اللوحة ، مما يجعل الحساب الصحيح لمعدل النمو مستحيلا. ليس كل وسائل الإعلام متوافقة مع معدل نمو الألوان الدقيقة المقايسة. بعض أشكال وسائل الإعلام، بما في ذلك وسائل الإعلام التي تحتوي على استخراج الخميرة أو لديه انخفاض الحموضة، ومنع ربط الخلايا إلى Concanavalin A.This يؤدي إلى الخلايا العائمة بعيدا عن المستعمرات الدقيقة المتنامية على مدار التجربة وقياسات معدل النمو خاطئة.
من المهم تجنب طلاء الخلايا بكثافة كبيرة جدا. عندما تكون الخلايا مطلية عن كثب ، تندمج الألوان الدقيقة الأسرع نموا في نقاط زمنية سابقة ، كما هو موضح هنا على أنها فقدان لتتبع الألوان. ويمكن لهذا التأثير أن يتحيز لتقديرات معدل النمو لأن المستعمرات البطيئة النمو أقل احتمالا للاندماج مع جيرانها قبل جمع البيانات من النقاط الزمنية الكافية.
اعتمادا على ظروف النمو، قد تخضع مجموعة فرعية من الخلايا لمرحلة تأخر قبل البدء في النمو. من المهم حساب ذلك عند استخدام مناطق المستعمرة لحساب معدل النمو بدلا من تركيب منحنى النمو لجميع النقاط الزمنية المتاحة. يمكن استخدام البروتوكول الموصوف للتحقيق في مجموعة واسعة من الأسئلة المتعلقة بنمو الخميرة وتطورها.
شكله microplate مرنة يعني أنه يمكن تكييفها لأنواع الخميرة الأخرى، وظروف النمو المختلفة، والميكروبات الأخرى، وربما غيرها من الخلايا في الثقافة.
