Diese Arbeit wurde von Startup-Fonds von der University of Nevada, Reno und NIGMS des National Institute of Health unter Grant-Nummer P20 GM103650 unterstützt.

1. Aufbau einer Verhalten-Arena und Vorbereitung Hardware optogenetische Stimulation im Bereich Verhalten aktivieren
<ol><li>Um eine Licht-beraubt Verhalten-Arena zu bauen, bauen eine Box mit einer Dimension von 89 x 61 x 66 cm3 (35" L x 24" W x 26" H) machte der schwarze farbige Plexiglas Acrylplatten (3 mm dick) (siehe Tabelle der Materialien). Materialien zu bauen so eine Box sollte bei lokalen Baumärkten erhältlich. Legen Sie dieses Feld auf eine Tischplatte im Verhalten Raum (Abb. 1A).</li>
	<li>Berg eine monochrome USB-3.0-CCD-Kamera mit IR-lang-Pass 830 nm Filter und eine 8 mm F1. 4 C-Mount-Objektiv ausgestattet (siehe Tabelle der Materialien), die Mitte der Decke der Black Box. Platz zwei Infrarot-LED-Streifen (siehe Tabelle der Materialien) auf der Tischplatte um die Larven in die dunkle Arena (Abb. 1A) zu beleuchten.</li>
	<li>Um die LED-Plattform zu erstellen, erhalten Sie eine 22 cm × 22 cm quadratische Aluminiumplatte (vorzugsweise spritzlackiert mit einem schwarzen Mattende keine Reflexionen zu beseitigen). Schneiden Sie in der Mitte der Platte, mit einem Metall Cutter ein Loch, das groß genug ist, um die CCD-Kamera passen.</li>
	<li>Decken Sie die Metallplatte mit roten LED-Lichtleisten (siehe Tabelle der Materialien). Solder LED Lichtleiste Drähte in Serie und füttern die Streifen Drähte in einem Optokoppler-Relais von einem Raspberry Pi 2 b Mikroprozessor gesteuert (siehe Tabelle der Materialien) (Abbildung 1B und 2).</li>
	<li>Installieren und Konfigurieren von Ubuntu Mate/Raspian Jesse/Linux-basierten Betriebssystem auf dem Raspberry Pi-Prozessor vor dem Verbinden der Optokoppler-Relais mit LED-Streifen. Schließen Sie ein Netzteil zur Stromversorgung der LED-Streifen und der Optokoppler (Abbildung 2) (siehe Tabelle der Materialien). Montieren Sie die LED-Plattform rund um die CCD-Kamera (Abbildung 1B). Hinweis: Betriebssystem Ubuntu Mate v16.04 ist frei verfügbar. Eine Reihe von einfachen Python basierte Befehle kann einfach Programm Muster der LED Lichtreize angepasst (siehe Datei Syntax).</li>
	<li>Homogene Bestrahlungsstärke an verschiedenen Punkten im Bereich Verhalten zu gewährleisten. Messen Sie die absolute Bestrahlungsstärke an der Oberfläche der Arena mit Hilfe eines Spektrometers und bestimmen Sie es ~1.3 W/m2 in der gesamten Oberfläche der Arena zu sein. Hinweis: Bei dieser Intensität wurden keine wesentlichen Änderungen in der Temperatur im Laufe der Experimente beobachtet. Eine andere Studie10 verwendet eine höhere Bestrahlungsstärke von ~1.9 W/m2 und keine Änderungen in der Temperatur im Laufe der Experimente beobachtet.</li>
</ol>2. Vorbereitung der Drosophila Larven Verhalten Analysen
<ol><li>Die fliegen auf standard fliegen Nahrung zu erhalten (siehe Tabelle der Materialien) bei 25 ° C, 50-60 % RH und ein 12 h/12 h hell/dunkel-Zyklus.</li>
	<li>
Um CsChrimson in ein einzelnes Paar von ORNs auszudrücken, überqueren jungfräuliche Weibchen aus einer FH-IVS-CsChrimson -Linie für Männer aus einer OrX Gal4 -Linie ("X" entspricht einer der 21 Larven Geruch Rezeptor (oder) Gene, die in jedem eindeutig ausgedrückt werden von 21 Paaren von ORNs)9,11.
	<ol>
<li>Abwechselnd, um CsChrimson in allen 21 Larven ORNs auszudrücken, Kreuz jungfräulichen Weibchen aus einem FH-IVS-CsChrimson Linie zu Männchen aus einer Orco-Gal4 -Linie ("Orco" ist die Ko-Rezeptor, der in allen 21 ORNs zum Ausdruck kommt).</li>
		<li>Verwenden Sie FH-IVS-CsChrimson Linie selbst als ein Steuerelement in diesen Experimenten. Hinweis: Die Fliege Bestände hier aufgeführten stehen alle in Bloomington Drosophila Stock Center (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Übertragen Sie männliche und weibliche fliegen in ein Kreuz dürfen zu Paaren und Eier für 48 h, Erwachsene zu einem frischen Fläschchen.
	<ol>
<li>Fügen Sie an die Oberfläche der Lebensmittel Durchstechflasche mit Eiern 400 µL ein Gemisch mit 400 µM All-Trans Retinal (ATR) aufgelöst in Dimethyl Sulfoxid (DMSO) und 89 mM Saccharose in destilliertem Wasser gelöst. Hinweis: Die kleine Menge von Saccharose fördert Larven Fütterung der ATR-Lösung. ATR ist ein Cofaktor für heraufregulierende CsChrimson Ausdruck9,10erforderlich. ATR ist lichtempfindlich.</li>
		<li>Sobald die Nahrung Ampullen mit Eiern ATR hinzugefügt wird, brüten Sie die Fläschchen in der Dunkelheit für weitere 72 h. Hinweis: Während dieser Studie und die oben genannten zwei Studien keine Auswirkungen auf die Larven Verhalten aufgrund von ATR Fütterung beobachtet haben, empfiehlt es controlling für die Auswirkungen der ATR Fütterung von Testlinien zu unterwerfen, um die gleiche Menge an die oben genannte Mischung, die nicht ATR enthält.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dritte Instar Larven (~ 120 h nach der Eiablage) von der Oberfläche der Fliege Nahrung zu extrahieren, schweben sie mit einer hohen Dichte (15 %) Saccharose-Lösung. Mit einem P1000 Mikropipette trennen die Larven schwimmt auf der Oberfläche der Saccharose-Lösung in einem 1000-mL-Becherglas.</li>
	<li>Waschen Sie Larven 3 – 4 Mal durch den Austausch von 800 mL frisches destilliertes Wasser in das Becherglas jedes Mal. Können Sie Larven, 10 min. ruhen, bevor sie das Verhalten Assay unterwerfen.</li>
</ol>3. Verhalten Assay
<ol><li>Einheitliche Temperatur (zwischen 22-25 ° C) und Luftfeuchtigkeit (zwischen 50 und 60 % RH) Verhalten.</li>
	<li>
Bereiten Sie Larven kriechen Medium durch strömenden 150 mL geschmolzene Agarose (1,5 %) in eine 22 cm x 22 cm quadratische Petrischale. Eine Petrischale wird für jeden Versuch des Assays, 8 – 10 Versuche pro Experiment gegossen. Agarose zu festigen und cool für 1 – 2 Std. in den Petrischalen vor der Verwendung in der Verhaltens-Test zu ermöglichen.
	<ol>
<li>Übertragen Sie nicht mehr als 20 der vorbereitet dritte Instar Larven zum Zentrum der Petrischale (Abbildung 1C). Petrischale mit Deckel abdecken. Legen Sie die Petrischale im Bereich Verhalten unter der CCD-Kamera. Hinweis: Je nach dem Experiment Verhalten Assays in der Regel für 3 – 5 Minuten erfolgen. Wird ein Geruchsstoff in der Probe Anleitung Hinweise liefern zur, wurde es beobachtet, dass der entstehende Geruch Farbverlauf für ca. 5 min1stabil bleibt. Längere Assay-Zeiten sind nicht zu empfehlen. Schädliche Auswirkungen auf die Larven durch Austrocknung oder von 630 nm Rotlicht-über längere Zeit sind nicht in diese Zeitpunkte beobachtet worden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Schalten Sie ON the 850 nm Infrarot-LED-Lichtquelle, Larven in dem Video zu visualisieren. Starten Sie die CCD-Kamera um Larven Bewegung aufzuzeichnen.</li>
	<li>Mit Hilfe der Software Entwicklungsgerät Raspberry Pi, Programm des Verfahrens entsprechende Muster der Rotlicht-Stimulation zu verwalten. Hinweis: Eine Reihe von einfachen Python basierte Befehle kann einfach Programm Muster der LED Lichtreize angepasst (siehe Datei Syntax).</li>
</ol>4. Datenverarbeitung und-Analyse
<ol><li>Importieren Sie das aufgenommene Video von jeder Prüfung in jeder verfügbaren Programmier-Software wie Matlab.</li>
	<li>Erhalten Sie XY-Koordinaten von jeder Larve in einem Film als Funktion der Zeit. Basierend auf Grenzen der Tracking-Software, können 15 – 20 dritte Instar Larven in einem einzigen Film1,8verfolgt werden. Hinweis: Eine einfache Matlab-Codes ("Tracklarva"), die können leicht geeignete Bedingungen angepasst werden (siehe Datei Syntax) wird zur Verfügung gestellt. Dieses Programm vereint alle Prüfungen in einem Experiment und Ausgänge die XY-Koordinaten von jeder Larve für die gesamte Dauer des Tests (siehe Codesyntax unten). Alternativ könnte man mehrere OpenSource-basierte Programme verwenden, die für Forscher frei verfügbar sind. Z.b. JAABA (http://jaaba.sourceforge.net/)12.</li>
	<li>
Verwenden Sie die generierten XY-Koordinaten, Larven Trajektorien zu plotten und Larven Fortbewegung weiter zu analysieren.
	<ol>
<li>Verwenden Sie für Verhalten Analysen Navigations Statistiken wie Geschwindigkeit, Weg Krümmung, Richtung Winkel, um einzelne Larven Trajektorien segment in wechselnden Sequenzen von Abfahrten und Kurven.</li>
		<li>Abfahrten sind definiert als kontinuierliche Perioden der Vorwärtsbewegung. Wendungen zu trennen aufeinanderfolgenden Läufen. Wendungen sind gekennzeichnet, wenn Änderungen an Flugbahn Orientierung Winkel waren > 45° (siehe Datei Syntax).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Durchschnittswerte für Laufgeschwindigkeit, laufen Länge, Laufrichtung und andere Parameter nach Bedarf zu berechnen. Hinweis: Eine Reihe von einfachen Syntax, "fährt" und "hält" aus Larven Trajektorien zu extrahieren wird bereitgestellt (siehe Datei Syntax). Einfache Matlab oder Excel Funktionen auf die extrahierten Daten zum Berechnen von Werten für "Lauf-Geschwindigkeit" auch können, "run Length" etc..</li>
	<li>Daten für jedes Verhaltens Metrik zu vertreten, da ± SEM bedeuten</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mathew, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversity+among+sensory+receptors+in+a+Drosophila+olfactory+circuit.">Functional diversity among sensory receptors in a Drosophila olfactory circuit.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 2134-2143 (2013).</li><li>Ramaekers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+maps+without+cellular+redundancy+at+successive+levels+of+the+Drosophila+larval+olfactory+circuit.">Glomerular maps without cellular redundancy at successive levels of the Drosophila larval olfactory circuit.</a> Current biology : CB. 15, 982-992 (2005).</li><li>Couto, A., Alenius, M., Dickson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular,+anatomical,+and+functional+organization+of+the+Drosophila+olfactory+system.">Molecular, anatomical, and functional organization of the Drosophila olfactory system.</a> Current biology : CB. 15, 1535-1547 (2005).</li><li>Kreher, S. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+odor+coding+in+the+Drosophila+larva.">The molecular basis of odor coding in the Drosophila larva.</a> Neuron. 46, 445-456 (2005).</li><li>Kreher, S. A., Mathew, D., Kim, J., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+sensory+input+into+behavioral+output+via+an+olfactory+system.">Translation of sensory input into behavioral output via an olfactory system.</a> Neuron. 59, 110-124 (2008).</li><li>Hallem, E. A., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coding+of+odors+by+a+receptor+repertoire.">Coding of odors by a receptor repertoire.</a> Cell. 125, 143-160 (2006).</li><li>Monte, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+larval+olfactory+response+in+Drosophila+and+its+genetic+basis.">Characterization of the larval olfactory response in Drosophila and its genetic basis.</a> Behav Genet. 19, 267-283 (1989).</li><li>Gershow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+airborne+cues+to+study+small+animal+navigation.">Controlling airborne cues to study small animal navigation.</a> Nature methods. 9, 290-296 (2012).</li><li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations.">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nature methods. 11, 338-346 (2014).</li><li>Hernandez-Nunez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse-correlation+analysis+of+navigation+dynamics+in+Drosophila+larva+using+optogenetics.">Reverse-correlation analysis of navigation dynamics in Drosophila larva using optogenetics.</a> eLife. 4, (2015).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Kabra, M., Robie, A. A., Rivera-Alba, M., Branson, S., Branson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAABA:+interactive+machine+learning+for+automatic+annotation+of+animal+behavior.">JAABA: interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior.</a> Nature methods. 10, 64-67 (2013).</li><li>Newquist, G., Novenschi, A., Kohler, D., Mathew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+contributions+of+Olfactory+Receptor+Neurons+in+a+Drosophila+olfactory+circuit.">Differential contributions of Olfactory Receptor Neurons in a Drosophila olfactory circuit.</a> eNeuro. 3, (2016).</li><li>Schulze, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamical+feature+extraction+at+the+sensory+periphery+guides+chemotaxis.">Dynamical feature extraction at the sensory periphery guides chemotaxis.</a> eLife. 4, (2015).</li><li>Tastekin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+Subesophageal+Zone+in+Sensorimotor+Control+of+Orientation+in+Drosophila+Larva.">Role of the Subesophageal Zone in Sensorimotor Control of Orientation in Drosophila Larva.</a> Current Biology. 25, 1448-1460 (2015).</li><li>Famiglietti, E. V., Kolb, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+ON-and+OFF-center+responses+in+retinal+ganglion+cells.">Structural basis for ON-and OFF-center responses in retinal ganglion cells.</a> Science. 194, 193-195 (1976).</li><li>Luo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+thermotaxis+in+Caenorhabditis+elegans+is+mediated+by+distinct+sensorimotor+strategies+driven+by+the+AFD+thermosensory+neurons.">Bidirectional thermotaxis in Caenorhabditis elegans is mediated by distinct sensorimotor strategies driven by the AFD thermosensory neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2776-2781 (2014).</li><li>Berck, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+wiring+diagram+of+a+glomerular+olfactory+system.">The wiring diagram of a glomerular olfactory system.</a> eLife. 5, (2016).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Wir hier eine Methode, die für die Messung von Drosophila Larven Verhalten als Reaktion auf gleichzeitige optogenetische Aktivierung der olfaktorischen Neuronen ermöglicht. Zuvor beschriebenen Larven tracking Methoden1,8 verwenden verschiedene Geruch-Delivery-Technologie um ORNs zu aktivieren. Jedoch können diese Methoden für die Spezifität oder zeitlichen Muster der ORN Aktivierung nicht kontrollieren. Unsere Methode überwindet diese Defizite durc...

Olfaktorische Informationen in eine Drosophila Larve Umgebung ist von nur 21 funktional unterschiedliche ORNs, die Aktivitäten spürte davon letztlich Larven Verhalten1,2,3,4bestimmen. Jedoch ist relativ wenig über die Logik bekannt durch die sensorischer Informationen an den Aktivitäten der diese 21 ORNs codiert ist. Es muss somit die funktionale Beiträge jedes Larven ORN Verhalten experimentell zu messen.
Obwohl das sensorische Reaktionsschema des gesamten Repertoires von Drosophila Larven ORNs in Detail1,4,5, die Beiträge der einzelnen ORNs, die olfaktorische Schaltung und damit untersucht worden Navigations Verhalten bleiben weitgehend unbekannt. Schwierigkeiten im Larvenstadium Verhalten Studien bisher aufgrund der Unfähigkeit, räumlich und zeitlich einzelne ORNs aktivieren. Ein Gremium von Geruchsstoffen, die speziell 19 der 21 Drosophila Larven ORNs aktivieren wurde kürzlich beschriebenen1. Jeder Geruchsstoff im Bereich bei niedrigen Konzentrationen löst eine physiologische Reaktion nur von seinen Verwandten ORN. Jedoch bei höheren Konzentrationen, die normalerweise für konventionelle Verhalten Assays verwendet werden, löst jeder Geruchsstoff physiologische Reaktionen von mehreren ORNs1,5,6. Darüber hinaus haben Geruchsstoffe in diesem Panel Volatilitäten variiert, die Interpretation von Verhalten Studien erschweren, die Bildung von stabilen Geruch Gradienten7,8abhängen. Zu guter Letzt müssen natürlich auftretenden Geruch Reize eine zeitliche Komponente, die schwer unter Laborbedingungen nachzuahmen ist. Es ist daher wichtig, eine Methode zu entwickeln, die Larven Verhalten messen kann, während gleichzeitig individuelle ORNs in einer räumlichen und zeitlichen Weise aktivieren.
Hier zeigen wir, dass eine Methode, die Vorteile gegenüber den zuvor beschriebenen Larven Tracking hat1,8Proben. Der Tracking-Test in Gershow Et Al. beschrieben verwendet weiterhin ein stabiles Gefälle von Geruch im Verhalten Arena8elektronisch gesteuerte Ventile. Aufgrund der komplexen Technik beteiligt, die Geruch Reiz Einrichtung zu bauen, ist diese Methode jedoch schwierig, in anderen Labors zu replizieren. Weitere, ungelöste Fragen zur Verwendung von Geruchsstoffen, gezielt einzelne ORNs aktivieren. Die Tracking-Assay in Mathew Et Al. beschrieben verwendet ein einfacheres Geruch-Delivery-System, aber die resultierende Geruch Steigung ist abhängig von der Volatilität der Test Geruchsstoff und ist instabil für lange Laufzeiten der Assay-1. So Geruch Impulse durch Lichtreize ersetzen, unsere Methode hat die Vorteile der Spezifität und präzise zeitliche Steuerung der ORN Aktivierung und richtet sich nicht auf die Bildung von Geruch Gradienten in verschiedenen stärken.
Unsere Methode ist einfach einzurichten und eignet sich für Forscher interessiert Aspekte der Drosophila Larven Navigation zu messen. Diese Technik könnte zu Fremdsystemen Modell angepasst werden, vorausgesetzt, dass die Forscher in der Lage, die Expression von CsChrimson in ihre Lieblings-System Neuron(s) Wahl zu fahren ist. CsChrimson ist ein rot-verschoben Version des Kanals Rhodopsin. Die Aktivierung erfolgt bei Wellenlängen, die für die Larve Phototaxis System unsichtbar sind. Wir sind daher in der Lage, die Aktivität der Neuronen mit Genauigkeit, Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit9zu manipulieren. Durch Ändern der individuell erstellten Software um Größenänderungen der Themen Rechnung zu tragen, könnte diese Methode leicht kriechende Larven von anderen Insektenarten angepasst werden.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Video camera to capture larval movement&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD Camera&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>106215</td><td></td></tr><tr><td>M52 to M55 Filter Thread Adapter</td><td>Edmund Optics</td><td>59-446</td><td></td></tr><tr><td>2&quot; Square Threaded Filter Holder for Imaging Lenses&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>59-445</td><td></td></tr><tr><td>RG-715, 2&quot; Sq. Longpass Filter</td><td>Edmund Optics</td><td>46-066</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Electronics for optogenetic setup&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Raspberry Pi 2B</td><td>RASPBERRY-PI.org</td><td>RPI2-MODB-V1.2</td><td></td></tr><tr><td>3 Channel programmable power supply</td><td>newegg.com</td><td>9SIA3C62037092</td><td></td></tr><tr><td>8 Channel optocoupler relay</td><td>amazon.com</td><td>6454319</td><td></td></tr><tr><td>630nm Quad-row LED strip lights</td><td>environmentallights.com</td><td>red3528-450-reel</td><td></td></tr><tr><td>850nm LED strips</td><td>environmentallights.com</td><td>wp-4000K-CC5050-60x2-kit</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ubuntu MATE v16.04</td><td>Nubuntu</td><td>https://github.com/yslo/nubuntu</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Other items&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plexiglass black acrylic</td><td>Home Depot</td><td>MC1184848bl</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Fly food and other reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nutrifly fly food</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-112</td><td></td></tr><tr><td>Agarose powder</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-102</td><td></td></tr><tr><td>22cm X 22cm square petri-dish</td><td>VWR Inc.</td><td>25382-327</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>All trans-retinal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Flies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-IVS-CsChrimson&amp;nbsp;&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>55134</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Orco-Gal4&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>26818</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Or42a-Gal4&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>9970</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Or7a-Gal4&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>23907</td><td></td></tr></tbody></table>

tracking drosophila larval behavior in response to optogenetic stimulation of olfactory neurons

Die Fähigkeit der Insekten zu navigieren in Richtung Geruch Quellen basiert auf die Aktivitäten von ihr erster Ordnung olfaktorischen Rezeptor Neuronen (ORNs). Während eine beträchtliche Menge an Informationen über ORN Antworten auf Geruchsstoffe generiert wurde, bleibt die Rolle der spezifischen ORNs in Fahrt Verhaltensreaktionen schlecht verstanden. Komplikationen bei Verhalten Analysen entstehen durch verschiedene Volatilitäten von Geruchsstoffen, die einzelnen ORNs, mehrere ORNs durch einzelne Riechstoffe und die Schwierigkeit bei der Replikation natürlich beobachteten zeitlicher Variationen in olfaktorische Reize mit aktiviert aktivieren konventionelle Geruch-Liefermethoden im Labor. Hier beschreiben wir eine Protokoll, die Drosophila Larven Verhalten in Reaktion auf die gleichzeitige optogenetische Stimulation von seiner ORNs analysiert. Die hier verwendete optogenetische-Technologie ermöglicht Spezifität der ORN Aktivierung und präzise Steuerung der zeitlichen Muster der ORN Aktivierung. Entsprechenden Larven Bewegung wird nachverfolgt, digital erfasst und mit individuell erstellten Software analysiert. Geruch-Reize durch Lichtreize ersetzen, ermöglicht diese Methode für eine präzisere Steuerung der einzelnen ORN Aktivierung um ihre Auswirkungen auf die Larven Verhalten zu studieren. Unsere Methode konnte weiter ausgebaut werden, um die Auswirkungen von zweiter Ordnung Projektion Neuronen (PNs) sowie lokale Neuronen (LNs) auf Larven Verhalten zu untersuchen. Diese Methode ermöglicht somit eine umfassende Dissektion der olfaktorischen Schaltung Funktion und Ergänzung Studien wie olfaktorischen Neuronen Aktivitäten übersetzen im Verhalten Antworten.

Um die Besonderheit der ORN Aktivierung zu demonstrieren, unsere Methode wurde erfolgreich angewandt, um die Auswirkungen von zwei verschiedenen ORN (ORN::7a & ORN::42a) bestimmen (ORNs auszudrücken, entweder Or7a oder Or42a) Aktivierung auf Larven Verhalten (Abbildung 3). Neuere Studien, dass einzelne Larven ORNs entsprechen funktional unterschiedliche1,10,13, unse...

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Verfolgung des Larvenverhaltens von Drosophila als Reaktion auf die optogenetische Stimulation olfaktorischer Neuronen | Neurowissenschaften | Video

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

Dieses Protokoll analysiert Navigations Verhalten von Drosophila Larve in Reaktion auf die gleichzeitige optogenetische Stimulation der olfaktorischen Neuronen. 630 nm Wellenlänge wird verwendet, um einzelne olfaktorischen Neuronen mit dem Ausdruck einer rot-verschoben Kanal Rhodopsin zu aktivieren. Larval Bewegung gleichzeitig verfolgt, digital erfasst und mit individuell geschriebenen Software analysiert.

Tracking von Drosophila Larven Verhalten als Reaktion auf optogenetische Stimulation der olfaktorischen Neuronen

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a ...

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Serie: Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral paradigm, the experimenter usually assumes that the rapid diffusion of odorant molecules from the source leads to the creation of a stable gradient in the dish. To establish a quantitative correlation between sensory inputs and behavioral responses, it is necessary to achieve a more thorough characterization of the odorant stimulus conditions. In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

Hochauflösende Messung von Odor-Driven Behavior in Drosophila-Larven

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

Forschung

Biologie

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory bulb1-5. Olfactory information in the external world is transmitted to the antennal lobe by olfactory sensory neurons (OSNs), which segregate to distinct regions of neuropil called glomeruli according to the specific olfactory receptor they express. Here, OSN axons synapse with both local interneurons (LNs), whose processes can innervate many different glomeruli, and projection neurons (PNs), which convey olfactory information to higher olfactory brain regions.
Optical imaging of the activity of OSNs, LNs and PNs in the antennal lobe - traditionally using synthetic calcium indicators (e.g. calcium green, FURA-2) or voltage-sensitive dyes (e.g. RH414) - has long been an important technique to understand how olfactory stimuli are represented as spatial and temporal patterns of glomerular activity in many species of insects6-10. Development of genetically-encoded neural activity reporters, such as the fluorescent calcium indicators G-CaMP11,12 and Cameleon13, the bioluminescent calcium indicator GFP-aequorin14,15, or a reporter of synaptic transmission, synapto-pHluorin16 has made the olfactory system of the fruitfly, Drosophila melanogaster, particularly accessible to neurophysiological imaging, complementing its comprehensively-described molecular, electrophysiological and neuroanatomical properties2,4,17. These reporters can be selectively expressed via binary transcriptional control systems (e.g. GAL4/UAS18, LexA/LexAop19,20, Q system21) in defined populations of neurons within the olfactory circuitry to dissect with high spatial and temporal resolution how odor-evoked neural activity is represented, modulated and transformed22-24.
Here we describe the preparation and analysis methods to measure odor-evoked responses in the Drosophila antennal lobe using G-CaMP25-27. The animal preparation is minimally invasive and can be adapted to imaging using wide-field fluorescence, confocal and two-photon microscopes.

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

We describe an established technique to measure and analyze odor-evoked calcium responses in the antennal lobe of living Drosophila melanogaster.

Calcium Imaging von geruchs-evozierte Potentiale in der Drosophila Antennallobus

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

Neurowissenschaften

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

Optogenetische Stimulation von Escape Verhalten in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the underlying neuronal components in the circuits1-6. Application of optogenetics7,8 in the larval neural circuit allows us to manipulate neuronal activity in spatially and temporally patterned ways9-13. Typically, specimens are broadly illuminated with a mercury lamp or LED, so specificity of the target neurons is controlled by binary gene expression systems such as the Gal4-UAS system14,15. In this work, to improve the spatial resolution to "sub-genetic resolution", we locally illuminated a subset of neurons in the ventral nerve cord using lasers implemented in a conventional confocal microscope. While monitoring the motion of the body wall of the semi-intact larvae, we interactively activated or inhibited neural activity with channelrhodopsin16,17 or halorhodopsin18-20, respectively. By spatially and temporally restricted illumination of the neural tissue, we can manipulate the activity of specific neurons in the circuit at a specific phase of behavior. This method is useful for studying the relationship between the activities of a local neural assembly in the ventral nerve cord and the spatiotemporal pattern of motor output.

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Here we describe a protocol for optogenetic manipulation of motoneuronal activity while monitoring changes in motor output (muscle contraction) in semi-intact Drosophila larvae using lasers within a conventional confocal microscope. This technique enables researchers to achieve local perturbation of neural activity in a few neuromeres to elucidate the dynamics of motor circuits.

Optogenetische Störung der neuronalen Aktivität mit Laser Illumination in Semi-intakt<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Analyse des zuckerinduzierten Nahrungssuchverhaltens in Drosophila

Tracking Sugar-Elicited Local Searching Behavior in Drosophila

Foraging behavior is essential for the survival of organisms as it enables them to locate and acquire essential food resources. In Drosophila, hunger triggers a distinct search behavior following the consumption of small quantities of a sugar solution. This report presents a simple experimental setup to study sugar-elicited search behavior with the aim of uncovering the underlying mechanisms. Minute quantities of concentrated sugar solution elicit sustained searching behavior in flies. The involvement of path integration in this behavior has been established, as flies utilize their trajectory to return to the sugar location. The most recent findings provide evidence of temporal modulation in the initiation and intensity of the search behavior after sugar intake. We have also used this setup for artificial activation of specific taste-receptor neurons in the pharynx, which elicits the search behavior. The Drosophila neurogenetic toolkit offers a diverse array of tools and techniques that can be combined with the sugar-elicited search behavior paradigm to study the neural and genetic mechanisms underlying foraging. Understanding the neural basis of hunger-driven searching behavior in flies contributes to the field of neurobiology as a whole, offering insights into the regulatory mechanisms that govern feeding behaviors not only in other organisms but also in humans.

Autor im Rampenlicht: Erforschung von Verhaltenspfaden durch artenübergreifende Erkenntnisse bei der Nahrungssuche und Kommunikation

This protocol describes a behavioral assay for recording sugar-elicited search behavior using Drosophila melanogaster. The assay can be utilized to study feeding and foraging-related behaviors, as well as the underlying neuronal mechanisms.

Verfolgung des durch Zucker ausgelösten lokalen Suchverhaltens in Drosophila

Foraging behavior is essential for the survival of organisms as it enables them to locate and acquire essential food resources. In Drosophila, hunger ...

Verhalten

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To complicate matters even further, the odors detected by the insect nervous system usually are not single compounds but mixtures whose composition and concentration ratios vary. This leads to an almost infinite amount of different olfactory stimuli which have to be evaluated by the nervous system.
To understand which aspects of an odor stimulus determine its evaluation by the fly, it is therefore desirable to efficiently examine odor-guided behavior towards many odorants and odor mixtures. To directly correlate behavior to neuronal activity, behavior should be quantified in a comparable time frame and under identical stimulus conditions as in neurophysiological experiments. However, many currently used olfactory bioassays in Drosophila neuroethology are rather specialized either towards efficiency or towards resolution.
Flywalk, an automated odor delivery and tracking system, bridges the gap between efficiency and resolution. It allows the determination of exactly when an odor packet stimulated a freely walking fly, and to determine the animal&#180;s dynamic behavioral reaction.

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

The automated tracking system Flywalk is used for high-resolution quantification of odor-guided behavior in Drosophila melanogaster.

Hochaufgelöste Quantifizierung der Geruchsgelenkten Verhalten in<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Verwenden der<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an excellent model system for such investigations due to its complex behaviors, powerful genetic techniques, and compact nervous system. Laboratory behavioral assays have long been used with Drosophila to simulate properties of the natural environment and study the neural mechanisms underlying the corresponding behaviors (e.g. phototaxis, chemotaxis, sensory learning and memory)1-3. With the recent availability of large collections of transgenic Drosophila lines that label specific neural subsets, behavioral assays have taken on a prominent role to link neurons with behaviors4-11. Versatile and reproducible paradigms, together with the underlying computational routines for data analysis, are indispensable for rapid tests of candidate fly lines with various genotypes. Particularly useful are setups that are flexible in the number of animals tested, duration of experiments and nature of presented stimuli. The assay of choice should also generate reproducible data that is easy to acquire and analyze. Here, we present a detailed description of a system and protocol for assaying behavioral responses of Drosophila flies in a large four-field arena. The setup is used here to assay responses of flies to a single olfactory stimulus; however, the same setup may be modified to test multiple olfactory, visual or optogenetic stimuli, or a combination of these. The olfactometer setup records the activity of fly populations responding to odors, and computational analytical methods are applied to quantify fly behaviors. The collected data are analyzed to get a quick read-out of an experimental run, which is essential for efficient data collection and the optimization of experimental conditions.

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.

Olfaktorischen Behaviors Assayed von Computer-Tracking<em&gt; Drosophila</em&gt; In einem Vier-Quadranten-Olfaktometer

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an ...

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

The larvae of Drosophila melanogaster show obvious light-avoiding behavior during the foraging stage. Drosophila larval phototaxis can be used as a model to study animal avoidance behavior. This protocol introduces a light-spot assay to investigate larval phototactic behavior. The experimental set-up includes two main parts: a visual stimulation system that generates the light spot, and an infrared light-based imaging system that records the process of larval light avoidance. This assay allows tracking of the behavior of larva before entering, during encountering, and after leaving the light spot. Details of larval movement including deceleration, pause, head casting, and turning can be captured and analyzed using this method.

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

This protocol introduces a light-spot assay to investigate Drosophila larval phototactic behavior. In this assay, a light spot is generated as light stimulation, and the process of larval light avoidance is recorded by an infrared light-based imaging system.

Licht-Spot-basierter Assay zur Analyse von Drosophila Larval Phototaxis

The larvae of Drosophila melanogaster show obvious light-avoiding behavior during the foraging stage. Drosophila larval phototaxis can be used as a model ...

Tracking von Drosophila Larven Verhalten als Reaktion auf optogenetische Stimulation der olfaktorischen Neuronen

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Hochauflösende Messung von Odor-Driven Behavior in Drosophila-Larven

Calcium Imaging von geruchs-evozierte Potentiale in der Drosophila Antennallobus

Optogenetische Stimulation von Escape Verhalten in

Optogenetische Störung der neuronalen Aktivität mit Laser Illumination in Semi-intakt

Verfolgung des durch Zucker ausgelösten lokalen Suchverhaltens in Drosophila

Verfolgung des durch Zucker ausgelösten lokalen Suchverhaltens in Drosophila

Verfolgung des durch Zucker ausgelösten lokalen Suchverhaltens in Drosophila

Hochaufgelöste Quantifizierung der Geruchsgelenkten Verhalten in

Olfaktorischen Behaviors Assayed von Computer-Tracking

Licht-Spot-basierter Assay zur Analyse von Drosophila Larval Phototaxis