Dieses Protokoll bietet eine schnelle Möglichkeit, die Auswirkungen des Knock-Downs des WC5-Gens zu bewerten, das die häufigste Ursache für fokale Epilepsie ist. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir sie verwenden können, um die Epilepsie wie den Phänotyp sowohl mit Verhaltens- als auch mit physiologischen Merkmalen in verschiedenen Entwicklungsstadien zu beurteilen. Stellen Sie einen Tag vor der Mikroinjektion die Zebrafisch-Paarungsbecken auf.
Entfernen Sie am Morgen der Injektion die Trennwände, um das Laichen zu ermöglichen. Verwenden Sie ein feines Sieb, um die Eier in 100-Millimeter-Petrischalen zu übertragen, die mit Embryonenwasser gefüllt sind. Wählen Sie mit einer Pasteur-Pipett aus Kunststoff 60 bis 80 Eier aus und ordnen Sie die Eier in einer silikonbeschichteten Petrischale für die Injektion an.
Wir bewegen den größten Teil des Wassers und lassen gerade genug, um die Eier auf halbem Weg zu bedecken. Legen Sie eine Glasnadel vertikal in ein Röhrchen Injektionslösung. Lassen Sie die farbige Lösung das Röhrchen durch Kapillarwirkung über einen Zeitraum von mehreren Minuten füllen.
Wenn die Injektionslösung in der Nadelspitze sichtbar ist, montieren Sie die Nadel auf dem Injektionsgriff des Mikroinjektors und schalten Sie den Luftkompressor ein. Stellen Sie die Druckeinstellung ein, um ein Injektionsvolumen von zwei Nanolitern zu erzeugen. Und die Eier unter ein sezierendes Binokularmikroskop mit einer vierfachen Vergrößerung zu legen.
Führen Sie die Nadelspitze durch das Chorion und das Eigelb von einstufigen Embryonen ein, um die Lösung direkt in jede Zelle zu injizieren. Dann übertragen Sie die injizierten Embryonen in eine beschriftete 100-Millimeter-Petrischale mit Embryowasser und legen Sie die Platte in einen 28 Grad Celsius-Inkubator. 28 Stunden nach der Düngung ein Kunststoffgitter mit 1,2 x 1,2 Millimeter Maschenweite am Boden der Testschale platzieren.
Verwenden Sie eine Pasteur-Pipette aus Kunststoff, um 10 bis 12 Embryonen in ihren Chorionen auf das Kunststoffnetz zu legen. Füllen Sie die Schale mit genügend Embryowasser, um den Embryo unter Wasser zu halten, aber nicht schwimmend, und bewegen Sie die Embryonen vorsichtig mit einer Plastikspitze in Position auf dem Gitter nach Bedarf. Zeichnen Sie dann mit einer Videokamera, die an einem Dissektionsmikroskop befestigt ist, die spontane Wickelaktivität für 10 bis 20 Minuten auf.
Um die gesamte spontane Bewegung zu analysieren, verwenden Sie das Aktivitätsquantifizierungsmodul in einem Zebra-Laborsystem, um das aufgezeichnete Video hochzuladen und die Tracking-Arenen um jeden Embryo herum entsprechend zu gestalten. Legen Sie die Schwellenwerte für Das Einfrieren und Burst auf 10 bzw. 50 fest. Und wenn die automatisierte Videoanalyse, die die Gesamtaktivität in jeder der definierten Arenen quantifiziert.
Stellen Sie dann den Datensatz als Tabellenkalkulation wieder her, um die Analyse mit der entsprechenden Datenanalysesoftware durchzuführen. Verwenden Sie 46 Stunden nach der Befruchtung eine feine Zette, um die Embryonen zu enthorionieren, und füllen Sie eine 130-Millimeter-Testschale mit Embryonenwasser. Mindestens 15 Minuten vor dem Rest die Testschale in einem 28 Grad Celsius Inkubator erwärmen.
Um einen berührungsgerufenen Fluchtreaktionstest durchzuführen, verwenden Sie eine Pasteur-Pipette aus Kunststoff, um einen Embryo in die Mitte der Testschale unter der Kamera zu legen. Beginnen Sie die Aufnahme mit einer Erfassungsrate von 30 Bildern pro Sekunde. Berühren Sie mit einer feinen Plastikspitze den Schwanz des Embryos mit einer flackernden Bewegung.
Stoppen Sie die Aufnahme, wenn die Larve ihre Bewegung beendet hat. Dann transferieren Sie den Embryo in eine neue Auffangschale, die mit frischem Embryonenwasser gefüllt ist, und wiederholen Sie den Test mit so vielen Embryonen, wie für jede experimentelle Bedingung erforderlich sind. Um den Zebrafisch für die elektrophysiologische Analyse vorzubereiten, legen Sie einen, vier bis sechs Tage nach der Befruchtung Fisch in eine Glasboden-Petrischale.
Entfernen Sie überschüssiges, zusätzliches Seemannsmedium, um sicherzustellen, dass sich der Fisch so nah wie möglich am Boden des Gerichts befindet. Verwenden Sie eine Kunststoff-Pasteurpipette, um genügend warme flüssige Agros hinzuzufügen, um die Larve zu bedecken. Während der Agros aushärtet, verwenden Sie eine feine Zette, um die ventrale Seite des Fisches in der Mitte des Gerichts zu orientieren.
Dann fügen Sie zwei Milliliter Aufzeichnungslösung hinzu, die 10 mikromolares Pancuroniumbromid enthält, um die neuromuskuläre Übertragung zu blockieren. Als nächstes füllen Sie ein Mikropipetting mit einer Aufnahmelösung und verwenden einen Patch-Clamp-Verstärker in der Spannungsklemmenkonfiguration, um den Elektrodenwiderstand im Bad zu messen und seinen korrekten Wert zu bestätigen. Positionieren Sie mit einem 20-fachen Objektiv den Kopf der Larve im zentralen Sichtfeld und senken Sie das Mikropipet ab, um die Aufnahmeposition innerhalb des optischen Tectums zu erreichen.
Schalten Sie den Patch-Clamp-Verstärker auf die aktuelle Klemmkonfiguration um und fixieren Sie den Haltestrom auf null Milliampere. Mit einem Tiefpassfilter von einem Kilohertz und einer Erfassungsrate von einem Kilohertz und einer digitalen Verstärkung von 10 zeichnen Sie die spontane Aktivität der Fische für 60 Minuten auf, um die Basisaktivitätsniveaus zu bestimmen. Am Ende der Baseline-Aufzeichnung bei 143 Mikrolitern einer 300 Millimolar pro Liter Pentylentetrazollösung zum Bad, für eine Endkonzentration von 20 Millimolar pro Liter.
Zeichnen Sie die neuronale Aktivität des Tieres in Pentylenetetrazollösung für weitere 120 Minuten auf. Während des Basiszeitraums der Aufzeichnung zeigen epileptische Modelle vier bis sechs Tage nach der Befruchtung ein höheres Auftreten spontaner Ereignisse, während Mismatch-Kontrollfische nur sehr wenige Schwankungen aufweisen. Nach der Anwendung von Pentylenetetrazol zeigen sowohl Mismatch-Kontrolle als auch epileptische Modelle Zebrafische eine erhöhte Anzahl von tiefen Polarisationsereignissen.
Während der ersten Periode nach der Anwendung von Pentylenetetrazol wird eine Rate von 0,8 Ereignissen pro Minute sowohl bei mismatch control als auch bei Knock-down-Tieren beobachtet, bei denen die Mehrheit der Ereignisse eine hohe Amplitude aufwirft. Während des letztgenannten Antwortzeitraums. Die Rate der Depolarisationsereignisse steigt auf etwa ein Ereignis pro Minute.
Und die Mehrheit der Ereignisse ist von geringer Amplitude. Bei der Durchführung von Knock-Down ist es sehr wichtig, die richtige Dosis von Morpholinos anhand einer Dosis-Wirkungs-Kurve festzulegen und Kontrollen durchzuführen, um die unspezifischen Toxizitäten zu vermeiden. Dieser Vorstoß ermöglicht mehrere nachgelagerte Studien, einschließlich der Prüfung der Auswirkungen genetischer oder chemischer Modifikatoren.
Und das Zebrafischverhalten und die neuronalen Aktivitäten aktivität, um die Entwicklungseffekte der DC fünf Mutationen zu verstehen.
