Unser Protokoll ist das erste, das die dynamische Messung der Luftweg-Oberflächenflüssigkeit oder ASL-pH-Wert in Echtzeit sowohl unter Ruhe- als auch nach Agonisten- oder Inhibitorbehandlung ermöglicht. Diese Methode hilft, Ionenkanäle und Transporter zu identifizieren, die an der extrazellulären pH-Regulierung beteiligt sind, und könnte auf andere Zellsysteme angewendet werden, in denen dies wichtig ist, wie Krebs. Im Vergleich zu zuvor veröffentlichten Methoden ist diese neue Technik relativ einfach durchzuführen.
Es erfordert keine spezielle Ausrüstung. Und kann ASL pH-Messungen gleichzeitig in mehreren Kulturen unter Luftflüssigkeitsschnittstelle oder Dünnschichtbedingungen durchführen. Wichtig ist, dass diese neue Technik das Potenzial hat, die Auswirkungen neuer Therapeutika zu bewerten, nicht nur bei Mukoviszidose, sondern auch bei anderen chronischen Atemwegserkrankungen wie Asthma und COPD.
Waschen Sie nach mindestens 28 Tagen Kultur die apikale Oberfläche einer menschlichen Atemwegsepithelzellkultur mit 150 Mikrolitern Bicarbonat, die Krebs-Pufferlösung enthalten, 20 Minuten lang auf dem Zellkultur-Inkubator. Verwenden Sie am Ende der Inkubation eine sterile Glaspipette mit einer sterilen P200-Pipettenspitze, die mit einer Aspirationspumpe verbunden ist, um die Wäsche sorgfältig zu saugen, ohne das Epithel zu stören. Es sollte so wenig Flüssigkeit wie möglich auf der apikalen Oberfläche vorhanden sein, um die Luftflüssigkeitsschnittstelle wiederherzustellen.
Dann geben Sie die Zellen für 30 Minuten in den Zellkultur-Inkubator zurück. Um eine Hintergrundmessung durchzuführen, schalten Sie den Plattenleser und den Computer ein. Klicken Sie nach dem Öffnen des Armaturenbretts auf Spark 10M und legen Sie die Temperaturregelung auf 37 Grad Celsius fest.
Öffnen Sie dann die Gassteuerung und stellen Sie das Kohlendioxid auf 5%Wenn die Temperatur und das Gas ihre Ziele erreicht haben, öffnen Sie die Plattenleserschublade und legen Sie eine Feuchtigkeitskassette ein, die mit sechs Millilitern destilliertem Wasser auf jeder Seite gefüllt ist. Bestätigen Sie, dass der Deckel und der Boden der Zellkulturplatte sauber sind und legen Sie die Platte auf die Feuchtigkeitskassette, legen Sie den Deckel wieder auf und schließen Sie die Schublade. Öffnen Sie den Spark-Methoden-Editor, wählen Sie die entsprechende Plattenvorlage aus und wählen Sie die Bohrungen aus, die während des Experiments überwacht werden sollen.
Fügen Sie ein Temperatur- und Kohlendioxid-Bedienfeld hinzu und stellen Sie die Panels auf 37 Grad Celsius bzw. 5 % fest. Dann markieren Sie das Warten auf Temperatur-/Gasboxen. Fügen Sie ein kinetisches Schleifenbedienfeld hinzu, und wählen Sie die Dauer als Schleifentyp aus.
Legen Sie die Dauer auf fünf Minuten fest, und legen Sie den Intervalltyp des Experiments auf nicht definiert fest, um einen kontinuierlichen Messwert zu erhalten. Verwenden Sie innerhalb der kinetischen Schleife die Drag-and-Drop-Funktion, um zwei Fluoreszenzintensitätspanels hinzuzufügen, die individuell für die pH-empfindlichen und pH-unempfindlichen Fluoreszenzfarbstoffe eingestellt werden. Stellen Sie die Anregungs- und Emissionswellenlänge für den pH-empfindlichen Farbstoff auf 560 bzw. 590 Nanometer fest.
Und 495 bzw. 520 Nanometer für den pH-unempfindlichen Farbstoff. Stellen Sie die Anzahl der Blitze auf 30 und die Z-Position auf 33, 200 für jedes Fluorophor. Legen Sie den Mehrfachlese-Code pro Bohrung auf benutzerdefinierte Sendefläche fest, als drei mal drei durch Kreis mit einem Rahmen von 4, 750 Mikrometern.
Klicken Sie auf Starten, um den Hintergrundmesswert zu initiieren, und klicken Sie auf OKAY, um zu bestätigen, dass der Deckel der Feuchtigkeitskassette vorhanden ist. Übertragen Sie die Platte am Ende der Messung vom Plattenleser in einen Gewebekultur-Sicherheitsschrank und fügen Sie der apikalen Oberfläche der Zellen drei Mikroliter frisch zubereiteter dextran-gekoppelter Fluoreszenzfarbstofflösung hinzu. Dann kehren Sie die Platte über Nacht zum Zellkultur-Inkubator zurück.
Öffnen Sie für die Kinetikmessung die Für die Hintergrundmessungen verwendete Methodendatei. Wenn alle Parameter eingestellt sind, öffnen Sie die Plattenleserschublade und legen Sie die Feuchtigkeitskassette ein. Legen Sie die saubere Platte in die Feuchtigkeitskassette mit ihrer Abdeckung und klicken Sie auf Start, um die Fluoreszenzmessungen zu initiieren.
Klicken Sie dann auf okay, um zu bestätigen, dass der Deckel der Feuchtigkeitskassette an Ort und Stelle ist. Nach mindestens 12 Zyklen, klicken Sie auf Pause, um das Experiment zu unterbrechen und entfernen Sie die Platte, um alle Medikamente oder Agonisten auf die entsprechenden Proben aufzutragen. Geben Sie die Platte auf die Feuchtigkeitskassette auf dem Fach zurück und positionieren Sie den Deckel der Feuchtigkeitskassette neu, bevor Sie auf "Weiter" klicken, um den PH-Wert von ASL weiter aufzuzeichnen und die Wirkung der Behandlung zu überwachen.
Für die in situ pH-Kalibrierung die Platte aus dem Plattenleser entfernen und die basolaterale Lösung ansaugen. Fügen Sie dem basolateralen Fach 750 Mikroliter hochgepufferter Standardkurvenlösung und der apikalen Oberfläche einen Mikroliter Lösung hinzu. Schalten Sie das Kohlendioxid am Plattenleser aus und geben Sie die Platte an die Feuchtigkeitskassette zurück.
Stellen Sie dann den Plattenleser mit den gleichen Parametern ein, wie gezeigt, aber ohne Kohlendioxid, und starten Sie die Fluoreszenzmessungen alle fünf Minuten für ein bis eineinhalb Stunden. Wählen Sie für die Datenanalyse alle Mittelwertdaten für jede Probe und bzw. die Bedingung für beide Wellenlängen in der Hintergrunddatei aus, und kopieren Sie die Daten und fügen Sie sie in eine neue Datei ein. Berechnen Sie dann den mittleren Hintergrund für jeden Brunnen und jede Wellenlänge.
Nach dem Kopieren und Einfügen der Kalibrier- und kinetischen Daten auf die gleiche Weise subtrahieren Sie den Hintergrund von jedem Datenpunkt für jede Wellenlänge. Berechnen Sie für jeden Zeitpunkt und jede Probe das Verhältnis zwischen dem pH-empfindlichen und dem pH-unempfindlichen Fluoreszenz. Generieren Sie für jeden Zeitpunkt eine Standardkurve aus den Verhältnissen und zeichnen Sie die bekannten pH-Werte auf der x-Achse und die Verhältnisse auf der y-Achse.
Bestimmen Sie den Zeitpunkt, zu dem die Verhältnisse stabil sind, passen Sie eine lineare Regressionslinie an und erhalten Sie die Gleichung für diese Linie. Berechnen Sie dann den pH-Wert für jeden Zeitpunkt und zeichnen Sie den pH-Wert auf der y-Achse und die Zeit auf der x-Achse. In diesem repräsentativen Vorversuch ohne Zellen bei gleichem pH-Wert und gleicher Konzentration unterschieden sich die pH-empfindlichen und pH-unempfindlichen Emissionsverhältnisse je nach Volumen des Farbstoffs.
Darüber hinaus lieferten unterschiedliche Farbkonzentrationen bei gleichem pH-Wert und gleichem Volumen unterschiedliche Verhältniswerte, was darauf hindeutet, dass Veränderungen der Volumen- oder Farbstoffkonzentration den absoluten Wert des aus dem Emissionsverhältnis berechneten pH-Wertes beeinflussen. Darüber hinaus beträgt die für den Temperaturausgleich benötigte Zeit ca. 15 bis 20 Minuten, unabhängig von Farbstoffvolumen oder Konzentration. DIE asL-pH-Werte, die aus einer einzigen globalen Standardkurve gewonnen wurden, zeigen einen signifikanten Unterschied zwischen nicht-mukovenen Fibrose- und Mukoviszidose-Kulturen.
Während sich der ASL-pH-Wert nicht signifikant zwischen Mukoviszidose und nicht-mukovender Fibrose menschlicher Atemwegsepithelzellen unterscheidet, wenn der pH-Wert aus unabhängigen Standardkurven berechnet wird. Daher ist es wichtig, für jedes Experiment und in jedem Experiment, für jede Spenderprobe unabhängige Kalibrierkurven zu generieren, da bei zusammen gemittelten Kalibrierkurven höhere pH-empfindliche, pH-unempfindliche Verhältniswerte in Mukoviszidosekulturen gefunden werden, die auf einen saureren pH-Wert hinweisen. Wie erwartet, erhöht die Zugabe von basolateralem Forskolin den ASL-pH-Wert nur in nicht-mukovischen Fibrosekulturen signifikant.
Da diese Zellen unter sterilem Zustand gehalten wurden, können sie gewaschen, wieder gefüttert und einige Tage später für zukünftige Experimente verwendet werden. Alle biologischen menschlichen Exemplare sollten als potenziell gefährlich angesehen werden. Achten Sie also darauf, je nach Proben die entsprechende Einschließungs- und persönliche Schutzausrüstung zu verwenden.
Es ist wichtig, die Hintergrundmessungen und die pH-Kalibrierungen für jeden Satz von Proben durchzuführen, um die Variabilität zwischen den Spendern zu reduzieren und die Genauigkeit zu verbessern.
