Unser Protokoll wird den Forschern helfen, die physiologischen Auswirkungen von drei verschiedenen Knochenmarktransplantationsmethoden zu verstehen und wie sie die experimentellen Ergebnisse bei klonaler Hämatopoese beeinflussen. Die Knochenmarktransplantation mit Gesamtkörperstrahlung kann sich negativ auf herz-kardiovaskuläre Organe auswirken und die Pathogenese der Krankheit verändern. Daher hat unser Labor zwei alternative Methoden entwickelt, um mögliche Nebenwirkungen zu minimieren oder zu vermeiden.
Die Verfahren werden von Eunbee Park, einer Doktorandin, und Megan Evans, einer Postdoktorandin, beide aus meinem Labor, demonstriert Für Thorax- und Bauchabschirmung, platzieren Sie die verstellbare Tablett und den Röntgenstrahler im richtigen Abstand, um eine gleichmäßige Bestrahlung zu erreichen. Und legen Sie die betäubten Mäuse auf eine flache LED-Platte, die in Rückenlage umgekehrt zueinander ist. Befestigen Sie die Pfoten mit Klebeband an der Platte und platzieren Sie die LED-Abschirmung so, dass das untere Ende mit dem Xiphisternumknochen ausgerichtet ist und das obere Ende des Bleischildes in der Nähe des Thymus sitzt.
Setzen Sie die Mäuse nach der Abschirmung in den Bestrahlungskörper und setzen Sie die Tiere zwei 5,5 grauen Bestrahlungsfraktionen aus, die durch ein Intervall von vier bis 24 Stunden getrennt sind. Zur Kopfabschirmung die vier Pfoten der Maus vorsichtig an den Bauch kleben. Legen Sie die Maus in einen konischen Rückhaltearm und schieben Sie den Rückhalteer in den Schlitz innerhalb des Bleischildes, so dass der Kopf und die Ohren der Maus vollständig bedeckt sind, so dass der Rest des Mauskörpers für eine Strahlung freigelegt bleibt.
Nach der Abschirmung legen Sie die Mäuse in den Bestrahlungskörper und setzen die Tiere 5,5 grauen Fraktionen einer Strahlung aus, die durch ein Vier- bis 24-Stunden-Intervall getrennt sind. Nach jeder Strahlenbehandlung legen Sie die betäubten Mäuse in einen Käfig auf einer beheizten Matte mit Überwachung, bis sie vollständig genesen sind. Um die Knochen zu isolieren, desinfizieren Sie die Haut der Spendermaus mit 70% Ethanol und machen Sie einen kleinen quer verlaufenden Hautschnitt unterhalb des Brustkorbs.
Halten Sie die Haut auf beiden Seiten des Schnitts fest, reißen Sie in entgegengesetzte Richtungen zu Kopf und Füßen und schälen Sie die Haut von allen Gliedmaßen. Schneiden Sie über die Schultern und Ellbogengelenke und verwenden Sie ein Labortuch, um die angeschlossenen Muskeln und das Bindegewebe aus den Humeri zu entfernen. Verrenken Sie vorsichtig die Gelenke zwischen Femur und Hüftknochen.
Und verwenden Sie eine stumpfe Schere, um entlang der Oberschenkelköpfe zu schneiden, um die Beine zu lösen. Schneiden Sie über das Kniegelenk, um den Femur und das Schienbein zu trennen. Und verwenden Sie Labortücher, um die angeschlossenen Muskeln und das Bindegewebe vorsichtig aus den Knochen zu entfernen.
Ziehen Sie dann die Knochen von Mäusen des gleichen Genotyps in einzelne 50-Milliliter-Konusenröhrchen, die 20 Milliliter eiskaltes steriles PBS auf Eis enthalten. Um die Knochenmarkzellen in einem Gehäuse der Biosicherheitsklasse zwei zu isolieren, verwenden Sie eine 18-Gauge-Nadel, um ein kleines Loch in den Boden eines sterilen 500-Mikroliter-Mikroröhrchens zu bohren. Und legen Sie das Röhrchen in ein einzelnes steriles 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit 100 Mikrolitern eiskaltem sterilem PBS.
Wenn alle Röhrchen vorbereitet sind, entfernen Sie das PBS aus dem Röhrchen, das die isolierten Knochen enthält, und übertragen Sie die Knochen auf eine sterile 100-Millimeter-Zellkulturschale. Verwenden Sie eine feine Zange und eine kleine Schere, um die Epiphyse vorsichtig von den Enden jedes Knochens zu entfernen, und legen Sie bis zu sechs Knochen in jedes 500-Mikroliter-Röhrchen. Wenn alle Knochen geschnitten wurden, extrahieren Sie die Knochenmarkzellen durch Zentrifugation.
Wenn der gesamte Markinhalt entfernt wurde, sollten die Knochen weiß und durchscheinend mit einem relativ großen roten Pellet am Boden des 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchens erscheinen. Für die Knochenmarkzelltransplantation verdünnen Sie die isolierten Knochenmarkzellen in serumfreien RPMI-Medien und laden 200 Mikroliter der Zellsuspension in eine 0,5 Milliliter Insulinspritze pro Maus, die injiziert werden soll. Nachdem Sie eine mangelnde Reaktion auf den Pedalreflex bestätigt haben, injizieren Sie langsam das gesamte Zellvolumen in die Retroorbitalvene jedes betäubten Empfängertiers.
Dann legen Sie einen Tropfen Proparacain auf das Auge zur Schmerzlinderung. Und erlauben Sie der Maus, das Bewusstsein wiederzuerlangen, während sie überwacht wird. Es sollte die Wirkung von drei BMT-Vorkonditionierungsmethoden auf die Spenderzelltransplantation verglichen werden.
Die Fraktionen der Spenderzellen im peripheren Blut und Herzgewebe wurden einen Monat nach der BMT mittels Durchflusszytometrie analysiert. In dieser repräsentativen Analyse wurden im peripheren Blut von Empfängermäusen, die eine Ganzkörperbestrahlung erhielten, Monozyten, Neutrophile und B-Zellen weitgehend abgetragen und durch die Nachkommen von Spenderknochenmarkzellen ersetzt. Darüber hinaus wurden die ansässigen Empfänger-Herzmonozyten- und Neutrophilenpopulationen fast vollständig durch Spenderzellen ersetzt.
In der teilweise abgeschirmten Bestrahlungsgruppe war der vom Spender abgeleitete kardiale Immunzellersatz bescheiden. Die Knochenmarkzellen der Empfängermaus in den abgeschirmten Regionen trugen wahrscheinlich zu einem niedrigeren Niveau der peripheren Blutrekonstitution bei als Mäuse, die eine Ganzkörperbestrahlung erhielten. In der Gruppe ohne BMT-Vorkonditionierung waren Spenderzellen vier Wochen nach bmT im peripheren Blut und in den Herzen der Empfängermäuse nachweisbar.
Darüber hinaus dehnten sich Tet2-defiziente Spenderzellen im Laufe der Zeit allmählich aus. Im Vergleich dazu zeigten Empfängermäuse, die mit Wildtyp-Spenderzellen transplantiert wurden, eine minimale klonale Ausdehnung der Spenderzellen. Die Optimierung dieser experimentellen Modelle wird strengere Studien der klonalen Hämatopoese-Treibergene ermöglichen, die zu allen Todesursachen wie Kardiometabolischen Erkrankungen und Krebs beitragen.
Wir hoffen, dass unsere Protokolle es den Forschern ermöglichen werden, die klonale Hämatopoese zu untersuchen, um zu untersuchen, wie sie zu Herz-Kreislauf-Erkrankungen und anderen Krankheitszuständen beiträgt.
