一次人气道上皮细胞气道表面液体 pH 值的实时、半自动荧光测量

我们的协议是第一个允许在休息和后激动剂或抑制剂治疗的实时空气道表面液体（ASL pH）的动态测量。此方法有助于识别参与细胞外 pH 调节的离子通道和传输器，并可应用于其他重要的细胞系统，如癌症。现在与以前发布的方法相比，这种新技术的执行相对简单。

它不需要专门的设备。并可以在空气液体界面或薄膜条件下，在多种培养物中同时进行 ASL pH 测量。重要的是，这项新技术有可能评估新疗法的影响，不仅囊性纤维化，而且其他慢性气道疾病，如哮喘和慢性阻塞性肺病。

经过至少28天的培养，用150微升含克雷布斯缓冲液的碳酸氢盐在细胞培养箱上洗涤人类气道上皮细胞培养物的表面，20分钟。在孵化结束时，使用无菌玻璃移液器，其无菌 P200 移液器尖端与吸气泵相连，在不破坏上皮的情况下小心吸气洗涤。应尽可能少地在气相表面上剩余的液体，以恢复空气液体界面。

然后将细胞返回细胞培养箱30分钟。要执行背景测量，请打开板读卡器和计算机。打开仪表板后，单击 Spark 10M 将温度控制设置为 37 摄氏度。

然后打开气体控制装置，将二氧化碳设定为5%当温度和气体达到目标时，打开板读卡器抽屉，并在读卡器中插入一个装满六毫升蒸馏水的湿度盒。确认电池培养板的盖子和底部清洁，将板放在湿度盒上，重新打开盖子并关闭抽屉。打开火花方法编辑器，选择适当的板模板，并选择要在实验期间监视的井。

添加温度和二氧化碳控制面板，将面板分别设置为 37 摄氏度和 5%。然后勾选等待温度/气体框。添加动能循环面板并选择持续时间作为循环类型。

将持续时间设置为五分钟，并设置实验的间隔类型为未定义，以获得连续读数。在动力学回路中，使用拖放功能添加两个荧光强度面板，这些面板将单独设置为 pH 敏感和 pH 不敏感的荧光染料。将 pH 敏感染料的激发和发射波长分别设置为 560 和 590 纳米。

和495和520纳米分别为pH-不敏染料。将闪烁数设置为 30，将 z 位置设置为 33，200 个。将每个井的多次读取设置为用户定义，即一个三按三的圆圈，边框为 4，750 微米。

单击"开始"以启动背景测量读数并单击"正常"，以确认湿度盒盖已到位。在测量结束时，将板从板读卡器转移到组织培养安全柜，并将三升新鲜准备好的脱糖耦合荧光染料溶液添加到细胞的面体表面。然后将板返回细胞培养箱过夜。

对于动力学测量，请打开用于背景测量的方法文件。设置所有参数后，打开板读卡器抽屉并插入湿度盒。将清洁板及其盖放在湿度盒中，然后单击启动以启动荧光读数。

然后单击"确定"，确认湿度盒盖已到位。在至少12个周期后，单击暂停以中断实验，并取出板，以将任何药物或激动剂涂抹到适当的样品中。将板返回到托盘上的湿度盒，并在单击继续之前重新定位湿度盒盖，以进一步记录 ASL pH 并监控处理效果。

对于原位 pH 校准，从板读卡器上拆下板并吸气基板溶液。将 750 微升高度缓冲的标准曲线溶液添加到基底层隔间中，在面体表面添加 1 微升溶液。关闭板读卡器上的二氧化碳，然后将板返回到湿度盒。

然后设置与演示的参数相同的板读卡器，但没有二氧化碳，每五分钟开始一次荧光读数一到一个半小时。对于数据分析，选择每个样本的所有均值数据，或背景文件中两个波长的条件，然后复制并粘贴到新文件中。然后计算每个井和每个波长的均值背景。

以相同方式复制和粘贴校准和动力学数据后，从每个波长的每个数据点减去背景。对于每个时间点和每个样品，计算 pH 敏感度和 pH 不敏感荧光之间的比率。对于每个时间点，从比率生成标准曲线，并绘制 x 轴上的已知 pH 值和 y 轴上的比率。

确定比率稳定的时间点，拟合线性回归线并获取此线的方程。然后，计算每个时间点的 pH 值，并在 y 轴上绘制 pH 和 x 轴上的时间。在这个代表性的初步实验中，没有相同pH和相同浓度的细胞，pH敏感和pH不敏感排放比因染料的体积而异。

此外，在同一 pH 和相同体积下，不同的染料浓度提供不同的比率值，表明体积或染料浓度的变化会影响从排放比计算的 pH 的绝对值。此外，无论染料体积或浓度如何，温度平衡所需时间约为 15 到 20 分钟。从单个全球标准曲线获得的 ASL pH 值表明非囊性纤维化和囊性纤维化培养物之间的显著差异。

然而，当pH值从独立的标准曲线计算时，囊性纤维化和非囊性纤维化人类气道上皮细胞之间的 ASL pH 没有显著差异。因此，对于每个实验和每个实验中，对于每个供体样本生成独立的校准曲线非常重要，因为当校准曲线一起平均时，囊性纤维化培养物中发现较高的 pH 敏感、pH-不敏感比值，表明 pH 含量更高。正如预期的那样，在非囊性纤维化培养物中，添加基索托特福斯科林会显著增加 ASL pH。

由于这些细胞一直保持在无菌状态下，它们可以被清洗，重新喂养，并在几天后用于未来的实验。所有生物人类标本应被视为具有潜在危险性。因此，请务必根据样品使用适当级别的禁闭和个人防护设备。

对于每组样品进行背景测量和 pH 校准非常重要，以减少供体间变异性并提高准确性。