הפרוטוקול שלנו יעזור לחוקרים להבין את ההשפעות הפיזיולוגיות של שלוש שיטות שונות להשתלת מח עצם וכיצד הן משפיעות על תוצאות הניסוי בהמטוטופיזיס שיבוטים. השתלת מח עצם קרינת הגוף הכוללת יכולה להשפיע לרעה על איברי לב וכלי דם ולשנות פתוגנזה של מחלות. לכן, המעבדה שלנו פיתחה שתי שיטות חלופיות כדי למזער או למנוע תופעות לוואי אפשריות.
הדגמת ההליכים תהיה Eunbee Park סטודנט לתואר שני, ומייגן אוונס עמית פוסט דוקטורט, הן מהמעבדה שלי עבור בית החזה ואת הבטן מיגון, למקם את המגש מתכוונן ואת הקרנת רנטגן במרחק הנכון כדי להשיג הקרנה אחידה. ומניחים את העכברים המרדים על צלחת LED שטוחה הפוכה זה לזה בתנוחה העל-חושית. אבטחו את כפות הרגליים לצלחת באמצעות סרט הדבקה, והניחו את מיגון הלד כך שהקצה התחתון יתיישר עם עצם ה- xiphisternum והקצה העליון של מגן העופרת יושב ליד התימוס.
לאחר המיגון, הנח את העכברים לתוך ההקרנה וחשוף את בעלי החיים לשניים, 5.5 שברי הקרנה אפורים המופרדים במרווח של ארבע עד 24 שעות. למיגון ראש, בזהירות קלטת ארבע כפות של העכבר לבטן. הנח את העכבר במרסן חרוט והחלק את המרסן לתוך החריץ בתוך מגן העופרת כך שראשו ואוזניו של העכבר מכוסים לחלוטין, מה שמשאיר את שאר גוף העכבר חשוף לקרינה.
לאחר ההגנה מניחים את העכברים לתוך ההקרנה וחושפים את בעלי החיים ל-5.5 שברים אפורים של קרינה המופרדים במרווח של 4 עד 24 שעות. לאחר כל טיפול קרינה, מניחים את העכברים מורדמים בכלוב על מחצלת מחוממת עם ניטור עד החלמה מלאה. כדי לבודד את העצמות, לחטא את העור של העכבר התורם עם 70% אתנול ולעשות חתך עור רוחבי קטן מתחת לכלוב הצלעות.
מחזיקים את העור בחוזקה משני צדי החתך, קורעים בכיוונים מנוגדים לכיוון הראש והרגליים ומקלפים את העור מכל הגפיים. חותכים מעל הכתפיים ומפרקי המרפק, ומשתמשים במגבון מעבדה כדי להסיר את השרירים המחוברים ואת רקמות החיבור מההאמרי. בזהירות לפרוק את המפרקים בין עצם הירך ועצמות הירך.
ולהשתמש במספריים קהים כדי לחתוך לאורך ראשי הירך כדי לנתק את הרגליים. חותכים מעל מפרק הברך, כדי להפריד את עצם הירך ואת השוקה. ולהשתמש מגבוני מעבדה כדי להסיר בזהירות את השרירים המצורפים ורקמות חיבור מהעצמות.
ואז למשוך את העצמות מעכברים של אותו גנוטיפ לתוך צינורות חרוטים בודדים 50 מיליליטר המכילים 20 מיליליטר של PBS סטרילי קר כקרח על קרח. כדי לבודד את תאי מח העצם בארון בדרגה 2 של בטיחות ביולוגית, השתמש במחט 18 מד כדי ליצור חור קטן בתחתית צינור מיקרו סטרילי של 500 מיקרוליטר. ומניחים את הצינור לתוך צינור צנטריפוגה מיקרו סטרילי 1.5 מיליליטר בודדים המכיל 100 מיקרוליטרים של PBS סטרילי קר כקרח.
כאשר כל הצינורות הוכנו, להסיר את PBS מהצינור המכיל את העצמות המבודדות ולהעביר את העצמות על צלחת סטרילית 100 מילימטר תרבות התא. השתמש מלקחיים עדינים ומספריים קטנים כדי להסיר בזהירות את האפיפיזה מקצות כל עצם, ומניחים עד שש עצמות לתוך כל צינור 500 microliter. כאשר כל העצמות נחתכו, לחלץ את תאי מח העצם על ידי צנטריפוגה.
אם כל תכולת מח העצם הוסרה, העצמות אמורות להיראות לבנות ושקוף עם גלולה אדומה גדולה יחסית בתחתית צינור הצנטריפוגה מיקרו 1.5 מיליליטר. להשתלת תאי מח עצם, לדלל את תאי מח העצם המבודדים במדיה RPMI ללא סרום, ולטעון 200 microliters של השעיית התא לתוך אחד 0.5 מזרק אינסולין מיליליטר לכל עכבר להיות מוזרק. לאחר אישור חוסר תגובה רפלקס הדוושה, לאט להזריק את כל נפח התאים לתוך הווריד מסלולי רטרו של כל בעל חיים מורדם.
ואז למקם טיפה של proparacaine על העין להקלה על הכאב. ולאפשר לעכבר לחזור להכרה בזמן שהוא במעקב. כדי להשוות את ההשפעה של שלוש שיטות תנאים קדם-תנאי BMT על תחריט תא התורם.
השברים של תאים תורמים בדם היקפי ורקמת לב נותחו על ידי cytometry זרימה בחודש אחד לאחר BMT. בניתוח מייצג זה, בדם ההיקפי של עכברים נמענים שקיבלו הקרנת גוף כוללת, מונוציטים, נויטרופילים ותאי B היו במידה רבה ablated והוחלפו על ידי צאצאים של תאים נגזר מח עצם התורם. בנוסף, אוכלוסיות מונוציט ונויטרופילים לבביים של הנמען הדייר הוחלפו כמעט לחלוטין בתאים שמקורם בתורם.
בקבוצת ההקרנה המוגנת חלקית, התחלופה של תאי החיסון הלבביים שנבעה מהתורם הייתה צנועה. תאי מח העצם של העכבר הנמען בתוך האזורים המוגנים תרמו ככל הנראה לרמה הנמוכה יותר של שחזור דם היקפי בהשוואה לעכברים שקיבלו הקרנת גוף כוללת. בקבוצה ללא תנאי BMT, תאים שמקורם בתורם היו ניתנים לגילוי בדם ובלבבות ההיקפיים של עכברים נמענים בארבעה שבועות לאחר BMT.
בנוסף, תאי התורמים של Tet2 התרחבו בהדרגה עם הזמן. לשם השוואה, עכברים נמענים חרוטים בתאי תורמים מסוג בר הראו התרחבות מינימלית של תאי תורמים. הם אופטימיזציה של מודלים ניסיוניים אלה יאפשר מחקרים קפדניים יותר של הגנים נהג hematopoiesis שיבוט שתורמים לכל לגרום לתמותה כגון מחלות לב-מטבוליות וסרטן.
אנו מקווים כי הפרוטוקולים שלנו יאפשרו לחוקרים לחקור hematopoiesis שיבוט לחקור כיצד הוא תורם למחלות לב וכלי דם ומחלות אחרות.
