Name: perfusion and inflation of the mouse lung for tumor histology
Uploaded: 2020-08-06T15:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 24 s
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Die in dieser Publikation berichtete Forschung wurde vom National Center for Advancing Translational Sciences unter der AuszeichnungUL1TR003096 (MDE), National Heart, Lung, and Blood Institute Predoctoral Fellowship in Lung Diseases Training Program 5T32HL134640 (MLD) unterstützt.

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Alabama in Birmingham genehmigt.
1. Experimentelles Protokoll
<ol><li>Opfern Sie die Maus mit einer zugelassenen IACUC-Methode. Hier verwendeten wir zervikale Dislokation einer Maus mit 5% Isofluran anästhetisiert. Verwenden Sie eine geeignete Maus für die Studie; hier verwenden wir eine 8 Wochen alte FVB-Maus</li>
	<li>Mit chirurgischer Schere, machen Sie einen 3,5-5 mm horizontalen Schnitt in der Mitte des Unterbauchs. Als nächstes legen Sie chirurgische Schere in das kleine Loch aus Schnitt erstellt und schneiden vertikal die mittlere Mittellinie bis knapp unter dem Hals der Maus.</li>
	<li>Ziehen Sie die Haut mit den Fingern zurück und inspizieren Sie die axillären Lymphknoten.</li>
	<li>Mit chirurgischer Schere, machen Sie einen 3,5 mm seitlichen Schnitt, um die Bauchhöhle zu öffnen, und schneiden Sie dann in vorderer Richtung bis zum Boden des Thorax. Inspizieren Sie die Organe in der Bauchhöhle: Leber, Milz, Nieren, etc.</li>
	<li>Mit der Flachen der chirurgischen Schere, oder mit Zangen, bewegen Sie die Leber, um das Zwerchfell freizulegen. Prüfen Sie das Zwerchfell auf Tumorwachstum oder Metastasen. Schnipsen Sie dann vorsichtig die Membran auf der rechten Seite des Bedieners, so dass es sich ausdehnen kann. Schneiden Sie das Zwerchfell vorsichtig von rechts nach links, um die Brusthöhle und die Lunge freizulegen. Achten Sie darauf, die Lunge nicht zu schneiden.</li>
	<li>Schneiden Sie durch das seitliche Extrem des linken Rippenkäfigs (rechts) des Bedieners, um den linken Lappen der Lunge zu inspizieren.</li>
	<li>Bewegen Sie die rechten Lungenlappen vorsichtig aus dem Weg und schneiden Sie das seitliche Extrem des rechten Rippenkäfigs auf und entfernen Sie den Rippenkäfig. HINWEIS: Die Entfernung des Rippenkäfigs ist optional, obwohl die Entfernung eine klarere Sicht auf die spätere Lungeninflation ermöglicht.<ol>
<li>Wenn frisches oder gefrorenes Lungengewebe erforderlich ist, verwenden Sie Hämostatzangen, um den Bronchus des linken Lappens zu klemmen und die linke Lunge mit einer chirurgischen Schere vor der Perfusion zu resektieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mit der Zange, um das Gewebe zu heben, das die Luftröhre bedeckt, schneiden Sie überschüssiges Gewebe weg. Dann schneiden Sie vorsichtig das dünne Gewebe Auskleidung der Luftröhre, um die Atemwege auszusetzen.</li>
	<li>Schneiden Sie die Nierenarterie mit chirurgischer Schere durch.</li>
	<li>Um die Lunge zu durchdringen, verwenden Sie eine 3 ml Spritze mit einer 22 G Nadel, um 1x PBS mit 10 U/ml Heparin in die rechte Herzkammer zu injizieren. Durchdringen Sie die Lunge mit PBS/Heparin langsam bei ca. 300 l/s. Die Lunge wird häufig weiß. In diesem Schritt werden in der Regel 2,5 ml PBS verwendet.</li>
	<li>Für die Lungeninflation verwenden Sie eine 3 ml Spritze mit einer 22 G Nadel, diesmal parallel zur Luftröhre gehalten. Setzen Sie die Nadel in die Luftröhre ein und injizieren Sie 10% Formalin mit einer Durchflussrate von nicht mehr als 200 l/s, bis die Lunge vollständig aufgeblasen ist. Sobald die Lunge aufgeblasen ist, wird Formalin aus der Luftröhre zurückfließen. Halten Sie die Nadel noch ein paar Sekunden an Ort und Stelle und ziehen Sie sich dann zurück.<ol>
<li>(Optional) Vor dem Zurückziehen der Nadel- und Lungeninflation verwenden Sie Nahtgewinde, um die Luftröhre abzubinden. Um dies zu erreichen, verwenden Sie 4 Zoll Nahtgewinde halten den Punkt des Gewindes mit einem kleinen Paar Zangen. Legen Sie den Faden auf die Dorsalseite der Luftröhre und ziehen Sie durch, um eine Schleife um die Nadel zu machen. Als nächstes machen Sie einen Überhandknoten um die Nadel. Knoten fest ziehen, Nadel aus Luftröhre entfernen, Knoten schließen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwenden Sie Zangen, um das Herz zu heben, setzen Sie chirurgische Schere direkt hinter der Lunge, und schneiden Sie Bindegewebe, während das Herz angehoben, um die Lunge zu resektieren.</li>
	<li>Schneiden Sie das Herz, um es aus der Lunge zu entfernen.</li>
	<li>Legen Sie die Lunge eine Kassette mit der Maus-ID oder Studien-ID beschriftet. Legen Sie die Kassette in 10% gepuffertes Formalin und fixieren Sie für 24-48 h. Lungen können auf Wunsch über ein Jahr fixativ belassen werden.</li>
	<li>Übertragen Sie die Kassette mit der Lunge auf 70% Ethanol und gehen Sie mit der Verarbeitung für die Histologie.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hsia, C. C., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R., Structure, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+official+research+policy+statement+of+the+American+Thoracic+Society/European+Respiratory+Society:+standards+for+quantitative+assessment+of+lung+structure.">An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).</li><li>Vasilescu, D. M., Knudsen, L., Ochs, M., Weibel, E. R., Hoffman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+murine+lung+preparation+for+detailed+structural+evaluation+via+micro-computed+tomography.">Optimized murine lung preparation for detailed structural evaluation via micro-computed tomography.</a> Journal of Applied Physiology. 112 (1), 159-166 (2012).</li><li>Blumler, P., Acosta, R. H., Thomas-Semm, A., Reuss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+fixation+for+the+preservation+of+air+spaces.">Lung fixation for the preservation of air spaces.</a> Experimental Lung Research. 30 (1), 73-82 (2004).</li><li>Oldmixon, E. H., Suzuki, S., Butler, J. P., Hoppin, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion+dehydration+fixes+elastin+and+preserves+lung+air-space+dimensions.">Perfusion dehydration fixes elastin and preserves lung air-space dimensions.</a> Journal of Applied Physiology. 58 (1), 105-113 (1985).</li><li>Braber, S., Verheijden, K. A., Henricks, P. A., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+fixation+methods+on+lung+morphology+in+a+murine+model+of+emphysema.">A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (6), 843-851 (2010).</li><li>Renne, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendation+of+optimal+method+for+formalin+fixation+of+rodent+lungs+in+routine+toxicology+studies.">Recommendation of optimal method for formalin fixation of rodent lungs in routine toxicology studies.</a> Toxicologic Pathology. 29 (5), 587-589 (2001).</li><li>Limjunyawong, N., Mock, J., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instillation+and+Fixation+Methods+Useful+in+Mouse+Lung+Cancer+Research.">Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e52964 (2015).</li><li>Lum, H., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+10%+formalin+fixation+on+fixed+lung+volume+and+lung+tissue+shrinkage.+A+comparison+of+eleven+laboratory+species.">Effects of 10% formalin fixation on fixed lung volume and lung tissue shrinkage. A comparison of eleven laboratory species.</a> American Review of Respiratory Disease. 132 (5), 1078-1083 (1985).</li><li>Edmonds, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-31+initiates+lung+tumorigenesis+and+promotes+mutant+KRAS-driven+lung+cancer.">MicroRNA-31 initiates lung tumorigenesis and promotes mutant KRAS-driven lung cancer.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (1), 349-364 (2016).</li><li>Zhao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wogonin+suppresses+melanoma+cell+B16-F10+invasion+and+migration+by+inhibiting+Ras-medicated+pathways.">Wogonin suppresses melanoma cell B16-F10 invasion and migration by inhibiting Ras-medicated pathways.</a> PLoS One. 9 (9), 106458 (2014).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Das oben beschriebene Verfahren zur Perfusion, Inflation und Fixierung der Mauslungen ist ideal für die schnelle und effiziente Vorbereitung der Mauslungen für die Lungentumorhistologie und Pathologieanalyse. Das Verfahren erfordert keine spezielle Ausrüstung und kann in weniger als 6 Minuten pro Maus durchgeführt werden. Das Verfahren erfordert weder ein festes Volumen für die Inflation noch einen konstanten Flüssigkeitsdruck. Da dieses Verfahren nicht standardisiert ist, wird es nicht für diejenigen empfohlen, d...

Eine Vielzahl von Mausmodellen der Lungenonkogenese und Krebsmetastasen in die Lunge gibt es von komplexen GEMMs über krebserregende Modelle bis hin zu syngenischen und Xenograft-Modellen, bei denen Krebszellen über intrakardiale, intrathorakale, die Schwanzvene oder andere Methoden zur Etablierung von Tumoren in der Lunge injiziert werden. Alle diese Modelle teilen die gemeinsame Notwendigkeit der histologischen Bewertung der Lungenhistologie und Pathologie. Daher ist es notwendig, eine robuste, aber schnelle Methode zu haben, um Nekropsien von Mäusen durchzuführen, während die Lunge durchsetzt wird, um überschüssiges Blut zu entfernen, und die Lunge aufzublasen und zu fixieren, um die Lungenarchitektur klar zu visualisieren. Geschwindigkeit ist ein kritischer Bestandteil dieses Verfahrens, da es notwendig sein kann, die Lunge von Dutzenden von Mäusen zu einem einzigen Zeitpunkt zu sammeln. Dieses Verfahren kann in weniger als 6 Minuten pro Maus durchgeführt werden.
Während dieses Verfahren mehr als ausreichend für die Bewertung der Tumorhistologie ist, wird es nicht für diejenigen empfohlen, die stereologische oder morphometrische Messungen der Lunge durchführen möchten. Solche Messungen erfordern eine Standardinflation der Lunge, ebenso wie die Berechnung der absoluten Oberfläche der Lunge, des absoluten Volumens und der Alveolargröße und der Zahl1. Diese Methode ist auch nicht optimal für einige bildgebende Ansätze. Zum Beispiel erfordert die Bildgebung der Lunge über die "CT" für die ex vivo morphometrische Analyse, dass die Lunge mit Luft gefüllt bleibt2. Wenn die Erhaltung von Lufträumen und Abmessungen das Hauptanliegen ist, wird empfohlen, die Lunge durch Perfusionsdehydrierungstechniken3,4zu fixieren. Eines der größten Anliegen dieses Modells ist das Potenzial für das Brechen der Alveolarwände, die seine Verwendung in Studien von Emphysem enden; Das empfohlene Verfahren zur Fixierung der Lunge zur Untersuchung von Emphysem ist jedoch noch recht ähnlich, da es empfohlen wird, die Lunge entweder durch intratracheale Instillation von 10% Formalin (ähnlich dem hier beschriebenen Protokoll) unter konstantem Flüssigkeitsdruck oder durch In-situ-Fixierung5zu fixieren.
Der Vorteil des beschriebenen Verfahrens besteht hier darin, dass es keinen konstanten Flüssigkeitsdruck erfordert, sondern die Lunge aufbläht, bis sie sich vollständig erweitert hat, wodurch die für das Verfahren benötigte Zeit verringert wird. Das hier beschriebene Verfahren ähnelt den Methoden, die von einem Rüstungsarium der Gesellschaft für Toxikologische Pathologie empfohlen werden, wo ein Unterausschuss gebildet wurde, um die besten Methoden der Lungenfixierung für toxikologische Studien zu empfehlen. Die Mehrheit der Wissenschaftler in diesem Unterausschuss empfahl, die Lunge durch intratracheale Instillation mit einer Spritze zu fixieren, obwohl es unterschiedliche Empfehlungen für die Zeit gab, zu der die Lunge imfixativen 6belassen wurde. Während es also eine Vielzahl von Methoden der Lungeninflation und -fixierung gibt, wird die hier beschriebene Methode als optimale Methode vorgeschlagen, um die Lunge schnell aufzublasen und für die nachgeschaltete tumorhistologische Bewertung zu fixieren.

<table><tbody><tr><td>10% buffered formalin</td><td>Fisher</td><td>23-245685</td><td></td></tr><tr><td>22 G Needle</td><td>BD</td><td>305155</td><td></td></tr><tr><td>3 mL syringe</td><td>BD</td><td>309656</td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>Decon</td><td>2405</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-8595</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Fisher</td><td>H19</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>Surgical scissors</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-8428</td><td></td></tr></tbody></table>

perfusion and inflation of the mouse lung for tumor histology

Die Fähigkeit, die Lungenhistologie zu bewerten, ist entscheidend für die Bereiche Lungenkrebsforschung und Krebsmetastasierung. Ebenso wichtig ist es, Nekropsien schnell und effizient aus Studien durchzuführen, ohne die Qualität des beschafften Gewebes zu beeinträchtigen. Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine Methode zur schnellen Durchlässigkeit, Aufblasung und Fixierung von Mauslungen für die nachgelagerte histologische Analyse zu präsentieren. Diese Methode standardisiert die Lungeninflation nicht; daher erfordert es keine speziellen Verfahren oder Ausrüstung und stattdessen nur fixierend direkt durch die Luftröhre nach Perfusion durch das Herz. Dies ermöglicht eine ausreichende Schätzung der Tumorgröße, Histologie und Bewertung. Dies ermöglicht auch die Sammlung von gefrorenem Gewebe vor der Lungengewebefixierung. Diese Methode ist insofern eingeschränkt, als sie eine spätere morphometrische Quantifizierung der Lunge nicht zulässt; Es reicht jedoch mehr als aus für Lungentumoranalysen aus gentechnisch veränderten Mausmodellen (GEMMs), syngene Modelle sowie Xenograft-Tumor- und Metastasenstudien.

Das obige Protokoll ermöglicht eine schnelle Perfusion, Inflation und Fixierung der Mauslungen. Die nachstehenden Abbildungen stellen die Bedeutung jedes Schritts dar. Abbildung 1 zeigt H&E-gefärbte Lungen, die mit PBS und Lunge durchdrungen wurden, bei denen der Perfusionsschritt übersprungen wurde oder die Lunge nicht richtig durchdrang. Wie gezeigt, erzeugt überschüssiges Blut in der schlecht durchbluteten Lunge weniger als ideale Histologie und kann es schwierig machen, die Lungenar...

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Perfusion and Inflation of the Mouse Lung for Tumor Histology

Der Zweck dieser Methode ist es, eine einfache und effiziente Methode für die Perfusion, Inflation und Fixierung von Mauslungen für die Untersuchung der Lungentumorpathologie und die Bewertung von Metastasen an der Lunge zu präsentieren.

Perfusion und Inflation der Mauslunge für Tumorhistologie

The ability to evaluate lung histology is critical for the fields of lung cancer research and cancer metastasis. It is equally important to perform ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Cancer Research

18.2K Aufrufe.  University of Alabama at Birmingham. Der Zweck dieser Methode ist es, eine einfache und effiziente Methode für die Perfusion, Inflation und Fixierung von Mauslungen für die Untersuchung der Lungentumorpathologie und die Bewertung von Metastasen an der Lunge zu präsentieren.

Serie: Perfusion and Inflation of the Mouse Lung for Tumor Histology

Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window

Metastasis to secondary sites such as the lung, liver and bone is a traumatic event with a mortality rate of approximately 90% 1. Of these sites, the lung is the most difficult to assess using intravital optical imaging due to its enclosed position within the body, delicate nature and vital role in sustaining proper physiology. While clinical modalities (positron emission tomography (PET), magnetic resonance imaging (MRI) and computed tomography (CT)) are capable of providing noninvasive images of this tissue, they lack the resolution necessary to visualize the earliest seeding events, with a single pixel consisting of nearly a thousand cells. Current models of metastatic lung seeding postulate that events just after a tumor cell&#39;s arrival are deterministic for survival and subsequent growth. This means that real-time intravital imaging tools with single cell resolution 2 are required in order to define the phenotypes of the seeding cells and test these models. While high resolution optical imaging of the lung has been performed using various ex vivo preparations, these experiments are typically single time-point assays and are susceptible to artifacts and possible erroneous conclusions due to the dramatically altered environment (temperature, profusion, cytokines, etc.) resulting from removal from the chest cavity and circulatory system 3. Recent work has shown that time-lapse intravital optical imaging of the intact lung is possible using a vacuum stabilized imaging window 2,4,5 however, typical imaging times have been limited to approximately 6 hr. Here we describe a protocol for performing long-term intravital time-lapse imaging of the lung utilizing such a window over a period of 12 hr. The time-lapse image sequences obtained using this method enable visualization and quantitation of cell-cell interactions, membrane dynamics and vascular perfusion in the lung. We further describe an image processing technique that gives an unprecedentedly clear view of the lung microvasculature.

This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform long-term high-resolution, single cell imaging of the intact lung in real time using a vacuum stabilized imaging window.

Langfristige High-Resolution Intravitalmikroskopie in der Lunge mit einem Vakuum-Stabilisierte Imaging-Fenster

Metastasis to secondary sites such as the lung, liver and bone is a traumatic event with a mortality rate of approximately 90% 1. Of these sites, the lung ...

Forschung

Krebsforschung

Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer

A hallmark of advanced tumors is a switch to aerobic glycolysis that is readily measured by [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose positron emission tomography (18F-FDG PET) imaging. Co-mutations in the KRAS proto-oncogene and the LKB1 tumor suppressor gene are frequent events in lung cancer that drive hypermetabolic, glycolytic tumor growth. A critical pathway regulating the growth and metabolism of these tumors is the mechanistic target of the rapamycin (mTOR) pathway, which can be effectively targeted using selective catalytic mTOR kinase inhibitors. The mTOR inhibitor MLN0128 suppresses glycolysis in mice bearing tumors with Kras and Lkb1 co-mutations, referred to as KL mice. The therapy response in KL mice is first measured by 18F-FDG PET and computed tomography (CT) imaging before and after the delivery of MLN0128. By utilizing 18F-FDG PET/CT, researchers are able to measure dynamic changes in the glucose metabolism in genetically engineered mouse models (GEMMs) of lung cancer following a therapeutic intervention with targeted therapies. This is followed by ex vivo autoradiography and a quantitative immunohistochemical (qIHC) analysis using morphometric software. The use of qIHC enables the detection and quantification of distinct changes in the biomarker profiles following treatment as well as the characterization of distinct tumor pathologies. The coupling of PET imaging to quantitative histology is an effective strategy to identify metabolic and therapeutic responses in vivo in mouse models of disease.

Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer

In this protocol, we describe how to utilize [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose positron emission tomography and computed tomography (18F-FDG PET/CT) imaging to measure the tumor metabolic response to the targeted therapy MLN0128 in a Kras/Lkb1 mutant mouse model of lung cancer and coupled imaging with high resolution ex vivo autoradiography and quantitative histology.

Nutzung von 18F-FDG-PET/CT-Bildgebung und quantitativer Histologie, dynamische Veränderungen in der Glukose-Stoffwechsel in Mausmodellen von Lungenkrebs zu messen

A hallmark of advanced tumors is a switch to aerobic glycolysis that is readily measured by [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose positron emission tomography ...

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of micrometastases by radiologic imaging and the success in their therapeutic eradication remain limited.
While animal models have proven to be invaluable tools for cancer research1, the monitoring/visualization of micrometastases remains a challenge and inaccurate evaluation of metastatic spread in preclinical studies potentially leads to disappointing results in clinical trials2. Consequently, there is great interest in refining the methods to finally allow reproducible and reliable detection of metastases down to the single cell level in normal tissue. The main focus therefore is on techniques, which allow the detection of tumor cells in vivo, like micro-computer tomography (micro-CT), positron emission tomography (PET), bioluminescence or fluorescence imaging3,4. We are currently optimizing these techniques for in vivo monitoring of primary tumor growth and metastasis in different osteosarcoma models. Some of these techniques can also be used for ex vivo analysis of metastasis beside classical methods like qPCR5, FACS6 or different types of histological staining. As a benchmark, we have established in the present study the stable transfection or transduction of tumor cells with the lacZ gene encoding the bacterial enzyme &beta;-galactosidase that metabolizes the chromogenic substrate 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside (X-Gal) to an insoluble indigo blue dye7 and allows highly sensitive and selective histochemical blue staining of tumor cells in mouse tissue ex vivo down to the single cell level as shown here. This is a low-cost and not equipment-intensive tool, which allows precise validation of metastasis8 in studies assessing new anticancer therapies9-11. A limiting factor of X-gal staining is the low contrast to e.g. blood-related red staining of well vascularized tissues. In lung tissue this problem can be solved by in-situ lung perfusion, a technique that was recently established by Borsig et al.12 who perfused the lungs of mice under anesthesia to clear them from blood and to fix and embed them in-situ under inflation through the trachea. This method prevents also the collapse of the lung and thereby maintains the morphology of functional lung alveoli, which improves the quality of the tissue for histological analysis. In the present study, we describe a new protocol, which takes advantage of a combination of X-gal staining of lacZ-expressing tumor cells and in-situ perfusion and fixation of lung tissue. This refined protocol allows high-sensitivity detection of single metastatic cells in the lung and enabled us in a recent study to detect "dormant" lung micrometastases in a mouse model13, which was originally described to be non-metastatic14.

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

The novel protocol reported in the present study allows selective detection of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ lung perfusion and fixation and X-Gal staining of lacZ-tagged tumor cells.

Verbesserte Visualisierung von Lungenmetastasen bei Single Cell Auflösung in Mäusen durch kombinierte<em&gt; In-situ</em&gt; Perfusion des Lungengewebes und X-Gal Färbung von<em&gt; LacZ</em&gt;-Tagged Tumor Cells

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

Medizin

A Standardized Method for Measuring Internal Lung Surface Area via Mouse Pneumonectomy and Prosthesis Implantation

Pulmonary morphology, physiology, and respiratory functions change in both physiological and pathological conditions. Internal lung surface area (ISA), representing the gas-exchange capacity of the lung, is a critical criterion to assess respiratory function. However, observer bias can significantly influence measured values for lung morphological parameters. The protocol that we describe here minimizes variations during measurements of two morphological parameters used for ISA calculation: internal lung volume (ILV) and mean linear intercept (MLI). Using ISA as a morphometric and functional parameter to determine the outcome of alveolar regeneration in both pneumonectomy (PNX) and prosthesis implantation mouse models, we found that the increased ISA following PNX treatment was significantly blocked by implantation of a prosthesis into the thoracic cavity1. The ability to accurately quantify ISA is not only expected to improve the reliability and reproducibility of lung function studies in injured-induced alveolar regeneration models, but also to promote mechanistic discoveries of multiple pulmonary diseases.

Internal lung surface area (ISA) is a critical criterion for assessing lung morphology and physiology in lung diseases and injury-induced alveolar regeneration. We describe here a standardized method that can minimize the measurement bias for ISA in both lung pneumonectomy and prosthesis implantation mouse models.

Eine standardisierte Methode zur Messung der inneren Lungenoberfläche über Maus Pneumonektomie und Prothesenimplantation

Pulmonary morphology, physiology, and respiratory functions change in both physiological and pathological conditions. Internal lung surface area (ISA), ...

Entwicklungsbiologie

Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research

The ability to instill live agents, cells, or chemicals directly into the lung without injuring or killing the mice is an important tool in lung cancer research. Although there are a number of methods that have been published showing how to intubate mice for pulmonary function measurements, none are without potential problems for rapid tracheal instillation in large cohorts of mice. In the present paper, a simple and quick method is described that enables an investigator to carry out such instillations in an efficient manner. The method does not require any special tools or lighting and can be learned with very little practice. It involves anesthetizing a mouse, making a small incision in the neck to visualize the trachea, and then inserting an intravenous catheter directly. The small incision is quickly closed with tissue adhesive, and the mice are allowed to recover. A skilled student or technician can do instillations at an average rate of 2 min/mouse. Once the cancer is established, there is frequently a need for quantitative histologic analysis of the lungs. Traditionally pathologists usually do not bother to standardize lung inflation during fixation, and analyses are often based on a scoring system that can be quite subjective. While this may sometime be sufficiently adequate for gross estimates of the size of a lung tumor, any proper stereological quantification of lung structure or cells requires a reproducible fixation procedure and subsequent lung volume measurement. Here we describe simple reliable procedures for both fixing the lungs under pressure and then accurately measuring the fixed lung volume. The only requirement is a laboratory balance that is accurate over a range of 1 mg&#8211;300 g. The procedures presented here thus could greatly improve the ability to create, treat, and analyze lung cancers in mice.

The goal of this paper is to describe simple methods that will greatly aid in the setup and analysis of mouse lungs with lung cancer or other pathologies. We present 3 protocols to simply and reliably carry out lung instillations, fixation, and lung volume measurements.

Instillation und Fixationsmethoden Nützlich in Maus Lung Cancer Research

The ability to instill live agents, cells, or chemicals directly into the lung without injuring or killing the mice is an important tool in lung cancer ...

Pre-Conditioning the Airways of Mice with Bleomycin Increases the Efficiency of Orthotopic Lung Cancer Cell Engraftment

Lung cancer is a deadly treatment refractory disease that is biologically heterogeneous. To understand and effectively treat the full clinical spectrum of thoracic malignancies, additional animal models that can recapitulate diverse human lung cancer subtypes and stages are needed. Allograft or xenograft models are versatile and enable the quantification of tumorigenic capacity in vivo, using malignant cells of either murine or human origin. However, previously described methods of lung cancer cell engraftment have been performed in non-physiological sites, such as the flank of mice, due to the inefficiency of orthotopic transplantation of cells into the lungs. In this study, we describe a method to enhance orthotopic lung cancer cell engraftment by pre-conditioning the airways of mice with the fibrosis inducing agent bleomycin. As a proof-of-concept experiment, we applied this approach to engraft tumor cells of the lung adenocarcinoma subtype, obtained from either mouse or human sources, into various strains of mice. We demonstrate that injuring the airways with bleomycin prior to tumor cell injection increases the engraftment of tumor cells from 0-17% to 71-100%. Significantly, this method enhanced lung tumor incidence and subsequent outgrowth using different models and mouse strains. In addition, engrafted lung cancer cells disseminate from the lungs into relevant distant organs. Thus, we provide a protocol that can be used to establish and maintain new orthotopic models of lung cancer with limiting amounts of cells or biospecimen and to quantitatively assess the tumorigenic capacity of lung cancer cells in physiologically relevant settings.

We describe a method to significantly enhance orthotopic engraftment of lung cancer cells into the murine lungs by pre-conditioning the airways with injury. This approach may also be applied to study stromal interactions within the lung microenvironment, metastatic dissemination, lung cancer co-morbidities, and to more efficiently generate patient derived xenografts.

Die Atemwege von Mäusen mit Bleomycin Vorklimatisierung erhöht die Effizienz der Orthotopen Lung Cancer Cell Engraftment

Lung cancer is a deadly treatment refractory disease that is biologically heterogeneous. To understand and effectively treat the full clinical spectrum of ...

Air-Inflation of Murine Lungs with Vascular Perfusion-Fixation

Lung histology is often used to investigate the contributions provided by airspace cells during lung homeostasis and disease pathogenesis. However, commonly used instillation-based fixation methods can displace airspace cells and mucus into terminal airways and can alter tissue morphology. In comparison, vascular perfusion-fixation techniques are superior at preserving the location and morphology of cells within airspaces and the mucosal lining. However, if positive airway pressure is not simultaneously applied, regions of the lungs may collapse and capillaries may bulge into the alveolar spaces, leading to distortion of the lung anatomy. Herein, we describe an inexpensive method for air-inflation during vascular perfusion-fixation to preserve the morphology and location of airway and alveolar cells and interstitium in murine lungs for downstream histologic studies. Constant air pressure is delivered to the lungs via the trachea from a sealed, air-filled chamber that maintains pressure via an adjustable liquid column while fixative is perfused through the right ventricle.

Presented is a method for air-inflation with vascular perfusion-fixation of the lungs that preserves the location of cells within airways, alveoli and interstitium for structure-function analyses. Constant airway pressure is maintained with an air-inflation chamber while fixative is perfused via the right ventricle. Lungs are processed for histologic studies.

Luft-Aufblasen der murinen Lunge mit vaskulärer Perfusionsfixierung

Lung histology is often used to investigate the contributions provided by airspace cells during lung homeostasis and disease pathogenesis. However, ...

Neurowissenschaften

<meta charset="utf8"></head><body>Echtzeit-Überwachung der zellulären Dynamik bei der Lungentransplantation von Mäusen

Intravital Two-Photon Microscopy of the Transplanted Mouse Lung

Complications after lung transplantation are largely related to the host immune system responding to the graft. Such immune responses are regulated by crosstalk between donor and recipient cells. A better understanding of these processes relies on the use of preclinical animal models and is aided by an ability to study intra-graft immune cell trafficking in real-time. Intravital two-photon microscopy can be used to image tissues and organs for depths up to several hundred microns with minimal photodamage, which affords a great advantage over single-photon confocal microscopy. Selective use of transgenic mice with promoter-specific fluorescent protein expression and/or adoptive transfer of fluorescent dye-labeled cells during intravital two-photon microscopy allows for the dynamic study of single cells within their physiologic environment. Our group has developed a technique to stabilize mouse lungs, which has enabled us to image cellular dynamics in na&#239;ve lungs and orthotopically transplanted pulmonary grafts. This technique allows for detailed assessment of cellular behavior within the vasculature and in the interstitium, as well as for examination of interactions between various cell populations. This procedure can be readily learned and adapted to study immune mechanisms that regulate inflammatory and tolerogenic responses after lung transplantation. It can also be expanded to the study of other pathogenic pulmonary conditions.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Weiterentwicklung der Immunologie von Lungentransplantationen durch Intravitalbildgebung

Here, we present a protocol to intravitally image the transplanted mouse left lung using two-photon microscopy. This represents a valuable tool for studying cellular dynamics and interactions in real-time following murine lung transplantation.

Intravitale Zwei-Photonen-Mikroskopie der transplantierten Mauslunge

Complications after lung transplantation are largely related to the host immune system responding to the graft. Such immune responses are regulated by ...

Perfusion und Inflation der Mauslunge für Tumorhistologie

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Intravitale Zwei-Photonen-Mikroskopie der transplantierten Mauslunge

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