Die vorliegenden Werke wurden von der National Institutes of Health (NIH) Zuschüsse, HD043680, MH106392, DA013137 und NS100624 unterstützt. Partielle Fonds sorgte ein NIH T32 Ausbildung Stipendium in Biomedical-Behavioral Science.

Experimentelle Protokoll stimmte die Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) an der University of South Carolina (Bundesrepublik Qualitätssicherung Nummer: A3049-01).
1. Vorbereitung des frischen gefrorene Gehirn Abschnitte
<ol><li>Verwenden Sie die F344/N Ratten Belastung: drei Ratten beider Geschlechter, 13 Monate alt, Körpergewicht ca. 320 g.</li>
	<li>Passen Sie die Sevofluran Konzentration auf 5 % (Überdosierung von Sevofluran). Sevofluran Exposition nach Atmung stoppt für eine weitere Minute weiter.</li>
	<li>Die Ratte zu enthaupten und das Gehirn zu entfernen.</li>
	<li>Tauchen Sie die Rattengehirn in flüssigem Stickstoff für 15 s innerhalb von 5 min Gewebe Ernte.</li>
	<li>Equilibrate das Gehirn auf-20 ° C in einem Kryostaten für 1 h.</li>
	<li>30 µm Abschnitte schneiden und übertragen auf Folien (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Der Nucleus Accumbens Region, ca. 2,76 mm 2,28 mm anterior Bregma14Abschnitte auswählen.</li>
	<li>Schneiden Sie Rattengehirn aus den Riechkolben kontinuierlich durch die Nucleus Accumbens Region nach der stereotaktischen Gehirnstruktur der Ratte.</li>
	<li>Montieren Sie die Proben auf die Folien. Halten Sie die Abschnitte bei-20 ° C für 10 min trocknen lassen.</li>
	<li>Sofort Tauchen Sie Folien in die vorgekühlt 4 % Paraformaldehyd für 1 h bei 4 ° C.</li>
	<li>Legen Sie die Folien in einer zunehmenden Ethanol Steigung bei Raumtemperatur (RT): 50 % EtOH für 5 min; 70 % EtOH für 5 min; und 100 % EtOH für 5 Minuten.</li>
	<li>Wiederholen Sie dies mit frischen 100 % EtOH.</li>
	<li>Folien auf Küchenpapier legen und an der Luft trocknen.</li>
	<li>Zeichnen Sie eine Barriere um jeden Abschnitt mit einem Barriere-Stift (siehe Tabelle der Materialien). Lassen Sie die Barriere für 1 min vollständig trocknen.</li>
</ol>2. Vorbehandlung des Gehirns Abschnitte
<ol><li>Schalten Sie den Ofen und stellen Sie die Temperatur auf 40 ° C.</li>
	<li>3 Tropfen (90 µL) Vorbehandlung 4 Reagenz (siehe Tabelle der Materialien) auf jedes Gehirn Prüfungsteil (eine pro Folie).</li>
	<li>Die Abschnitte für 30 min bei RT inkubieren</li>
	<li>Tauchen Sie die Folien mit 1 X PBS-Puffer für 1 min bei RT. Repeat mit frischen 1 X PBS. Hinweis: Dias sollte nicht mit 1 X PBS-Puffer für länger als 15 Minuten bleiben.</li>
</ol>3. RNA In Situ Hybridisierung fluoreszierende Multiplex-Assays
<ol><li>Erwärmen Sie die Ziel-Sonde für 10 min bei 40 ° C im Wasserbad und kühlen Sie ab, RT</li>
	<li>Legen Sie die RNA-Reagenz (z. B. Amp 1-4 FL) bei RT</li>
	<li>Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit aus Folien mit saugfähigem Papier und Ort wieder auf die Folie-Rack (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Geben Sie 3 Tropfen (90 µL) der Drd1α Sonde (C1) auf die Probe-Scheibe. 2 h bei 40 ° c inkubieren</li>
	<li>Tauchen Sie Folien in 1 x Waschpuffer für 2 Minuten bei RT Repeat mit frischen 1 x Waschpuffer.</li>
	<li>Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit aus den Folien mit saugfähigem Papier und Ort wieder auf die Folie-Rack (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Fügen Sie 3 Tropfen (90 µL) von Amp 1-FL auf die Probe-Scheibe. 30 min bei 40 ° c inkubieren</li>
	<li>Tauchen Sie Folien in 1 Waschpuffer für 2 min bei RT. Repeat mit frischen 1wash-Puffer.</li>
	<li>Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit aus den Folien mit saugfähigem Papier und Ort wieder auf die Folie-Rack (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Fügen Sie 3 Tropfen (90 µL) des Amp 2-FL auf die Probe-Scheibe. 15 min bei 40 ° c inkubieren</li>
	<li>Tauchen Sie Folien in 1 x Waschpuffer für 2 Minuten bei RT Repeat mit frischen 1 x Waschpuffer.</li>
	<li>Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit aus den Folien mit saugfähigem Papier und Ort wieder auf die Folie-Rack (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Fügen Sie 3 Tropfen (90 µL) von Amp 3-FL auf die Probe-Scheibe. 30 min bei 40 ° c inkubieren</li>
	<li>Tauchen Sie Folien in 1 x Waschpuffer für 2 min bei RT. Repeat mit frischen 1 x Waschpuffer.</li>
	<li>Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit aus den Folien mit saugfähigem Papier und Ort wieder auf die Folie-Rack (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Fügen Sie 3 Tropfen (90 µL) von Amp 4-FL-Alt A auf die Probe-Scheibe. 15 min bei 40 ° c inkubieren</li>
	<li>Tauchen Sie Folien in 1 x Waschpuffer für 2 Minuten bei RT Repeat mit frischen 1 x Waschpuffer.</li>
	<li>Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit aus Folien und sofort 2 Tropfen Reagenz Montage (siehe Tabelle der Materialien) auf jedem Abschnitt.</li>
	<li>Ein 22 mm-22 mm-Deckglas zu platzieren (siehe Tabelle der Materialien) über jeden Abschnitt des Gehirns.</li>
	<li>Lagern Sie Folien im Dunkeln bei 2 bis 8 ° C trocken.</li>
	<li>Schalten Sie das konfokale Mikroskop und wechseln Sie zu einem 60 X Objektiv.</li>
	<li>Z-Stapel Bilder mit einem konfokalen Mikroskop zu erhalten. Sehen Sie das ergänzende Video für ein Detail-Verfahren der konfokalen Abbildung.</li>
	<li>Bilder von Drd1α Zellen in der Nucleus Accumbens Region beschriftet (Anregung: 488 nm; Emission: 515/30 nm). Hinweis: Nicht in lassen Sie Gehirn, die Abschnitte zwischen Inkubationsschritte austrocknen.</li>
</ol>(4) Datenanalyse
<ol><li>Semi-quantitativ analysieren die Färbung Muster: "diskrete Punkte".<ol>
<li>Um die einzelnen Zelle aus dem Bild zu erkennen, führen Sie DAPI-Färbung als nukleare Marker. Es ist jedoch nach wie vor schwierig, bestimmte Teile des Gehirngewebes zu analysieren, da es mehrere Arten von Zellen mit unregelmäßiger Form von Kernen und/oder Zellen hat. Hier ordnen zwei erfahrene Forscher separat jede Zelle von Bildern zu Zelle definieren.</li>
		<li>Punkten Sie optisch jede Zelle innerhalb der repräsentativen konfokale Bilder basierend auf der Anzahl der Punkte pro Zelle anhand spezifischer Kriterien (Abbildung 1 b).</li>
		<li>Bestimmen Sie die Ergebniszelle Anzahl in jeder Kategorie und dividieren durch die Anzahl der Ergebniszelle X100, relative Häufigkeit Diagramme erstellen, die die prozentuale Häufigkeit der Zellen innerhalb jeder Kategorie für alle Gewebeschnitte (Abbildung 2A) und für Männer und Frauen anzeigen separat (Abb. 2E).</li>
		<li>Teilen Sie die Summe der Zellen in allen vorherigen Kategorien durch die Ergebniszelle Anzahl X100 die kumulative Häufigkeit von Zellen für alle Gewebeschnitte (Abb. 2 b) und für Männer und Frauen getrennt zu bestimmen (Abb. 2F).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die "diskrete Punkte" Färbung Muster (Optional) statistisch zu analysieren.<ol>
<li>Prüfen Sie die Anzahl der Punkte pro Zelle zu einer kategorialen Variablen, die in der Natur (d. h. die Anzahl der Zellen, die vom niedrigsten Zelle Ausdruck (1) zum höchsten Zelle Ausdruck (9) in jeder Rang Kategorie fallen) ordinal ist für weitere statistische Auswertungen.</li>
		<li>Nach Prüfung der deskriptiven Statistik verwenden drei Ansätze: eine Mantel-Haenszel-Statistik, ein Mann-Whitney U-Test und Kruskal-Wallis-Test. Obwohl der genaue statistische Ansatz abhängig sein wird kann die experimentellen Design und Forschung Frage von Interesse, eine statistische Entscheidungsbaum (Abbildung 4) Hilfe bei Entscheidungen bezüglich des analytischen Ansatzes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quantifizieren der Signalintensität in der Region of Interest (ROI) für das Beflecken Muster: "Cluster".<ol>
<li>Berechnen Sie die Signalstärke der einzelnen Bilder unter Verwendung der folgenden Gleichung: Signal-Intensität = Gesamtintensität des ROI Bild - (durchschnittliche Intensität × Gesamtbild Hintergrundbereich)</li>
		<li>Zählen Sie die Gesamtzahl der Zellen innerhalb von ROI-Bild, um den ungefähren Signal Ausdruck pro Zelle zu berechnen. Gruppenunterschiede in Signal Intensität/Bild sowie die Anzahl der Zellen/Bild möglicherweise von Interesse Mechanismen zu berücksichtigen, die zur Gruppenunterschiede in Signal Ausdruck/Zelle beitragen können (Abb. 3 b-3D).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die "Cluster" Färbung Muster (Optional) statistisch zu analysieren.<ol>
<li>Untersuchen Sie die Signal Ausdruck/Zelle, um eine kontinuierliche Variable für weitere statistische Auswertungen zur Verfügung zu stellen. Verwenden Sie zwei Ansätze, inklusive einer unabhängigen Stichproben t-Test und Varianzanalyse (ANOVA), basierend auf der Anzahl der Faktoren zwischen Themen in die Gestaltung einbezogen. Ein statistische Entscheidungsbaum (Abb. 4) kann helfen bei der Entscheidungsfindung bezüglich der am besten geeignete statistische Ansatz.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Goldman-Rakic, P. S., Castner, S. A., Svensson, T. H., Siever, L. J., Williams, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+dopamine+D1+receptor+in+schizophrenia:+insights+for+cognitive+dysfunction.">Targeting the dopamine D1 receptor in schizophrenia: insights for cognitive dysfunction.</a> Psychopharmacology (Berl). 174 (1), 3-16 (2004).</li><li>Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology,+signaling,+and+pharmacology+of+dopamine+receptors.">The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors.</a> Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).</li><li>Zahrt, J., Taylor, J. R., Mathew, R. G., Arnsten, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supranormal+stimulation+of+D1+dopamine+receptors+in+the+rodent+prefrontal+cortex+impairs+spatial+working+memory+performance.">Supranormal stimulation of D1 dopamine receptors in the rodent prefrontal cortex impairs spatial working memory performance.</a> J Neurosci. 17, 8528-8535 (1997).</li><li>Floresco, S. B., Magyar, O., Ghods-Sharifi, S., Vexelman, C., Tse, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+dopamine+receptor+subtypes+in+the+medial+prefrontal+cortex+of+the+rat+regulate+set-shifting.">Multiple dopamine receptor subtypes in the medial prefrontal cortex of the rat regulate set-shifting.</a> Neuropsychopharmacology. 31, 297-309 (2006).</li><li>Arnsten, A. F., Girgis, R. R., Gray, D. L., Mailman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+dopamine+therapeutics+for+cognitive+deficits+in+schizophrenia.">Novel dopamine therapeutics for cognitive deficits in schizophrenia.</a> Biol Psychiatry. 81, 67-77 (2017).</li><li>Ellenbroek, B. A., Budde, S., Cools, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prepulse+inhibition+and+latent+inhibition:+the+role+of+dopamine+in+the+medial+prefrontal+cortex.">Prepulse inhibition and latent inhibition: the role of dopamine in the medial prefrontal cortex.</a> Neuroscience. 75 (2), 535-542 (1996).</li><li>Parker, K. L., Alberico, S. L., Miller, A. D., Narayanan, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prefrontal+D1+dopamine+signaling+is+necessary+for+temporal+expectation+during+reaction+time+performance.">Prefrontal D1 dopamine signaling is necessary for temporal expectation during reaction time performance.</a> Neuroscience. 255, 246-254 (2013).</li><li>Manduca, A., Servadio, M., Damsteegt, R., Campolongo, P., Vanderschuren, L. J., Trezza, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopaminergic+Neurotransmission+in+the+Nucleus+Accumbens+Modulates+Social+Play+Behavior+in+Rats.">Dopaminergic Neurotransmission in the Nucleus Accumbens Modulates Social Play Behavior in Rats.</a> Neuropsychopharmacology. 41 (9), 2215-2223 (2016).</li><li>Okubo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+prefrontal+dopamine+D1+receptors+in+schizophrenia+revealed+by+PET.">Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET.</a> Nature. 385 (6617), 634-636 (1997).</li><li>Abi-Dargham, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prefrontal+dopamine+D1+receptors+and+working+memory+in+schizophrenia.">Prefrontal dopamine D1 receptors and working memory in schizophrenia.</a> J Neurosci. 22 (9), 3708-3719 (2002).</li><li>Shinohara, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+D1+receptor+subtype+mediates+acute+stress-induced+dendritic+growth+in+excitatory+neurons+of+the+medial+prefrontal+cortex+and+contributes+to+suppression+of+stress+susceptibility+in+mice.">Dopamine D1 receptor subtype mediates acute stress-induced dendritic growth in excitatory neurons of the medial prefrontal cortex and contributes to suppression of stress susceptibility in mice.</a> Mol Psychiatry. 19, (2017).</li><li>Okubo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+prefrontal+dopamine+D1+receptors+in+schizophrenia+revealed+by+PET.">Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET.</a> Nature. 385, 634-636 (1997).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The rat brain in stereotaxic coordinates. , (2014).</li></ol>

Es gibt keine Interessenkonflikte zu erklären.

In diesem Protokoll beschreiben wir eine neuartige Technik der in Situ Hybridisierung für Tiefkühlfrische Gehirnscheiben, Drd1α-Rezeptor-Expression in dem Nucleus Accumbens (NAc) und Tyrosin-Hydroxylase (TH)-Ausdruck in der Substantia Nigra (SNR) Region zu bewerten. Wir bieten auch Methoden der Datenanalyse für unterschiedliche Färbung Muster: "diskrete Dot" oder "Cluster".
Die entscheidenden Schritte für einen erfolgreichen Multiplex-Fluoreszenz RNA-Assay in Situ Hybri...

Dysfunktion des striatalen Dopamin-Systems beteiligt sich das Fortschreiten der klinischen Symptome bei mehreren neurokognitiven Krankheiten beobachtet. Dopamin-D1-Rezeptoren sind in den präfrontalen Kortex (PFC) und striatalen Regionen des Gehirns und stark beeinflussen kognitive Prozesse1, einschließlich der Verwendung von Speicher, zeitliche Verarbeitung und Lokomotive Verhalten2,3 , 4 , 5 , 6 , 7. frühere Studien aufgeklärt, dass Änderungen der Dopaminrezeptoren D1 verbunden mit dem Fortschreiten der Aufmerksamkeit Defizit-Hyperaktivität-Störung (ADHS)8, die neurokognitiven Symptome bei Schizophrenie9, waren 10 und Stress Anfälligkeit11. Insbesondere bei Schizophrenie zufolge Positronen-Emissions-Tomographie (PET) Studien die Bindungsfähigkeit der Dopamin-D1-Rezeptoren in den präfrontalen Cortex hoch mit kognitiven Defiziten und die Anwesenheit von negativen Symptomen11zusammenhing. Das dendritische Wachstum der exzitatorischen Neuronen im präfrontalen Cortex von Dopamin D1-Rezeptor reguliert lindert Stressempfindlichkeit. Darüber hinaus könnte die Knockdown von D1-Rezeptor im medialen präfrontalen kortikalen (mPFC) Neuronen soziale Niederlage Stress-induzierte soziale Vermeidung12verbessern.
Hier stellen wir eine neuartige Technik der RNA in Situ Hybridisierung, einzelnen RNA-Moleküle in einer Zelle mit Tiefkühlfrische Gewebeproben zu visualisieren. Das vorliegende Verfahren hat mehrere Vorteile gegenüber Methoden, die in der aktuellen Literatur vorhanden sind. Zuerst die aktuelle Prozedur bewahrt den räumlichen und morphologischen Kontext des Gewebes und wurde am Tiefkühlfrische Gewebeproben durchgeführt, so dass andere Verfahren, die frische, nicht eingebettete Gewebe mit den aktuellen Methoden kombiniert werden können. Ähnliche Verfahren in Formalin fixiert und Paraffin-eingebetteten Gewebe haben gezeigt, dass einzelne Transkription Auflösung mit einer RNA in Situ Hybridisierung Technik13erreicht werden kann. Erkennung von RNA Ebene der einzelnen Transkription bietet höhere Sensitivität zu niedrigen Kopie Zahlenausdruck sowie die Möglichkeit, Genexpression auf der Ebene einzelner Zellen vergleichen, die von anderen Nukleinsäure-Nachweismethoden nicht erreicht werden kann, wie Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Techniken. Darüber hinaus unterhält die aktuelle Methode Bilder mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis durch hochspezifische RNA-Sonden, die hybridisiert, einzelnes Ziel-RNA-Transkripte und nacheinander gebunden mit einer Kaskade von Signalmolekülen Verstärkung bei der Erkennung System. Zu guter Letzt bietet die gegenwärtige Technologie die Möglichkeit, mehrere biologische Systeme mit der Target-spezifische proprietären Sonden, anstatt unsere Untersuchung auf nur eine Klasse von systembezogenen Markierungen wie Proteindetektion durch Begrenzung zu bewerten immunhistochemische Methoden.
In unserer Studie haben wir diese neuartige RNA in Situ Hybridisierung, um Drd1α-Rezeptor-Expression in dem Nucleus Accumbens (NAc) und Tyrosin-Hydroxylase (TH)-Ausdruck in der Substantia Nigra (SNR) zu bewerten sowohl weibliche als auch männliche F344/N Ratten verwendet. Die innovative RNA in Situ Hybridisierung konnten wir Mechanismen beeinflussen DA Aufnahme und DA Freigabe gleichzeitig, ein besseres Verständnis der Komplexität der striatalen DA System zu untersuchen. Hier beschreiben wir die Vorgehensweise Tiefkühlfrische Gehirn Scheiben und Methoden der Datenanalyse für unterschiedliche Färbung Muster: "diskrete Dot" oder "Cluster".

<table><tbody><tr><td>HybEZ Oven system</td><td>Advanced Cell Diagnostics&amp;nbsp;</td><td>310010</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope Probe - Rn-Drd1a</td><td>Advanced Cell Diagnostics&amp;nbsp;</td><td>317031</td><td>Color channel 1, Green</td></tr><tr><td>RNAscope Probe - Rn-Th-C2</td><td>Advanced Cell Diagnostics&amp;nbsp;</td><td>314651-C2</td><td>Color channel 2, Orange</td></tr><tr><td>RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit</td><td>Advanced Cell Diagnostics&amp;nbsp;</td><td>320850</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen</td><td>Vector Laboratory</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-154%&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sevoflurane</td><td>Merritt Veterinary Supply</td><td>347075</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek vertical 24 slide rack</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9837976</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek staining dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0731403</td><td></td></tr><tr><td>Precision General Purpose Baths</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>TSGP28</td><td></td></tr><tr><td>Pretreatment 4</td><td>Advanced Cell Diagnostics&amp;nbsp;</td><td>320850</td><td>parts of kits</td></tr><tr><td>ProLong Gold anti-fade reagent</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Amp 1-FL</td><td>Advanced Cell Diagnostics&amp;nbsp;</td><td>320850</td><td>parts of kits</td></tr><tr><td>Amp 2-FL</td><td>Advanced Cell Diagnostics&amp;nbsp;</td><td>320850</td><td>parts of kits</td></tr><tr><td>Amp 3-FL</td><td>Advanced Cell Diagnostics&amp;nbsp;</td><td>320850</td><td>parts of kits</td></tr><tr><td>Amp 4-FL-Alt A</td><td>Advanced Cell Diagnostics&amp;nbsp;</td><td>320850</td><td>parts of kits</td></tr><tr><td>EZ-C1 software package</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>version 3.81b</td></tr><tr><td>SAS/STAT Software</td><td>SAS Institute, Inc.,</td><td></td><td>version 9.4</td></tr></tbody></table>

identification of dopamine d1-alpha receptor within rodent nucleus accumbens by an innovative rna in situ detection technology

In das zentrale Nervensystem ist der D1-Alpha-Rezeptor Subtyp (Drd1α) die am häufigsten vorkommende Dopamin (DA)-Rezeptor, der spielt eine wichtige Rolle bei der Regulierung der neuronale Wachstum und Entwicklung. Die Mechanismen, die Drd1α Rezeptor Anomalien Vermittlung Verhaltensreaktionen und modulierende Working Memory-Funktion sind jedoch noch unklar. Mit einem neuartigen RNA in Situ Hybridisierung Assay, identifiziert die aktuelle Studie Drd1α Dopamin Rezeptor und Tyrosin Hydroxylase (TH) RNA Ausdruck von DA-bezogene Schaltungen in den Nucleus Accumbens (NAc) Bereich und Substantia Nigra Region (SNR), bzw.. Drd1α Ausdruck in der NAc zeigt einen "diskrete Dot" Färbung Muster. Deutliche Geschlechtsunterschiede in Drd1α Ausdruck wurden beobachtet. Im Gegensatz dazu zeigt TH ein "gruppierte" Färbung Muster. Zu TH Ausdruck angezeigt weibliche Ratten einen höheren Signal Ausdruck pro Zelle im Vergleich zu männlichen Tieren. Die hier vorgestellten Methoden bieten eine neuartige in Situ Hybridisierung Technik für die Untersuchung von Veränderungen der Dopamin-System Funktionsstörung während das Fortschreiten der Erkrankungen des zentralen Nervensystems.

Die aktuelle Studie beobachtet eine "diskrete Punkte" Färbung Muster für RNA-Expression in den Dopamin-D1-Alpha-Rezeptoren (Drd1α) von der NAc in F344/N Ratten (Abbildung 1A). Einzelnen Fluoreszenz Signale waren leicht zu erkennen und zu sehen als einzigen "Dots", von denen jede einen einzelnen RNA-Transkript innerhalb der Zelle darstellt. Für Bilder von der NAc, die die "diskrete Punkte" Färbung Muster zeigen, untersuchten wir den dynamischen Bereich de...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology at JoVE.com

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

Identifizierung von Dopamin-D1-Alpha-Rezeptor im Nagetier Nucleus Accumbens durch eine Innovative RNA- In Situ -Detection-Technologie

Identifikation der Dopamin-D1-Alpha-Rezeptor in dem Nucleus Accumbens ist von entscheidender Bedeutung für die Klärung von D1-Rezeptor Dysfunktion während eine Erkrankung des zentralen Nervensystems. Wir haben einen neuartigen RNA in Situ Hybridisierung-Assay um einzelne RNA-Moleküle in einem bestimmten Hirnareal zu visualisieren.

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in ...

identification-dopamine-d1-alpha-receptor-within-rodent-nucleus

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

8.5K Aufrufe.  University of South Carolina. Identifikation der Dopamin-D1-Alpha-Rezeptor in dem Nucleus Accumbens ist von entscheidender Bedeutung für die Klärung von D1-Rezeptor Dysfunktion während eine Erkrankung des zentralen Nervensystems. Wir haben einen neuartigen RNA in Situ Hybridisierung-Assay um einzelne RNA-Moleküle in einem bestimmten Hirnareal zu visualisieren.

Serie: Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

Comprehensive Profiling of Dopamine Regulation in Substantia Nigra and Ventral Tegmental Area

Dopamine is a vigorously studied neurotransmitter in the CNS. Indeed, its involvement in locomotor activity and reward-related behaviour has fostered five decades of inquiry into the molecular deficiencies associated with dopamine regulation. The majority of these inquiries of dopamine regulation in the brain focus upon the molecular basis for its regulation in the terminal field regions of the nigrostriatal and mesoaccumbens pathways; striatum and nucleus accumbens. Furthermore, such studies have concentrated on analysis of dopamine tissue content with normalization to only wet tissue weight. Investigation of the proteins that regulate dopamine, such as tyrosine hydroxylase (TH) protein, TH phosphorylation, dopamine transporter (DAT), and vesicular monoamine transporter 2 (VMAT2) protein often do not include analysis of dopamine tissue content in the same sample. The ability to analyze both dopamine tissue content and its regulating proteins (including post-translational modifications) not only gives inherent power to interpreting the relationship of dopamine with the protein level and function of TH, DAT, or VMAT2, but also extends sample economy. This translates into less cost, and yet produces insights into the molecular regulation of dopamine in virtually any paradigm of the investigators' choice.
We focus the analyses in the midbrain. Although the SN and VTA are typically neglected in most studies of dopamine regulation, these nuclei are easily dissected with practice. A comprehensive readout of dopamine tissue content and TH, DAT, or VMAT2 can be conducted. There is burgeoning literature on the impact of dopamine function in the SN and VTA on behavior, and the impingements of exogenous substances or disease processes therein 1-5. Furthermore, compounds such as growth factors have a profound effect on dopamine and dopamine-regulating proteins, to a comparatively greater extent in the SN or VTA 6-8. Therefore, this methodology is presented for reference to laboratories that want to extend their inquiries on how specific treatments modulate behaviour and dopamine regulation. Here, a multi-step method is presented for the analyses of dopamine tissue content, the protein levels of TH, DAT, or VMAT2, and TH phosphorylation from the substantia nigra and VTA from rodent midbrain. The analysis of TH phosphorylation can yield significant insights into not only how TH activity is regulated, but also the signaling cascades affected in the somatodendritic nuclei in a given paradigm.
We will illustrate the dissection technique to segregate these two nuclei and the sample processing of dissected tissue that produces a profile revealing molecular mechanisms of dopamine regulation in vivo, specific for each nuclei (Figure 1).

Dopamine is distinctly regulated in the midbrain nuclei, which contain the cell bodies and dendrites of the dopamine neurons. Here we describe a dissection and sample-handling approach to maximize results, and thus conclusions and insights, on dopamine regulation in the midbrain nuclei of the substantia nigra (SN) and ventral tegmental area (VTA) in rodents.

Umfassende Profilierung der Verordnung Dopamin in der Substantia nigra und ventralen Tegmentum

Dopamine is a vigorously studied neurotransmitter in the CNS. Indeed, its involvement in locomotor activity and reward-related behaviour has fostered five ...

Forschung

Neurowissenschaften

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue sections on a microscope slide. When combined with immunohistochemistry, LCM can be used to isolate individual cells types based on a specific protein marker. Here, the LCM technique is described for collecting a specific population of dopamine neurons directly labeled with&#160;tyrosine hydroxylase immunohistochemistry and for isolation of the dopamine neuron containing region of the ventral tegmental area using indirect tyrosine hydroxylase immunohistochemistry on a section adjacent to those used for LCM. An infrared (IR) capture laser is used to both dissect individual neurons as well as the ventral tegmental area off glass slides and onto an LCM cap for analysis. Complete dehydration of the tissue with 100% ethanol and xylene is critical. The combination of the IR capture laser and the ultraviolet (UV) cutting laser is used to isolate individual dopamine neurons or the ventral tegmental area when using PEN membrane slides. A PEN membrane slide has significant advantages over a glass slide as it offers better consistency in capturing and collecting cells, is faster collecting large pieces of tissue, is less reliant on dehydration and results in complete removal of the tissue from the slide. Although removal of large areas of tissue from a glass slide is feasible, it is considerably more time consuming and frequently leaves some residual tissue behind. Data shown here demonstrate that RNA of sufficient quantity and quality can be obtained using these procedures for quantitative PCR measurements. Although RNA and DNA are the most commonly isolated molecules from tissue and cells collected with LCM, isolation and measurement of microRNA, protein and epigenetic changes in DNA can also benefit from the enhanced anatomical and cellular resolution obtained using LCM.

The isolation of individual dopamine neurons or the ventral tegmental area with direct or indirect immunohistochemistry is demonstrated using laser capture microdissection. Parameters for isolation of tissue from a glass slide using an infrared laser and from membrane slides using the combination of an infrared and ultraviolet laser are discussed.

Laser Mikrodissektion - Eine Demonstration der Isolation der einzelnen Dopamin-Neuronen und die gesamte ventrale Tegmentum

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for maintenance, repair or neurodegeneration in postdevelopmental periods. High throughput analyses have recently revealed that axons have a more dynamic and complex transcriptome than previously expected. These analysis, however have been mostly done in cultured neurons where axons can be isolated from the somato-dendritic compartments. It is virtually impossible to achieve such isolation in whole tissues in vivo. Thus, in order to verify the recruitment of mRNAs and their functional relevance in a whole animal, transcriptome analyses should ideally be combined with techniques that allow the visualization of mRNAs in situ. Recently, novel ISH technologies that detect RNAs at a single-molecule level have been developed. This is especially important when analyzing the subcellular localization of mRNA, since localized RNAs are typically found at low levels. Here we describe two protocols for the detection of axonally-localized mRNAs using a novel ultrasensitive RNA ISH technology. We have combined RNAscope ISH with axonal counterstain using fluorescence immunohistochemistry or histological dyes to verify the recruitment of Atf4 mRNA to axons in vivo in the mature mouse and human brains.

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

Nachweis von Axonally lokalisierten mRNAs in Gehirnschnitten mittels hochauflösender<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridization

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin (5-hydroxytryptamine; 5-HT) syndrome. This hypothesis can be tested using in situ hybridization to detect the serotonin 5-HT2A receptor gene htr2a. In the past, such procedures, utilizing radioactive riboprobe, were difficult because of the complicated workflow that needs several days to perform and the added difficulty that the technique required the use of fresh frozen tissues maintained in an RNase-free environment. Recently, the development of short oligonucleotide probes has simplified in situ hybridization procedures and allowed the use of paraformaldehyde-prefixed brain sections, which are more widely available in laboratories. Here, we describe a detailed protocol using non-radioactive oligonucleotide probes on the prefixed brain tissues. Hybridization probes used for this study include dapB (a bacterial gene coding for dihydrodipicolinate reductase), ppiB (a housekeeping gene coding for peptidylprolyl isomerase B), and htr2a (a serotonin gene coding for 5-HT2A receptors). This method is relatively simply, cheap, reproducible and requires less than two days to complete.

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

This protocol describes a rapid and simplified in situ hybridization method ideal forparaformaldehyde-prefixed brain, thus reducing the need for prolonged complex steps while using fresh frozen tissues. The method is validated using the identification of the serotonin 5-HT2A receptor gene htr2a in rats.

Schnelle<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung unter Verwendung von Oligonukleotidsonden auf Paraformaldehyd-Präfix Gehirn von Ratten mit Serotonin-Syndrom

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin ...

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, leading to bradykinesia, rigidity, and tremor. The identification of living dopaminergic neurons in primary Ventral Mesencephalic (VM) cultures using a fluorescent marker provides an alternative way to study the selective vulnerability of these neurons without relying on the immunostaining of fixed cells. Here, we isolate, dissociate, and culture mouse VM neurons for 3 weeks. We then identify dopaminergic neurons in the cultures using eGFP fluorescence (driven by a Tyrosine Hydroxylase (TH) promoter). Individual neurons are harvested into microcentrifuge tubes using glass micropipettes. Next, we lyse the harvested cells, and conduct cDNA synthesis and transposon-mediated &#34;tagmentation&#34; to produce single cell RNA-Seq libraries1,2,3,4,5. After passing a quality-control check, single-cell libraries are sequenced and subsequent analysis is carried out to measure gene expression. We report transcriptome results for individual dopaminergic and GABAergic neurons isolated from midbrain cultures. We report that 100% of the live TH-eGFP cells that were harvested and sequenced were dopaminergic neurons. These techniques will have widespread applications in neuroscience and molecular biology.

In Parkinson&#39;s Disease (PD), Substantia Nigra (SNc) dopaminergic neurons degenerate, leading to motor dysfunction. Here we report a protocol for culturing ventral midbrain neurons from a mouse expressing eGFP driven by a Tyrosine Hydroxylase (TH) promoter sequence, harvesting individual fluorescent neurons from the cultures, and measuring their transcriptome using RNA-seq.

Zuverlässige Identifikation von Wohn dopaminerge Neurone in Mittelhirns Kulturen unter Verwendung von RNA-Sequenzierung und TH-Promotor getriebene eGFP Expression

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

Semi-Quantitative Determination of Dopaminergic Neuron Density in the Substantia Nigra of Rodent Models using Automated Image Analysis

Estimation of the number of dopaminergic neurons in the substantia nigra is a key method in pre-clinical Parkinson's disease research. Currently, unbiased stereological counting is the standard for quantification of these cells, but it remains a laborious and time-consuming process, which may not be feasible for all projects. Here, we describe the use of an image analysis platform, which can accurately estimate the quantity of labeled cells in a pre-defined region of interest. We describe a step-by-step protocol for this method of analysis in rat brain and demonstrate it can identify a significant reduction in tyrosine hydroxylase positive neurons due to expression of mutant &#945;-synuclein in the substantia nigra. We validated this methodology by comparing with results obtained by unbiased stereology. Taken together, this method provides a time-efficient and accurate process for detecting changes in dopaminergic neuron number, and thus is suitable for efficient determination of the effect of interventions on cell survival.

Here we present an automated method for semi-quantitative determination of dopaminergic neuron number in the rat substantia nigra pars compacta.

Semi-quantitative Bestimmung der dopaminergen Neuronendichte in der Substantia Nigra von Nagetiermodellen mittels automatisierter Bildanalyse

Estimation of the number of dopaminergic neurons in the substantia nigra is a key method in pre-clinical Parkinson's disease research. Currently, unbiased ...

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular biology has been greatly fueled by the discovery of noncoding RNAs as major players in post-transcriptional regulation. Such a revolutionary perspective has been accompanied and triggered by the development of powerful technologies for profiling short RNAs expression, both at the high-throughput level (genome-wide identification) or as single-candidate analysis (steady state accumulation of specific species). Although several state-of-art strategies are currently available for dosing or visualizing such fleeing molecules, Northern Blot assay remains the eligible approach in molecular biology for immediate and accurate evaluation of RNA expression. It represents a first step toward the application of more sophisticated, costly technologies and, in many cases, remains a preferential method to easily gain insights into RNA biology. Here we overview an efficient protocol (Enhanced Northern Blot) for detecting weakly expressed microRNAs (or other small regulatory RNA species) from Drosophila melanogaster whole embryos, manually dissected larval/adult tissues or in vitro cultured cells. A very limited amount of RNA is required and the use of material from flow cytometry-isolated cells can be also envisaged.

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The aim of this publication is to visualize and discuss the operative steps of an Enhanced Northern Blot protocol on RNA extracted from Drosophila melanogaster embryos, cells, and tissues. This protocol is particularly useful for the efficient detection of small RNA species.

Verbesserte Northern Blot Detektion von kleinen RNA-Spezies in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

Biologie

Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization

This study describes a protocol for the multiplex in situ hybridization (ISH) of the mouse jugular-nodose ganglia, with a particular emphasis on detecting the expression of G protein-coupled receptors (GPCRs). Formalin-fixed jugular-nodose ganglia were processed with the RNAscope technology to simultaneously detect the expression of two representative GPCRs (cholecystokinin and ghrelin receptors) in combination with one marker gene of either nodose (paired-like homeobox 2b, Phox2b) or jugular afferent neurons (PR domain zinc finger protein 12, Prdm12). Labeled ganglia were imaged using confocal microscopy to determine the distribution and expression patterns of the aforementioned transcripts. Briefly, Phox2b afferent neurons were found to abundantly express the cholecystokinin receptor (Cck1r) but not the ghrelin receptor (Ghsr). A small subset of Prdm12 afferent neurons was also found to express Ghsr and/or Cck1r. Potential technical caveats in the design, processing, and interpretation of multiplex ISH are discussed. The approach described in this article may help scientists in generating accurate maps of the transcriptional profiles of vagal afferent neurons.

Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization

Multiplex in situ hybridization (ISH) was employed to simultaneously visualize the transcripts for two G protein-coupled receptors and one transcription factor in the entire vagal ganglionic complex of the adult mouse. This protocol could be used to generate accurate maps of the transcriptional profiles of vagal afferent neurons.

Nachweis der G-Protein-gekoppelten Rezeptorexpression in vagalen afferenten Neuronen der Maus mittels Multiplex-In-situ-Hybridisierung

This study describes a protocol for the multiplex in situ hybridization (ISH) of the mouse jugular-nodose ganglia, with a particular emphasis on detecting ...

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell imaging studies. Methods for detecting RNAs have expanded greatly since seminal studies linked site-specific mRNA localization to gene expression regulation. Dynamic mRNA processes can now be visualized via approaches that detect mRNAs, coupled with microscopy set-ups that are fast enough to capture the dynamic range of molecular behavior. The molecular beacon technology is a hybridization-based approach capable of direct detection of endogenous transcripts in living cells. Molecular beacons are hairpin-shaped, internally quenched, single-nucleotide discriminating nucleic acid probes, which fluoresce only upon hybridization to a unique target sequence. When coupled with advanced fluorescence microscopy and high-resolution imaging, they enable one to perform spatial and temporal tracking of intracellular movement of mRNAs. Although this technology is the only method capable of detecting endogenous transcripts, cell biologists have not yet fully embraced this technology due to difficulties in designing such probes for live cell imaging. A new software application, PinMol, allows for enhanced and rapid design of probes best suited to efficiently hybridize to mRNA target regions within a living cell. In addition, high-resolution, real-time image acquisition and current, open source image analysis software allow for a refined data output, leading to a finer evaluation of the complexity underlying the dynamic processes involved in the mRNA&#39;s life cycle.
Here we present a comprehensive protocol for designing and delivering molecular beacons into Drosophila melanogaster egg chambers. Direct and highly specific detection and visualization of endogenous maternal mRNAs is performed via spinning disc confocal microscopy. Imaging data is processed and analyzed using object detection and tracking in Icy software to obtain details about the dynamic movement of mRNAs, which are transported and localized to specialized regions within the oocyte.

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Here, we present a protocol for the visualization, detection, analysis and tracking of endogenous mRNA trafficking in live Drosophila melanogaster egg chamber using molecular beacons, spinning disc confocal microscopy, and open-source analysis software.

Visualisierung und Verfolgung endogenes mRNAs in Live Drosophila melanogaster Eierkammern

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...

Monitoring Dopamine Release in a Rat Model with VTA Dopaminergic Neuron Receptor Manipulation

Source: Wickham, R. J., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/60886">Combined Infusion and Stimulation with Fast-Scan Cyclic Voltammetry (CIS-FSCV) to Assess Ventral Tegmental Area Receptor Regulation of Phasic Dopamine.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video demonstrates the implantation of electrodes and cannulas in an anesthetized rat to measure dopamine release in the nucleus accumbens using a potentiostat and the infusion of drugs to modulate dopaminergic activity in the ventral tegmental area.

Überwachung der Dopaminfreisetzung in einem Rattenmodell mit VTA-Manipulation des dopaminergen Neuronenrezeptors

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

Identifizierung von Dopamin-D1-Alpha-Rezeptor im Nagetier Nucleus Accumbens durch eine Innovative RNA- In Situ -Detection-Technologie

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Kapitel in diesem Video