Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation Career Award (0953583) und dem National Institute of Health NCI / R21-CA116102, NCI / R21-CA125088, NIBIB / R01-EB012065, NCI / R01-CA157766 unterstützt.

In diesem Protokoll wurde ein Oligonukleotid (RBMB1) am 5&#39;-Ende mit einem Farbstoff markiert CF640R Reporter und hat die Sequenz: 5&#39;-mCmUmUmC mGmUmC mCmAmC MAMAMA mCmAmC mAmAmC mUmCmC mU mGmAmAmG mGmAmC mGmGmC mAmGmC mGmUmG mCmAmG mCmUmC Mumu-3 &#39;. Selbst komplementären Domänen, die die Bildung der Haarnadelstruktur zu fahren, sind fett gedruckt. Das zweite Oligonukleotid (RBMB2) wurde am 3&#39;-Ende mit einem Iowa Schwarz RQ-Sp Quencher markiert und hat die Sequenz: 5&#39;-mGmAmG mCmUmG mCmAmC mGmCmU mGmCmC mGmUmC-3 &#39;. 1. Herstellung von RBMBs <ol><li> Ausführen einer schnellen Spin der Röhrchen, die die RBMB1 und RBMB2 Oligonukleotide, um sicherzustellen, das getrocknete Oligonukleotid ist an der Unterseite des Rohres und Resuspension in DNase und RNase-freiem Wasser auf eine Endkonzentration von 100 uM. Zum Beispiel sollte ein 10 nMol Probe von Oligonukleotid in 100 ul Wasser resuspendiert werden. </li><li> MeasUre die genaue Konzentration der RBMB1 und RBMB2 Lager Proben durch UV-Vis-Spektroskopie. <ol><li> Mix 3 ul der RBMB Probe mit 117 ul DPBS (ohne Calcium und Magnesium) in einem Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Blank das Spektralphotometer mit DPBS und messen die Absorption von 200 bis 800 nm auf. Anmerkung: Peakabsorptionen bei 260 nm und 650 nm sichtbar sein. </li><li> Berechnen der Stoffkonzentration der RBMB Proben auf der Basis der Absorption bei 260 nm (oder 650 nm für RBMB1) unter Verwendung der Gleichung: Auf Konzentration (M) = A 260 * Verdünnungsfaktor / Extinktionskoeffizienten in der A 260 ist die Absorption bei 260 nm und der Verdünnungsfaktor 40. Hinweis: Der Extinktionskoeffizient für die RBMB auf dem Datenblatt des Herstellers Oligonukleotid gefunden werden. Der Extinktionskoeffizient bei 650 nm CF640R ist 103.000. </li></ol></li><li> Mix 20 ul 100 uM RBMB1, 30 ul 100 uM RBMB2, 6 ul 10x; Phosphatpuffer (10x Phosphatpuffer: 480 mM K 2 HPO 4, 45 mM KH 2 PO 4, 140 mM NaH 2 PO 4, pH 7,2) und 4 ul DNase und RNase-freiem Wasser. Inkubieren der Mischung bei Raumtemperatur für 30 min. Hinweis: Dies ist in der Regel ausreichend für ca. 50 Studien. </li><li> Bereiten Sie eine Flüssigkeits-Chromatographie-Säule mit 75 Grad prep Superdex, alle nicht-hybridisierten Oligonukleotide RBMB2 entfernen. Verwenden Sie einen 8 ml (0,7 x 20 cm) Flüssigchromatographie-Säule mit einem ~ 4 ml Bettvolumen, um das kleine Volumen der gemischten Sonden reinigen. </li><li> Waschen und equilibrieren die Superdex mit ~ 50 ml 1X Phosphat-Puffer unter Verwendung einer Spritzenpumpe bei einer Laufstrom bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,6 ml / min. Vor allem der Flüssigkeit in die Bettvolumen, stoppen Sie die Spritzenpumpe, entfernen Sie es, und lassen Sie die restliche Flüssigkeit durch die Säule gehen durch die Schwerkraft. </li><li> Laden Sie die RBMB Gemisch (60 ul) auf die Chromatographie-Säule. <ol><li> Nachdem die Probe vollständig RBMB hatbetrat das Bett, langsam an die Spitze des Bettes weiteren hinzufügen 250 ul 1x Phosphat-Puffer, um sicherzustellen, dass die gesamte Probe vollständig die Spalte eingetragen. </li><li> Füllen Sie die Spalte bis zum Rand mit 1x Phosphat-Puffer. Schließen Sie die obere, und starten Sie die Spritzenpumpe - die Spritze sollte gefüllt werden ~ 50 ml 1x PBS und bei einer Flussrate von 0,6 ml / min laufen. </li><li> Sobald die RBMB den Boden der Säule nähert - die RBMB Probe kann typischerweise leicht durch die Farbe des Farbstoffs in die Sonde eingebaut visualisiert werden - in Strömungs sammeln die in 2 Tropfen pro Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 ml). Stoppen Sie das Sammeln der Probe, nachdem der Farbe innerhalb des Mikrozentrifugenröhrchen wird klar. </li></ol></li><li> Kombinieren Sie die Rohre die farbige RBMB Probe, die - in der Regel 5-6 Röhren - und laden Sie zu einer Kreiselfiltervorrichtung (10.000 MW Cutoff). Zentrifugieren Sie die Probe bei 10.000 RCF für 20 Minuten oder bis die gewünschte Lautstärke. Anmerkung: Diese Geschwindigkeiten und Zeiten typischerweiseergeben ein Gesamtvolumen von 30 ul ~. </li><li> Messen der genauen Konzentration der gereinigten RBMB Probe durch UV-Vis-Spektroskopie. <ol><li> Nehmen Sie 3 ul der konzentrierten RBMB Probe und mit 117 ul DPBS in ein Mikrozentrifugenröhrchen mischen. </li><li> Blank das Spektralphotometer mit DPBS und messen die Absorption von 200 bis 800 nm auf. Anmerkung: Peakabsorptionen bei 260 nm und 650 nm sichtbar sein. </li><li> Berechnen der Stoffkonzentration des hybridisierten RBMB basierend auf der Absorption bei 650 nm, unter Verwendung der Gleichung: Auf Konzentration (M) = A 650 * Verdünnungsfaktor / ausgestorben Koeffizient der A 650 ist die Absorption bei 650 nm, ist der Verdünnungsfaktor 40. Hinweis: Der Extinktionskoeffizient bei 650 nm für CF640R ist 103.000 und die Extinktionskoeffizienten für Iowa Schwarz RQ ~ 20.000. Die Extinktionskoeffizienten sind additiv und sind nicht empfindlich für die Hybridisierung. Daher hat die Aktie RBMB Probe eine kombinierte Extinktionskoeffizient approximately 123.000 bei 650 nm. </li></ol></li><li> Das Röhrchen entsprechend mit Namen und Konzentration und bei -20 ° C für die zukünftige Verwendung. </li></ol> 2. Herstellung von Poly-D-Lysin beschichteten 8-Well-Kammerdeckgläser <ol><li> Vorbereiten einer 0,2 mg / ml Lösung von Poly-D-Lysin durch Auflösen von 5 mg Poly-D-Lysin (gefriergetrocknetes Pulver, G-bestrahlten) in 25 ml sterilisiertem Wasser in einer sterilen Umgebung. </li><li> Jeweils 200 ul der 0,2 mg / ml Poly-D-Lysin-Lösung in jede Vertiefung eines 8-Well-Kammerdeckgläser in einer sterilen Umgebung. </li><li> Inkubieren bei Raumtemperatur für 16-18 Stunden in den Zellkulturhaube. </li><li> Saugen Sie den Poly-D-Lysin und mit sterilem destilliertem Wasser waschen das gut 3-mal. Hinweis: Die beschichtete Chamber Slides, können bei 4 ° C gelagert werden. </li></ol> 3. Probe Liefer Hinweis: Die verwendeten Zellsystem sollte eine integrierte Gen-Konstrukt, das RNA mit mindestens 4-sequentielle binden drückt enthaltening Stellen für die RBMB in der 3&#39;-untranslatierten Region (UTR). Die Target-Sequenzen sollten komplementär zu der Schleife des RBMB sein. Es wird empfohlen, als negative Kontrolle, die gleichen Zelllinie hergestellt werden, um das gleiche Gen-Konstrukt zu exprimieren, aber ohne die Tandem-Repeats. In diesem Protokoll ein Mensch Fibrosarkom-Zelllinie HT1080, wurde ausgeführt, um GFP-RNA mit 96 Tandemwiederholungen des RBMB Zielsequenz in der 3&#39;-UTR auszudrücken. Die Kontrollzelllinie wurde entwickelt, um Wildtyp-GFP-RNA auszudrücken. <ol><li> Platte Zellen in einer T25-Flasche bei 40-50% Konfluenz einen Tag vor Lieferung Sonde. Kultur die Zellen mit DMEM-Medium mit 1% Penicillin / Streptomycin und 10% fetales Rinderserum (FBS), und bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li><li> Am nächsten Tag, schalten Sie den Mikroporator und richten Sie die Parameter Mikroporation bis 950 V, 2 Impulse, 25 msec. Anmerkung: Diese Parameter wurden für HT1080-Zellen optimiert, aber sie sind Zelltyp abhängig sein und kann adjusTed für andere Zelltypen wie in der Anleitung des Herstellers beschrieben. </li><li> Füllen Sie den Mikroporation Rohr mit 4 ml Elektrolytpuffer und legen Sie es auf der Mikroporation Station. </li><li> Nehmen Sie die Lager Probe gereinigt RBMB und abtauen. Verdünnen mehrere Mikroliter bis zu einer Endkonzentration von 12 uM mit 1x Phosphatpuffer. 1 ul für jede Mikroporierung benötigt. </li><li> Je 1 ml des Kulturmediums mit FBS, aber ohne Antibiotika in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Hinweis: Diese werden verwendet, um die Zellen nach Mikroporation sofort einzustellen und kann aufgehoben werden, in der Nähe des Mikroporationseinrichtung, vorerst. Der Einschluss von Antibiotika in den Kulturmedien wird die Lebensfähigkeit der Zellen nach Mikroporierung verringern. </li><li> Entfernen Sie den Zellkulturmedien von den technisch HT1080-Zellen (60-80% konfluent), waschen Sie die Zellen mit 1 ml Ca2 + und Mg2 + -freie DPBS einmal, und Inkubation mit 1 ml Trypsin für 1-2 min. </li><li> Stoppen Sie den trypsinization durch Zugabe von 1 ml DMEM-Medium mit 10% fötalem Rinderserum, Antibiotika und ohne Phenolrot, und übertragen die Zellen in zwei 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Spin-Down der Zellen in der Mikrozentrifugenröhrchen bei 200 g für 5 min. Entfernen des Überstands, Resuspendieren und verbinden die Zellpellets in einem Endvolumen von 1 ml DPBS. </li><li> Nehmen Sie sich 10 ul von der gut gemischten Zellsuspension und zählen Sie die Zellen. </li><li> Pipettieren die Zellen nach oben und unten mehrere Male, um sicherzustellen, dass sie gut verteilt sind und übertragen 300.000 Zellen mit DPBS in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und Spin bei 200 xg für 5 min nach unten. </li><li> Entfernen Sie den Überstand, man aufpassen, nicht das Zellpellet stören. Das Pellet in 11 ul Resuspensionspuffer und Pipette auf und ab mehrmals, um sicherzustellen, dass die Zellen gut verteilt. Achten Sie darauf, dass keine Luftblasen zu erzeugen. Hinweis: Luftblasen einen Funken während Mikroporation führen und in armen RBMB Lieferung und Zelltod. </li><li> 1 ul der verdünnten RBMB (12 uM) und gut mischen durch Pipettieren von oben und unten mehrmals. Wieder darauf, dass keine Luftblasen zu erzeugen. </li><li> Saugen Sie 10 ul der RBMB-Zellmischung, mit der Pipette Mikroporation, und legen Sie die Pipette in die Mikroporation Röhre. Den Startknopf drücken, um die Mikroporation starten. Hinweis: Es sollten keine sichtbaren Luftblasen in der Spitze sein. </li><li> Wenn der Bildschirm des Mikroporator zeigt Abschluss, entfernen Sie die Pipette aus der Station, vertreiben die 10-ul-Gemisch in die Mikrozentrifugenröhrchen, die zuvor vorbereitet wurde, mit 1 ml Kulturmedium mit FBS, aber ohne Antibiotika. Vorsichtig mischen durch Schwenken der Rohrseite-an-Seite mehrmals. </li><li> Dreh die Zellen bei 200 xg für 5 min und waschen Sie die Zellen zwei weitere Male, in 1 ml Phenolrot freien Kulturmedium mit FBS, aber ohne Antibiotika, um alle RBMBs, die nicht in die Zellen geliefert wurden, zu entfernen. Resuspendieren mit 400 ul Phenol rot freien Kulturmedium mit FBS, aber ohneAntibiotika. </li><li> Platte die microporated Zellen in das Poly-D-Lysin beschichteten 8-Well-Kammerdeckgläser mit 200 ul pro Vertiefung oder an der gewünschten Konfluenz. </li><li> Optional: Wenn es erwünscht ist, die Bild Kern hinzuzufügen Hoechst 33342 zu den Zellen in einer Endkonzentration von 0,01 mg / ml. </li><li> Legen Sie die Kammerdeckgläser in eine Zellkulturbrutschrank. Inkubieren Sie die Zellen für 1-2 Stunden vor der Bildgebung, so dass die Zellen ausreichend Zeit, um auf dem Deckglas Oberfläche niederlassen zu haben. Hinweis: Imaging kann, sobald 30 min nach Mikroporierung geführt werden. </li></ol> 4. Image Acquisition <ol><li> Schalten Sie die Lebendzellstadium oben Inkubation System und äquilibrieren, bis es 37 ° C, 5% CO 2 und 75% Feuchtigkeit erreicht. </li><li> Schalten Sie das Mikroskop und Fluoreszenzlichtquelle und öffnen Sie die Metamorph-Software. Anmerkung: ähnliche Software-Pakete für Mikroskopsteuerung und Bildaufnahme können ebenfalls verwendet werden. </li><li> Gelten Immersol Öl, um dieZiel. </li><li> Übertragen Sie die Kammerdeckgläser mit microporated Zellen zum Live-Zell-Stadium oben Inkubation System. Bebrüten die Bühne oben System, bis die Temperatur und CO 2 Ebenen stabilisiert werden. </li><li> Öffnen Sie die Registerkarte Acquire, in Metamorph-Software. Klicken Sie auf die Schaltfläche Live anzeigen, um das Feld zu finden, stellen Sie den Fokus unter weißem Licht und klicken Sie auf den Stop-Button Live. </li><li> Unter der Registerkarte Acquire, klicken Sie auf und öffnen Sie den Strom Erwerb Pop-up-Taste, und stellen Sie sich den gewünschten Film Erfassungsparameter. Erwerben 150 Bilder mit dem Cy5 / CF640R Filter und die Bilder auf der Festplatte. </li></ol>

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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanine+fluorophore+derivatives+with+enhanced+photostability.">Cyanine fluorophore derivatives with enhanced photostability.</a> Nat Methods. 9 (1), 68-71 (2012).</li><li>Kumaraswamy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent-conjugated+polymer+superquenching+facilitates+highly+sensitive+detection+of+proteases.">Fluorescent-conjugated polymer superquenching facilitates highly sensitive detection of proteases.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101 (20), 7511-7515 (2004).</li><li>Yang, C. J., Pinto, M., Schanze, K., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+synthesis+of+an+oligonucleotide-poly(phenylene+ethynylene)+conjugate+with+a+precise+one-to-one+molecular+ratio.">Direct synthesis of an oligonucleotide-poly(phenylene ethynylene) conjugate with a precise one-to-one molecular ratio.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 44 (17), 2572-2576 (2005).</li><li>Lu, J., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+microRNAs+in+single+mammalian+cells+in+situ.">Imaging individual microRNAs in single mammalian cells in situ.</a> Nucleic Acids Res. 37 (14), e100 (2009).</li><li>Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+mRNA+synthesis+in+mammalian+cells.">Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells.</a> PLoS Biol. 4 (10), e309 (2006).</li></ol>

Dr. Mark Behlke und Dr. Ling Huang werden von IDT verwendet, die Oligonukleotide zum Verkauf ähnlich wie einige der in der Handschrift beschriebenen Verbindungen bietet. IDT ist jedoch nicht ein börsennotiertes Unternehmen und die sie persönlich nicht besitzen keine Aktien / Aktien in IDT.

Die Fähigkeit, einzelne Bild entwickelt RNA-Transkripte in lebenden Zellen mit einem konventionellen Weitfeldmikroskop erfordert eine helle und photoFluoreszenzSignal mit jedem RNA-Transkript und eine niedrige Leuchtstoff Hintergrund von ungebundenen Fluoreszenzsonden ausgeh zugeordnet werden. In diesem Verfahren wird ein helles Fluoreszenzsignal durch Hybridisierung mehrere (bis zu 96) auf Oligonukleotiden basierende Fluoreszenzsonden, dh RBMBs, auf jedes RNA-Transkript erreicht. Allerdings sind nur vier Bind...

Die Expression und Regulation von RNA-Transkripten ist ein komplexer und dynamischer Prozess, der im Wesentlichen zur Steuerung des Zellverhaltens und Schicksal verantwortlich ist. Obwohl die Bedeutung von RNA diktieren Zellfunktion ist seit einiger Zeit bekannt ist, ist es oft schwierig, klare Verbindung zwischen den beiden, da die meisten RNA-Analyse-Tools nicht über die räumliche und zeitliche Auflösung, um wichtige regulatorische Ereignisse wie Transkriptions Platzen zu erfassen, RNA zeichnen Menschenhandel und lokalisierte RNA-Prozessierung. Dies hat zu der Einführung von mehreren Techniken, die einzelnen RNA-Transkripte in lebenden Zellen in Echtzeit visualisiert 1 geführt werden kann. Vielleicht das bekannteste dieser Verfahren verwendet eine GFP-MS2-Fusionsproteins an RNA, die konstruiert wurde, um Tandem-Wiederholungen des MS2-Bindungsstelle in der 3&#39;-UTR-2,3 enthalten Ziel. Indem mehrere GFP-Moleküle in der Nähe, individuelle RNA-Transkripte als helle fluoreszierende Fleckendurch Fluoreszenzmikroskopie. Das GFP-MS2-System beispiellosen Einblick in RNA Verhalten, einschließlich direkte Visualisierung und Messungen der Transkriptions platzen 4,5, Erkennung von einzigartigen Unter zelluläre Lokalisation und Verarbeitung 6-9, und Echtzeit-Bildgebung von RNA-Transport 10 vorgesehen. Doch trotz der enormen Potenzial des GFP-MS2-System, ungebundenen GFP-MS2-Fusionsproteine ​​können eine hohe Hintergrundfluoreszenzsignal, die die Vielseitigkeit und Dynamik dieser Technik begrenzt erstellen. Verschiedene Ansätze wurden entwickelt, um dieses Hintergrundsignal zu begrenzen, einschließlich subzelluläre Kompartimentierung von ungebundenem GFP-MS2 10, Proteinfragments Komplementierung 11 und alternative RNA-Bindeproteinen und Ziele 12. Jedoch sind alle diese Ansätze bleiben empfindlich gegenüber der relativen und gesamten Expression der Ziel-RNA und GFP-MS2-Fusionsprotein. Als einlternative den GFP-MS2-Systeme haben MBs ebenfalls verwendet, um RNA-Transkripte mit gentechnisch Tandemwiederholungen der komplementären Bindungsstelle in der 3&#39;-UTR 13,14 detektieren. Molecular Beacons sind Haarnadel bildenden Oligonukleotid-Sonden, die an einem Ende mit einem Quencher, und am anderen Ende mit einem fluoreszierenden Reporter markiert sind. Wenn sie nicht an das Ziel gebunden RNA des fluoreszierenden Reporter und Quencher in unmittelbarer Nähe bleiben, was zu einem Nieder fluoreszierenden Zustand. Nach der Hybridisierung werden die fluoreszierenden Reporter und Quencher auseinandergedrückt und die Fluoreszenz wiederhergestellt wird. Ähnlich der GFP-MS2 System die Bindung von mehreren molekularen Beacons auf eine einzige RNA-Transkript ergibt einen hellen fluoreszierenden Flecks, die durch Fluoreszenzmikroskopie identifiziert werden kann; Jedoch wird erwartet, dass die Hintergrundfluoreszenz zu viel niedriger aufgrund des abgeschreckten Konfiguration ungebundenen Molecular Beacons. Leider, trotz der geschickten Aktivierungsmechanismus, der in den m eingebaut istMOLEKULARE Leuchtfeuer-Design, gibt es jetzt immer mehr Hinweise, die Molecular Beacons unhybridisiert nicht in der Haarnadel-Konformation bleiben, wenn in lebende Zellen eingebracht. Daher erzeugen sie ein falsch-positives Signal, dass das Signal-zu-Hintergrund deutlich reduziert. Um diesen Nachteil zu überwinden, haben wir vor kurzem eine neue synthetische Sonde für die Bildgebung RNA in lebenden Zellen, ratiometrische bimolekularen Beacons (RBMBs; 1A) 15,16. RBMBs aus zwei 2&#39;-O-Methyl-Oligonukleotid-Stränge, die eine Hybridstruktur mit Eigenschaften von sowohl kurze Haarnadel-RNA (shRNA) und Molecular Beacons bilden zusammen. Die Schleife und Fluoreszenzaktivierungsmechanismus ist ähnlich zu dem molekularen Leuchtfeuer, während die lange doppelsträngige Domäne mit einem 3&#39;-Überhang UU ist charakteristisch shRNA. Die shRNA Features wurden entwickelt, um Kernexport, die wir steigt auf&gt; 24 h gefunden intrazellulären Lebenszeit, mit minimalen beobachtbaren Verschlechterung zu fahren, undverhindert unspezifischen Öffnung der Schleife. Als Ergebnis RBMBs eine signifikant höhere Signal-zu-Hintergrund als Molecular Beacons. Es sei darauf hingewiesen, dass RBMBs nicht unter Verwendung von DNA-Oligonukleotiden, da DNA-Sonden auf der Basis nicht die gleichen Kernexportfunktionen als RNA-basierten Sonden besitzen. Strukturell ist das RBMB Schleife in der Regel für 15 bis 21 Basen lang sein, um ein Gleichgewicht zwischen Spezifität und Selektivität bei der RNA-Hybridisierung zu schaffen. Der kurze Schaft, der aus den beiden Selbst komplementären Domänen bildet, wird in der Regel entwickelt, um 4 Basen sein. Wenn ein längerer Schaft ausgewählt wird, wird die Geschwindigkeit der Hybridisierung zwischen der RBMB Schleife und Ziel-RNA deutlich verlangsamt 17,18. Umgekehrt ist die Schmelztemperatur, wenn eine kürzere Schaft-Sequenz ausgewählt ist oft zu gering, um die Stamm-Schleifen-Struktur bei 37 ° C aufrecht zu erhalten, was zu einer hohen Hintergrundsignal. Die Spezifität der RBMB auch rotuced als die Stammlänge verkürzt. Da die Reihenfolge der RBMB Stamm-Schleifen können RBMB Leistung beeinflussen, muss sorgfältig ausgewählt werden, 19. Insbesondere sollte ideal Loop-Sequenzen minimal Sekundärstruktur haben, hybridisieren mit RNA-Sequenzen mit minimalen Sekundärstruktur, Proteinbindungsstellen zu vermeiden, und vermeiden Off-Target-Bindung. Vorhersagen der beiden RBMB und RNA-Sekundärstruktur kann mit einer Software wie mfold 20 erhalten werden. Ergänzende Off-Target-Websites identifiziert mit Hilfe eines Nukleotid-Basic Local Zuordnung Search Tool (BLAST). Jedoch wegen der Unstimmigkeiten in den Modellvorhersagen und der Schwierigkeit bei der Identifizierung von Protein-abwartend Websites, die Spezifität aller RBMBs letztlich experimentell validiert werden. Falls gewünscht, kann ein ungestillt Referenzfarbstoff, die unempfindlich gegenüber dem Hybridisierungszustand ist auf die RBMB 15 hinzugefügt werden. Die Zugabe eines Referenzfarbstoffs PROVIDE einen Marker für Sonde Lieferung und ratiometrische Bildgebung verwendet werden, wenn genauere Messungen des gesamten zellulären Fluoreszenz erforderlich sind. Die Bezugs Farbstoffen ermöglicht Messungen, um Unterschiede im Hintergrund aufgrund von Zelle zu Zelle Schwankungen in der Abgabe eingestellt werden. Wenn jedoch die Abbildung einzelnen RNA-Transkripte der Referenzfarbstoff ist nicht erforderlich. Bemerkenswert ist, können einige Referenz Farbstoffe mit dem Export von RBMBs aus dem Zellkern stören, was zu einem etwas höheren Hintergrundsignal in den Zellkern. Wenn sie richtig ausgelegt ist, kann RBMBs für Bild in einzelne RNA-Transkripte in einzelnen lebenden Zellen verwendet werden, wenn die Ziel-RNA wurde entwickelt, um mindestens vier Bindungsstellen RBMB (Abbildung 1B) 16 enthalten. RBMBs wirksam in einer Vielzahl von Zelltypen über Mikroporierung keine Wirkung auf die Lebensfähigkeit der Zellen 21 zugeführt werden, mit wenig, und quantitative Messungen der Genexpression kanninnerhalb von 30 min gewonnen. Darüber hinaus ist die Methode relativ unempfindlich RBMB Konzentration und Ziel-RNA-Niveaus, da die Fluoreszenz von ungebundenem RBMBs wirksam gequencht. Hier stellen wir eine detaillierte Beschreibung der Methodik herzustellen und zu reinigen RBMBs, sowie ein allgemeines Verfahren für die Lieferung von RBMBs in den Live-Zellen über Mikroporation und die Abbildung der einzelnen RNA-Transkripte in Echtzeit.

<table><tbody><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Life Technologies</td><td>AM9932</td><td>no DEPC-treated</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td>No Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; and Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Cary 100 UV-Vis spectrophotometer</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate dibasic</td><td>Fisher Scientific</td><td>P290-500</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Fisher Scientific</td><td>P284-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic</td><td>Fisher Scientific</td><td>S381-500</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes</td><td>Eppendorf</td><td>22364111</td><td>1.5 ml</td></tr><tr><td>Chromatography column</td><td>Kimble Chase Life Science</td><td>420400-0720</td><td>0.7 x 20 cm</td></tr><tr><td>Superdex 75 prep grade</td><td>GE healthcare</td><td>17-1044-01</td><td></td></tr><tr><td>Syringe pump</td><td>Braintree Scientific</td><td>BS-300</td><td></td></tr><tr><td>Syringe</td><td>BD</td><td>301035</td><td>60 ml, Luer-lok tip</td></tr><tr><td>Centrifugal filter units</td><td>Millipore</td><td>UFC501096</td><td>MW 10,000 cutoff</td></tr><tr><td>Centrifuge 5418</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280-5MG</td><td>lyophilized powder, g-irradiated</td></tr><tr><td>8-well chambered coverglass</td><td>Fisher Scientific</td><td>155409</td><td>Working volume 0.2-0.5 ml</td></tr><tr><td>HT1080</td><td>ATCC</td><td>CCL-121</td><td>Human Fibrosarcoma cell line</td></tr><tr><td>Cell culture flask</td><td>Corning</td><td>430639</td><td>25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11965084</td><td>High glucose</td></tr><tr><td>DMEM without phenol red</td><td>Life Technologies</td><td>21063029</td><td>High glucose</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Penecillin/streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Life Technologies</td><td>25300054</td><td>0.05% Trypsin-EDTA</td></tr><tr><td>Neon transfection system</td><td>Life Technologies</td><td>MPK5000</td><td></td></tr><tr><td>Neon transfection system kit</td><td>Life Technologies</td><td>MPK1096</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-671-10</td><td></td></tr><tr><td>Hoescht 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>IX-81 Inverted fluorescence microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SOLA light engine</td><td>Lumencor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metamorph</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Software controlling microscope</td></tr><tr><td>Immersol oil 518F</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-624-66B</td><td></td></tr></tbody></table>

real-time imaging of single engineered rna transcripts in living cells using ratiometric bimolecular beacons

Die Erkenntnis, daß sowohl die räumliche und zeitliche Regulierung der Genexpression kann wichtige Auswirkungen auf die Zellfunktion haben zur Entwicklung verschiedener Methoden geführt, einzelne RNA-Transkripte in einzelnen lebenden Zellen sichtbar. Eine vielversprechende Technik, die kürzlich beschrieben wurde, verwendet eine Oligonukleotid-basierten optischen Sonde, ratiometrisch bimolekularen Bake (RBMB), um RNA-Transkripte, die entworfen wurden, um mindestens vier Tandemwiederholungen der RBMB Zielsequenz in der 3&#39;-untranslatierten Region enthalten, zu detektieren. RBMBs sind speziell entwickelt, um ein helles Fluoreszenzsignal bei Hybridisierung an komplementäre RNA emittieren, aber ansonsten bleiben abgeschreckt. Die Verwendung einer synthetischen Sonde bei diesem Ansatz können photo, rot-verschoben und stark emittierenden organischen Farbstoffen für die Bildgebung verwendet werden. Bindung von mehreren RBMBs zu den technisch RNA-Transkripte Ergebnisse in diskreten Fluoreszenzflecken, wenn sie unter einer Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop. Folglich wird die Bewegung der einzelnen RNA-Transkripte können ohne weiteres in Echtzeit, indem sie eine Zeitserie von Fluoreszenzbildern dargestellt werden. Hier beschreiben wir die Herstellung und Reinigung von RBMBs, Lieferung in Zellen durch Mikroporation und Live-Cell-Imaging von einzelnen RNA-Transkripte.

Kurz nach der Mikroporation von HT1080-Zellen in Anwesenheit von RBMBs, um einzelne RNA-Transkripte, die entwickelt wurden mehrere RBMB Bindungsstellen in ihren 3&#39;-UTR enthalten, erscheinen als helle fluoreszierende Flecken, wenn sie von Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie (Abbildung 2) abgebildet. Während einzelne RNA-Transkripte mit nur vier RBMB Bindungsstellen in Lebendzellen abgebildet werden, die mehrere Bindungsstellen RBMB in der 3&#39;-UTR, desto stärker ist das Fluoreszenzsignal. Außerdem n...

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Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Ratiometrische bimolekularen Beacons (RBMBs), um die Bild einzigen entwickelt RNA-Transkripte in lebenden Zellen verwendet werden. Hier beschreiben wir die Herstellung und Reinigung von RBMBs, Lieferung RBMBs in Zellen von Mikroporation und fluoreszierende Abbildung einzelner RNA-Transkripte in Echtzeit.

Echtzeit-Bildgebung von Einzel Engineered RNA-Transkripte in lebenden Zellen Mit Ratiometrische Bimolekulare Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

real-time-imaging-single-engineered-rna-transcripts-living-cells

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

11.7K Aufrufe.  University of Pennsylvania.  Ratiometrische bimolekularen Beacons (RBMBs), um die Bild einzigen entwickelt RNA-Transkripte in lebenden Zellen verwendet werden. Hier beschreiben wir die Herstellung und Reinigung von RBMBs, Lieferung RBMBs in Zellen von Mikroporation und fluoreszierende Abbildung einzelner RNA-Transkripte in Echtzeit. 

Serie: Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed extensive studies of cap-dependent translation and its regulation, high resolution kinetic characterization of this translation pathway is still lacking. Recently, we developed an in vitro assay to measure cap-dependent translation kinetics with single-molecule resolution. The assay is based on fluorescently labeled antibody binding to nascent epitope-tagged polypeptide. By imaging the binding and dissociation of antibodies to and from nascent peptide&#8211;ribosome&#8211;mRNA complexes, the translation progression on individual mRNAs can be tracked. Here, we present a protocol for establishing this assay, including mRNA and PEGylated slide preparations, real-time imaging of translation, and analysis of single molecule trajectories. This assay enables tracking of individual cap-dependent translation events and resolves key translation kinetics, such as initiation and elongation rates. The assay can be widely applied to distinct translation systems and should broadly benefit in vitro studies of cap-dependent translation kinetics and translational control mechanisms.

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Tracking individual translation events allows for high-resolution kinetic studies of cap-dependent translation mechanisms. Here we demonstrate an in vitro single-molecule assay based on imaging interactions between fluorescently labeled antibodies and epitope-tagged nascent peptides. This method enables single-molecule characterization of initiation and peptide elongation kinetics during active in vitro cap-dependent translation.

Ein In Vitro Single-Molecule Imaging Assay zur Analyse von cap-dependent Translation Kinetics

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Forschung

Biochemie

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk population methods (Northern blot, PCR, and RNAseq) that measure mRNA levels lack the ability to provide information on cell-to-cell variation in responses. Precise single cell and allelic visualization and quantification is possible via single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH). RNA-FISH is performed by hybridizing target RNAs with labeled oligonucleotide probes. These can be imaged in medium/high throughput modalities, and, through image analysis pipelines, provide quantitative data on both mature and nascent RNAs, all at the single cell level. The fixation, permeabilization, hybridization and imaging steps have been optimized in the lab over many years using the model system described herein, which results in successful and robust single cell analysis of smFISH labeling. The main goal with sample preparation and processing is to produce high quality images characterized by a high signal-to-noise ratio to reduce false positives and provide data that are more accurate. Here, we present a protocol describing the pipeline from sample preparation to data analysis in conjunction with suggestions and optimization steps to tailor to specific samples.&#160;

Single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a method to accurately quantify levels and localization of specific RNAs at the single cell level. Here, we report our validated lab protocols for wet-bench processing, imaging and image analysis for single cell quantification of specific RNAs.

Einzelzellanalyse transkriptionell aktiver Allele mittels Einzelmolekül FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

Eine schnelle High-Throughput-Verfahren zur Abbildung Ribonukleoproteine ​​(RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

Biologie

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in vivo is of importance. Pol II kinetics have been measured using biochemical or molecular methods.1-3 In recent years, with the development of new visualization methods, it has become possible to follow transcription as it occurs in real time in single living cells.4 Herein we describe how to perform analysis of Pol II elongation kinetics on a specific gene in living cells.5, 6 Using a cell line in which a specific gene locus (DNA), its mRNA product, and the final protein product can be fluorescently labeled and visualized in vivo, it is possible to detect the actual transcription of mRNAs on the gene of interest.7, 8 The mRNA is fluorescently tagged using the MS2 system for tagging mRNAs in vivo, where the 3'UTR of the mRNA transcripts contain 24 MS2 stem-loop repeats, which provide highly specific binding sites for the YFP-MS2 coat protein that labels the mRNA as it is transcribed.9 To monitor the kinetics of transcription we use the Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) method. By photobleaching the YFP-MS2-tagged nascent transcripts at the site of transcription and then following the recovery of this signal over time, we obtain the synthesis rate of the newly made mRNAs.5 In other words, YFP-MS2 fluorescence recovery reflects the generation of new MS2 stem-loops in the nascent transcripts and their binding by fluorescent free YFP-MS2 molecules entering from the surrounding nucleoplasm. The FRAP recovery curves are then analyzed using mathematical mechanistic models formalized by a series of differential equations, in order to retrieve the kinetic time parameters of transcription.

RNA polymerase II transcriptional kinetics are measured on specific genes in living cells. mRNAs transcribed from the gene of interest are fluorescently tagged and using Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) the in vivo kinetics of transcriptional elongation are obtained.

Die Messung der Kinetik der mRNA Transkription in einzelnen lebenden Zellen

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

<meta charset="utf8"></head><body>Zweifarbige Endmarkierung und Vesikelverkapselung von RNAs für smFRET-TIRF-Studien

Fluorescent End-Labeling and Encapsulation of Long RNAs for Single-Molecule FRET-TIRF Microscopy

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) excels in studying dynamic biomolecules by allowing precise observation of their conformational changes over time. To monitor RNA dynamics with smFRET, we developed a method to covalently label RNAs at their termini with a FRET pair of fluorophores. This direct end-labeling strategy targets the 5&#39;-phosphate by carbodiimide (EDC)/N-hydroxysuccinimide (NHS) activation and the 3&#39;-ribose by periodate oxidation, which can be adapted to other RNAs regardless of their size and sequence to study them independently of artificial modifications. Furthermore, the 5&#39;-EDC/NHS activation is of general interest to all nucleic acids with a 5&#39;-phosphate. The use of commercially available chemicals eliminates the need to synthesize RNA-specific probes.
Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy requires the surface-immobilized molecules of interest to be within the evanescent field to be illuminated. A sophisticated way of keeping the RNA molecules within the evanescent field is to encapsulate them in phospholipid vesicles. Encapsulation benefits from the best of both worlds, tethering the molecule to the surface while enabling free diffusion of the molecule. We ensure that each vesicle contains only a single RNA molecule, enabling single-molecule imaging. Upon dual-end labeling and encapsulation of the RNA of interest, smFRET measurements offer a dynamic and detailed view of RNA behavior.

<meta charset="utf8"></head><body>Fluoreszierende Endmarkierung und Verkapselung von langen RNAs für die Einzelmolekül-FRET-TIRF-Mikroskopie

This article describes the dual-color labeling of long RNAs at termini positions and their surface immobilization via encapsulation in phospholipid vesicles for single-molecule FRET TIRF microscopy applications. Combining these techniques enables precise visualization and analysis of RNA dynamics at the single-molecule level.

Fluoreszierende Endmarkierung und Verkapselung von langen RNAs für die Einzelmolekül-FRET-TIRF-Mikroskopie

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) excels in studying dynamic biomolecules by allowing precise observation of their ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method makes it possible to count the numbers of protein molecules produced in one cell during sequential, five-minute time windows. It requires a fluorescence microscope with laser excitation power density of ~0.5 to 1 kW/cm2, which is sufficiently sensitive to detect single fluorescent protein molecules in live cells. The fluorescent reporter used in this method consists of three parts: a membrane targeting sequence, a fast-maturing, yellow fluorescent protein and a protease recognition sequence. The reporter is translationally fused to the N-terminus of a protein of interest. Cells are grown on a temperature-controlled microscope stage. Every five minutes, fluorescent molecules within cells are imaged (and later counted by analyzing fluorescence images) and subsequently photobleached so that only newly translated proteins are counted in the next measurement.
Fluorescence images resulting from this method can be analyzed by detecting fluorescent spots in each image, assigning them to individual cells and then assigning cells to cell lineages. The number of proteins produced within a time window in a given cell is calculated by dividing the integrated fluorescence intensity of spots by the average intensity of single fluorescent molecules. We used this method to measure expression levels in the range of 0-45 molecules in single 5 min time windows. This method enabled us to measure noise in the expression of the &lambda; repressor CI, and has many other potential applications in systems biology.

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC), to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method has been used to follow the stochastic expression dynamics of a transcription factor, the &lambda; repressor CI 1.

Einzel-Molekül-Imaging der Genregulation<em&gt; In vivo</em&gt; Verwenden cotranslationalen Aktivierung durch Spaltung (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene expression. Along with a better understanding of the involved molecular mechanisms, precise measurements of the underlying kinetics have become increasingly important. Here, these powerful methodologies face major limitations due to intrinsic properties of the template samples they study, i.e. total cellular RNA. In many cases changes in total cellular RNA occur either too slowly or too quickly to represent the underlying molecular events and their kinetics with sufficient resolution. In addition, the contribution of alterations in RNA synthesis, processing, and decay are not readily differentiated.
We recently developed high-resolution gene expression profiling to overcome these limitations. Our approach is based on metabolic labeling of newly transcribed RNA with 4-thiouridine (thus also referred to as 4sU-tagging) followed by rigorous purification of newly transcribed RNA using thiol-specific biotinylation and streptavidin-coated magnetic beads. It is applicable to a broad range of organisms including vertebrates, Drosophila, and yeast. We successfully applied 4sU-tagging to study real-time kinetics of transcription factor activities, provide precise measurements of RNA half-lives, and obtain novel insights into the kinetics of RNA processing. Finally, computational modeling can be employed to generate an integrated, comprehensive analysis of the underlying molecular mechanisms.

Total cellular RNA provides a poor template for studying short-term changes in RNA synthesis and decay as well as the kinetics of RNA processing. Here, we describe metabolic labeling of newly transcribed RNA with 4-thiouridine followed by thiol-specific biotinylation and purification of newly transcribed RNA allowing to overcome these limitations.

Metabolische Markierung der neu transkribierten RNA für High Resolution Gene Expression Profiling von RNA Synthese, Verarbeitung und Decay in Zellkultur

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH allows the measurement of cell-to-cell variability in mRNA copy number of genes of interest, as well as the subcellular location of the transcripts. The main steps involved are fixation of the bacterial cell culture, permeabilization of cell membranes, and hybridization of the target transcripts with sets of commercially available short fluorescently-labeled oligonucleotide probes. smFISH can allow the imaging of the transcripts of multiple genes in the same cell, with limitations imposed by the spectral overlap between different fluorescent markers. Following completion of the protocol illustrated below, cells can be readily imaged using a microscope coupled with a camera suitable for low-intensity fluorescence. These images, together with cell contours obtained from segmentation of phase contrast frames, or from cell membrane staining, allow the calculation of the mRNA copy number distribution of a sample of cells using open-source or custom-written software. The labeling method described here can also be applied to image transcripts with stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

This manuscript describes a method for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts with fluorescently-labeled DNA probes, for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH is a visualization method that allows the simultaneous detection, localization, and quantification of single mRNA molecules in fixed individual cells.

Methode zur Kennzeichnung Transkripte in einzelnen Escherichia coli Zellen für Einzelmolekül-Fluoreszenz In Situ Hybridisierung Experimente

Echtzeit-Bildgebung von Einzel Engineered RNA-Transkripte in lebenden Zellen Mit Ratiometrische Bimolekulare Beacons

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Ein In Vitro Single-Molecule Imaging Assay zur Analyse von cap-dependent Translation Kinetics

Einzelzellanalyse transkriptionell aktiver Allele mittels Einzelmolekül FISH

Eine schnelle High-Throughput-Verfahren zur Abbildung Ribonukleoproteine (RNPs) on Human pre-mRNA

Die Messung der Kinetik der mRNA Transkription in einzelnen lebenden Zellen

Fluoreszierende Endmarkierung und Verkapselung von langen RNAs für die Einzelmolekül-FRET-TIRF-Mikroskopie

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Fluoreszierende Endmarkierung und Verkapselung von langen RNAs für die Einzelmolekül-FRET-TIRF-Mikroskopie

Einzel-Molekül-Imaging der Genregulation

Metabolische Markierung der neu transkribierten RNA für High Resolution Gene Expression Profiling von RNA Synthese, Verarbeitung und Decay in Zellkultur

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