In-vivo-Osteo-Organoid-Ansatz zur Gewinnung therapeutischer hämatopoetischer Stamm-/Vorläuferzellen

Wir beschäftigen uns seit langem mit der Erforschung von Biomaterialien und führen das bahnbrechende Konzept ein, dass Materialbiologen bei der Entwicklung von Viren, aktiven Knochenreparaturmaterialien und Technologen für Wachstumsfaktor, Vorbereitung und Aktivierung tätig sind. Wir haben einen In-vivo-Osteo-Organoid-Ansatz entwickelt, bei dem bioaktive Materialien verwendet werden, um eine On-Demand-Produktion von Autoknötchen, Geweben und Zellen für die Behandlung von Krankheiten zu erreichen. Die traditionelle Technologie der individuellen Vermehrung von Stammzellen stößt bei der Aufrechterhaltung der physiologischen Funktionen der Stammzellen an ihre Grenzen.

Unser Protokoll konstruiert die Mikroumgebung einer einzelnen Kultur, um eine große Menge an Stammzellen zu gewährleisten und gleichzeitig ihren Stimulus zu erhalten. Legen Sie zunächst die rekombinante Humanstammlösung und den ungeöffneten Gelatineschwamm auf eine sterile, saubere Bank. Schneiden Sie den Gelatineschwamm mit einer sterilisierten Schere in 48 gleichmäßig große Stücke und geben Sie sie auf eine 48-Well-Platte.

Pipettieren Sie die rekombinante Stammlösung mehrmals, um sie gründlich zu mischen. Aspirieren Sie 30 Mikroliter der Lösung und geben Sie sie tropfenweise zum Gelatineschwamm. Versiegeln Sie dann die 48-Well-Platte mit einer Schicht Parafilm.

Nehmen Sie die Platte von der Reinbank und stellen Sie sie auf eine Temperatur von minus 20 Grad Celsius. Zu Beginn bringen Sie die anästhesierte Maus in den Operationsbereich und positionieren sie in der rechten seitlichen Liegeposition, um das bioaktive Gerüst leicht in das linke Bein zu implantieren. Rasieren Sie mit einer Rasiermaschine die Haare des linken Beins und desinfizieren Sie die rasierte Stelle mit abwechselnden Runden Chlorhexidin und Alkohol, jeweils dreimal.

Führen Sie nach dem Schnitt eine Augenschere in Richtung Tibia in den Muskel des Beutels ein, um Platz für eine spätere Materialimplantation zu schaffen. Nehmen Sie nun das vorbereitete bioaktive Gerüst, das mit rekombinantem Menschen beladen ist, und drücken Sie es mit einer Augenzange in eine zylindrische Form. Implantieren Sie das Gerüst in die Muskeltasche entlang des zuvor entstandenen Schlitzes.

Nach 12 Wochen nach der Implantation betäuben Sie die Maus und trennen Sie vorsichtig die hintere Gliedmaße vom Rumpf. Mit einer Minischere wird das Muskelgewebe der Osteo-Organoide akribisch entfernt. Entfernen Sie anhaftende Weichteile mit Gaze, um eine saubere Osteoorganoid-Probe zu gewährleisten.

Einen Teil der Osteoorganoide für 24 Stunden bei Raumtemperatur für die histologische Analyse in 4%iger Paraformaldehydlösung fixieren. Zu Beginn ernten Sie Osteo-Organoide von Mäusen, denen ein Gerüst implantiert wurde, das rekombinante menschliche Osteo-Organoide enthält, geben Sie Osteo-Organoide in einen Mörser und fügen Sie einen Milliliter HBSS ohne Kalzium- und Magnesiumionen hinzu. Zerkleinern Sie die Proben mit einer chirurgischen Schere und zerkleinern Sie sie dann vorsichtig in einem Mörser und Stößel.

Das Ergebnis in Zellsuspension durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb leiten. Dann zentrifugieren Sie es fünf Minuten lang bei 300 g bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie anschließend den Überstand.

Suspendieren Sie die Zellpellets in 300 Mikrolitern HBSS und mischen Sie sie gut, um eine gleichmäßige Zellsuspension zu erhalten. Legen Sie die anästhesierte, subletal bestrahlte Maus auf ein Heizkissen, das auf 37 Grad Celsius eingestellt ist. Nachdem Sie die vollständige Anästhesie sichergestellt haben, positionieren Sie die Maus in linker Seitenlage, wobei der Kopf nach rechts gerichtet ist.

Mit einer Ein-Milliliter-Spritze und einer 25-Gauge-Nadel werden 200 Mikroliter der vorbereiteten Zellsuspension aspiriert. Um das Auge für den Eingriff freizulegen, legen Sie einen Finger auf den Oberkopf und entlang der Kieferpartie und ziehen Sie die Haut vorsichtig zurück und unten. Führen Sie die Nadel vorsichtig mit der Fase nach unten in einem Winkel von ca. 30 Grad in den medialen Canthus des Auges ein.

Folgen Sie mit der Nadel vorsichtig der Kontur des Augapfels, bis sie den Ansatz des Auges erreicht. Injizieren Sie die Zellsuspension sanft und langsam in den dafür vorgesehenen Bereich. Bringen Sie die Maus nach Abschluss der Injektion wieder in ihren Käfig zurück, damit sie sich erholen kann.