Wir bedanken uns bei Kaps-Brasilien, CNPq-Brasilien, FAP/DF für finanzielle Unterstützung. Wir sind dankbar, Dr. Hugo Costa Paes für das Manuskript überarbeiten.

(1) Lösungen und Medien
<ol><li>Bereiten Sie 2 X Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium, Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS), Sabouraud-Dextrose-Bouillon und Sabouraud-Dextrose-Agar nach Tabelle 1.</li>
</ol>(2) Pilz Inokulum Wachstumsbedingungen
<ol><li>Speichern Sie alle Pilzstämmen als gefrorene Bestände in 35 % Glycerin bei-80 ° C, bis benötigt.</li>
	<li>Führen Sie die folgenden Schritte vor jedem Experiment.<ol>
<li>Für Candida Albicans -Stämme:<ol>
<li>Ein Lager Fläschchen Auftauen und 200 µL bis 10 mL der Sabouraud-Dextrose-Bouillon in einem sterilen 50 mL Polypropylen-Rohr mit einer Kappe und Kultur über Nacht bei 30 ° C unter Rühren (200 u/min) zu übertragen. Denken Sie daran, neigen die Röhre und lassen Sie die Kappe leicht geöffnet für bessere Belüftung der Kultur.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Für Cryptococcus Neoformans Stämme:<ol>
<li>Kratzen Sie die Eisfläche des ein Lager Fläschchen. Die Zellen auf Sabouraud-Dextrose-Agar-Platten Teller und inkubieren Sie für 48 h bei 30 ° C. Halten Sie nach sichtbares Wachstum der isolierten Kolonien die Platten in den Kühlschrank (4 ° C) für bis zu 15 Tage mit Paraffin Film versiegelt.</li>
			<li>Eine mittlere isolierte Kolonie von der Platte mit einem sterilen Zahnstocher oder sterilen Impfkeimen Schleife zu sammeln und 10 mL der Sabouraud-Dextrose-Brühe in einem sterilen 50 mL konische Röhrchen zu impfen. Inkubieren Sie für ca. 24 h bei 30 ° C unter Rühren (200 u/min).</li>
			<li>Überschreiten Sie die 24 h Inkubation nicht. Denken Sie daran, neigen die Röhre und lassen Sie die Kappe leicht geöffnet für bessere Belüftung. Es ist immer gut, die Wachstumsphase der Zellen vor jedem Test zu standardisieren, da dies ein wichtiger Faktor Antibiotikaresistenzen. Hinweis: Beide Pilze wurden bei 30 ° C für die rasche Vermehrung in unseren Experimenten angebaut, aber die Temperatur kann geändert werden, um die Ziele der Studie, zum Beispiel klinische Behandlung (37 ° C). Am wichtigsten ist, sollte dieser erste Inkubationszeit im Voraus für jeden Pilz Isolat eingerichtet und erhalten während der Tests auf Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nach Pilzwachstum sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugieren die konische Rohre bei 1.200 x g für 5 min bei Raumtemperatur. Verwerfen Sie den Überstand und 10 mL PBS.</li>
	<li>Die Zellen und die Zentrifuge bei 1.200 x g für 5 min bei Raumtemperatur wieder aufzuwirbeln.</li>
	<li>Wiederholen Sie die PBS waschen und Zentrifugation noch zweimal. Nach der dritten Wäsche Aufschwemmen der Zellen in 5 mL (entsprechend der Größe der Pellets) 2 X RPMI-1640 Medium.</li>
	<li>1 mL einer Verdünnung 1: 100 oder 1:1,000 in einem Microcentrifuge Schlauch (abhängig von der Trübung der Zellsuspension) vorzubereiten.</li>
	<li>Aliquoten 10 µL dieser Verdünnung, legen Sie sie in einer Hemocytometer-Kammer und die totale Anzahl der Zellen in den vier Quadranten unter dem Mikroskop. Berechnen Sie die Konzentration durch die Formel: (total Zelle Nummer/4) x Verdünnung Faktor X 104 (Kammer Verdünnung konstant).<ol>
<li>Sollte eine 100 % Rentabilität Rentabilität zählt und Wachstum Bedingungen für das Isolat untersucht systematisch korreliert haben. Hinweis: Die Standardisierung und Qualitätssicherung der Lebensfähigkeit zählt können durch Rücken-Plating in Übereinstimmung mit den Europäischen Ausschuss für antimikrobielle Empfindlichkeit Testing (EUCAST) antimykotische minimalen inhibitorischen Konzentration (MIC) Methode für Hefen10 erfolgen .</li>
		<li>Wenn die Wachstum/Lebensfähigkeit Korrelation nicht für das Isolat unter Studie nachgewiesen, Messen Sie die pilzartige Lebensfähigkeit durch lebende Zellen in einem Hemocytometer mit Hilfe der Farbstoffe, die selektiv abgestorbene Zellen, wie z. B. Phloxine B11, Trypan Blau Farbe zählen 12, oder Janus Grün13. Verwenden Sie die Pilzzellen für dieses Protokoll nur, wenn die Lebensfähigkeit der Bevölkerung zu diesem Zeitpunkt 90 % oder höher. Hinweis: Tot/lebendig Farbstoffe funktionieren nicht gut mit dem Pilz der Wahl. Bitte testen sie vor dem Gebrauch. Beispielsweise funktioniert die Trypan blau färben nicht gut mit C. Neoformans.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Danach bereiten die Zellsuspensionen in 2 X RPMI-1640-Mittel (2 X angepasst Inokulum in RPMI-1640 Medium). 96-Well Platten sollten Sie ein Volumen von 5 mL für jede Platte.<ol>
<li>Bereiten Sie alle C. Albicans Stämme ein Lager Zellsuspension von 4 x 103 Zellen/mL. Diese Konzentration ist 2 X der letzte Zelle Konzentration in jede Vertiefung (2 x 103 Zellen/mL).</li>
		<li>C. Neoformans Stämme Vorbereitung einer Aktie Kultur von Zellen 2 x 104 Zellen/mL. Diese Konzentration ist zweimal die endgültige Zellkonzentration in jede Vertiefung (1 x 104 Zellen/mL).</li>
		<li>Andere Pilze-test eine bekannte Antimykotika, welche Konzentration ideal für die besondere Untersuchung in Bezug auf die Inkubationszeit werden. Berücksichtigen Sie Stoffwechsel und die doppelte Zeit des Pilzes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(3) Peptide (unbekannter Agent)
<ol><li>Die gefriergetrockneten Peptide bei-20 ° C zu speichern und in entionisiertem Wasser vor jedem Experiment auflösen. Die maximale Speicherdauer einmal in Wasser aufgelöst hängt von der Art der jedes Peptid.</li>
	<li>Bereiten Sie Aliquote zweimal die höchste Endkonzentration im Test (2 X) getestet. Im Idealfall bereiten Sie eine kleine Anzahl von aliquoten mit genügend Peptid für einmaligen Gebrauch, Frost-Tau-Zyklen zu vermeiden. Hinweis: Die Wahl der Konzentration sollte auf Literatur und die Eigenschaften des Peptids beruhen. Es wird empfohlen, die serielle Verdünnungen mit ca. 100 µM des Peptids, starten und dann verringern oder erhöhen diese Konzentrationsbereich abhängig von den erzielten Ergebnissen.</li>
</ol>(4) Referenz Antimykotika (Positivkontrolle)
<ol><li>Für diejenigen mit Wasser verdünnt: bereiten Sie eine 2 X Lösung der höchsten Konzentration der Analyse (siehe Abschnitt 5: antimykotische Assay für die Verdünnung Schritte).<ol>
<li>C. Albicans Stämme Vorbereitung einer Lösung aus 128 µg/mL von Fluconazol oder 128 µg/mL Caspofungin. Die Platte Konzentration für beide werden 64 µg/mL.</li>
		<li>Bereiten Sie für C. Neoformans Stämme eine Lösung von 32 µg/mL Amphotericin B (wasserlösliche Lösung). Die Platte Konzentration werden 16 µg/mL. Hinweis: Normalerweise wird Amphotericin B verdünnt in Dimethyl Sulfoxid (DMSO), da dieser Anti-Pilz schlecht löslich in Wasser. Allerdings gibt es wasserlösliche Amphotericin B Präparate im Handel erhältlich.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Für Antimykotika in einem organischen Lösungsmittel verdünnt: Vorbereiten einer 100 X Stammlösung in DMSO, dann bis 10 X im Wasser für den Gebrauch zu verdünnen. Hinweis: Dadurch wird im Brunnen, die Endkonzentration von DMSO 1 % nicht überschreiten. Ein Brunnen, wo der Pilz in Medien mit 1 % DMSO wächst als Kontrolle erforderlich ist, angesichts der Tatsache, dass einige Pilze diese Konzentration des Lösungsmittels nicht gut vertragen. Denken Sie daran, dass DMSO lichtempfindlich ist, also die Platte mit Folie abdecken oder legen Sie sie in eine dunkle Kammer für die Dauer der Inkubationszeit.</li>
</ol>5. antimykotische Assay
Hinweis: In-vitro- antimykotische Assays sind basierend auf der Brühe Microdilution Empfindlichkeitstest von Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3-Richtlinien mit einigen Änderungen durchgeführt.
<ol><li>Bereiten Sie eine zweifache serielle Verdünnung jedes Peptid und Steuern Sie Antimykotika in Polystyrol 96-Well-Mikrotiterplatten zu einem Endvolumen von 50 µL.<ol>
<li>Mit einer Pipette 100 µL Antimykotika/Peptid in der 2 X-Konzentration der höchsten gewünschten Endkonzentration in Spalten 1-3, in Zeile A. hinzufügen</li>
		<li>Fügen Sie mithilfe einer Mehrkanal-Pipette 50 µL steriles Wasser in die andere Vertiefungen, in Reihen B bis H.</li>
		<li>50 µL der Brunnen mit der höchsten Konzentration (Reihe A) zu entfernen, an der nächsten gut des nächsten Concentration (Zeile B) übertragen und homogenisieren.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte bis zu den Brunnen mit der niedrigsten Konzentration und verwerfen Sie 50 µL des Brunnens (Reihe H) zu. Lassen Sie Spalten 11 und 12 (Reihen A, B, C) mit nur Wasser für Blindkontrolle oder negativ/Wachstumskontrolle.</li>
		<li>Fügen Sie 50 µL 2 X eingestellte Inokulum in RPMI-1640 Medium in jede Vertiefung (Spalten 1 bis 3 und Spalte 11 (negativ/Wachstumskontrolle)); die Endkonzentration für C. Albicans werden 2 x 103 Zellen/mL und die Endkonzentration für C. Neoformans Stämme 104 Zellen/mL werden.</li>
		<li>Bereiten Sie leere Kontrollen (50 µL Wasser + 50 µL 2 X RPMI-1640 Medium ohne Zellen) und negativ/Wachstumskontrolle (50 µL Wasser + 50 µL eingestellt Inokulum 2 X RPMI-1640 Medium ohne Antimykotika) und Last in der well-Platte wie beschrieben oben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wiederholen Sie die Prozedur für jede Verbindung getestet werden und die gewählten antimykotische Kontrolle (Spalten 4-10). Hinweis: Die serielle Verdünnungen können vertikal durchgeführt werden, als das Experiment unten oder horizontal in der Platte (d. h. wenn die Anzahl der Verdünnungen der gegebenen Verbindung /-Extrakt, der muss getestet werden acht oder mehr).<ol>
<li>Wenn die Verbindungen verweisen Drogen oder einer seiner Komponenten sind lichtempfindlich, führen Sie den Test in reduziertes Licht, die Platten mit Folie abdecken oder legen Sie in eine dunkle Kammer während Inkubationen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beachten Sie die folgenden optionalen Empfehlungen.<ol>
<li>Versiegeln Sie die Platte mit einer klaren Abdeckplatte, die Gasaustausch, ermöglicht, wie diese Verdunstung reduziert.</li>
		<li>Legen Sie die Platte in eine feuchte Kammer; Es hilft auch, die Verdunstung zu reduzieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platten bei 37 ° C für 24 h oder 48 h für alle C. Albicans -Stämme und für 48 h mit 200 u/min schütteln für C. Neoformans. Das untere Endvolumen (100 µL) sorgt dafür, dass keine Spillover auftritt. Hinweis: Kein signifikanter Unterschied wurde zwischen MIC Lesungen bei 24 h und 48 h für C. Albicans -Stämme beobachtet. Lesungen in 48 h sind jedoch einfacher zu visualisieren.</li>
	<li>Beobachten Sie alle Brunnen, mit Hilfe von einem umgekehrten optischen Mikroskop vor der Inkubationszeit und nach Änderungen in der Morphologie als auch auf Anzeichen von Kontamination zu überprüfen überprüft. Hinweis: Lesungen können visuell gemacht und fotografiert am Ende des Experiments. Vor jeder Lesung leicht homogenisieren der Plattenrandes. Das liest können auch durchgeführt werden, durch die Messung der OD bei 600 nm, wenn Zelle Klumpen oder Filamentierung nicht eingehalten werden.</li>
	<li>Durchführen Sie die Experimente, mindestens dreimal an gesonderten Terminen.</li>
</ol>

<ol>
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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+shaking+on+antifungal+susceptibility+testing+of+Cryptococcus+neoformans:+a+comparison+of+the+NCCLS+standard+M27A+medium,+buffered+yeast+nitrogen+base,+and+RPMI-2%+glucose.">Influence of shaking on antifungal susceptibility testing of Cryptococcus neoformans: a comparison of the NCCLS standard M27A medium, buffered yeast nitrogen base, and RPMI-2% glucose.</a> Antimicrob Agents Chemother. 44 (2), 400-404 (2000).</li><li>Beggs, W. 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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Microdilution Tests können potenzielle antimykotische Aktivität der Zielsubstanz mit kleinen Mengen der Substanz zu analysieren und gleichzeitig testen Sie es in den unterschiedlichsten Konzentrationen. Dementsprechend wird dieses Protokoll als ersten Schritt im Screening für potenzielle neue antimykotische Substanzen empfohlen. Die hier vorgestellten Protokoll basiert auf der M27-A3 Protokoll, ursprünglich entwickelt, um Hilfe bei der Auswahl der antimykotischen Therapie in Kliniken, und lässt sich eine Vielzahl ne...

Pilzinfektionen sind geworden ein wichtiges medizinisches Anliegen in den letzten Jahrzehnten haben erheblich zugenommen, vor allem auf einen Anstieg der Zahl von immungeschwächten Personen wie diejenigen in der Krebsbehandlung und Menschen mit HIV/AIDS oder transplantierten Organe1,2. Jedoch beitragen eine sehr begrenzte Auswahl an verfügbaren Antimykotika und die zunehmende Zahl von Berichten über Pilzresistenz dazu zu den großen Problemen bezüglich der Therapie der systemischen Mykosen3.
Eine potenzielle Quelle für neue antimykotische Substanzen sind antimikrobielle Peptide (AMPs), kleine kationischen Peptide, die von vielen Organismen als Bestandteil ihrer angeborenen Immunantwort auf eine Infektion4produziert. Die Screening-Methode, diese Verbindungen gegen Pilzerreger zu testen ist jedoch nicht standardisiert. Verschiedene Verfahren wurden zur antimykotische Aktivität des AMPs, manchmal für das gleiche Modell Mikroorganismus5,6,7zu beurteilen. Diese Unterschiede und den Mangel an Details in einigen Protokollen erschweren Vergleiche zwischen Verbindungen und behindert Reproduzierbarkeit.
Eine Möglichkeit, die Prüfung von neuen Medikamenten-Kandidaten zu standardisieren soll pilzbefallverhütende Anfälligkeit in klinischen Umgebungen, wie z. B. die klinische Definition verwendet und Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 Leitlinien folgen. Jedoch diese antimykotische Sensitivitätstests sind zu restriktiv, und nehmen nicht in Betracht-Variante im Stoffwechsel über Arten, da sie nur für wenige ausgewählte Agenten errichtet wurden. Zum Beispiel nehmen sie nicht zu berücksichtigen die metabolischen Bedürfnisse nicht gärenden Hefen.
Dieses Protokoll ermöglicht die Beurteilung der Tätigkeit des Interessenten antimykotische Substanzen und hier für die Suche nach antimykotische Peptide eingeführt. Es basiert auf der Brühe Microdilution Empfindlichkeitstest aus der CLSI M27-A3-Richtlinien mit Modifikationen, die das Screening von neuen Verbindungen8,9zu optimieren. Diese Änderungen ermöglichen den Einsatz von geringen Mengen an Substanz, Temperatur- oder erste Inokulum und verschiedene Medien für ein optimales Wachstum der Pretest, während die Ergebnisse anhand von Referenz-Antimykotika als Steuerelemente Standardisierung. Diese Methode, mit der Verwendung von Multi-gut Kultur Platten ermöglicht es schnell und zuverlässig eine große Anzahl von Verbindungen auf den Bildschirm.
Aufgrund seiner Flexibilität kann dieses Protokoll mit unterschiedlichen chemischen Klassen von Verbindungen und gegen andere Mikroorganismen, mit wenigen Anpassungen verwendet werden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Media and Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium with l-glutamine, without sodium bicarbonate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31800-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS) (o que a gente usa tem um s&#243;dio, completa o nome dele please)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Use to buffer 2X RPMI medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Din&#226;mica</td>
			<td>1528-1</td>
			<td>137 mM for Phosphate buffered saline (PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>3040-01</td>
			<td>2.7 mM for Phosphate buffered saline (PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V000129</td>
			<td>10 mM for Phosphate buffered saline (PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60230</td>
			<td>2 mM for Phosphate buffered saline (PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Difco Sabouraud dextrose broth</td>
			<td>BD</td>
			<td>238230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Difco Sabouraud Dextrose Agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>210950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V000123</td>
			<td>35% for (solu&#231;&#227;o de estoque? Criopreserva&#231;&#227;o?)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Para dilui&#231;&#227;o das drogas na dilui&#231;&#227;o seriada</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifungal drugs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluconazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspofungin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PHR1160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastics</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dish petri</td>
			<td>J.Prolab</td>
			<td>0304-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Solution Reservoir</td>
			<td>KASVI</td>
			<td>K30-208</td>
			<td>Use to pippet the solutions using the multichannel pippet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment and other materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>E200MV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugue</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>MegaFuge 16R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Ethik Technology</td>
			<td>403-3D</td>
			<td>Set to 37&#176; C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Excella E25</td>
			<td>Set to 37&#176; C, 200 RPM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting chamber, Neubauer</td>
			<td>BOECO Germany</td>
			<td>BOE 13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette</td>
			<td>HTL</td>
			<td>5123</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

broth microdilution in vitro screening: an easy and fast method to detect new antifungal compounds

Pilzinfektionen sind in den letzten Jahrzehnten eine wichtige medizinische Voraussetzung geworden, aber die Anzahl der verfügbaren Antimykotika ist begrenzt. In diesem Szenario ist die Suche nach neuen Antimykotika notwendig. Das Protokoll berichtet hier beschreibt eine Methode, um Bildschirm Peptide für ihre antimykotischen Eigenschaften. Es basiert auf der Microdilution-Empfindlichkeitstest Brühe aus den Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3-Richtlinien mit Modifikationen an der Erforschung der antimikrobielle Peptide als potenzielle neue Antimykotika. Dieses Protokoll beschreibt einen funktionelle Assay zur Beurteilung der Aktivität von Antimykotika Verbindungen und kann leicht geändert werden, um einer bestimmten Klasse von Molekülen unter Untersuchung zu entsprechen. Da die Assays in 96-Well-Platten mit kleinen Volumina durchgeführt werden, kann eine großangelegte Screening in kürzester Zeit abgeschlossen werden, vor allem, wenn in einer Automatisierung durchgeführt. Dieses Verfahren wird veranschaulicht, wie ein standardisierte und einstellbare klinisches Protokoll die Bank-Arbeit Verfolgung neuer Moleküle, die Therapie von Pilzerkrankungen zu verbessern helfen kann.

Das MIC ist definiert als die niedrigste antimikrobielle Compoundkonzentration, die vollständig sichtbare Pilzwachstum am Ende der Inkubationszeit hemmt. Da das Ziel dieses Protokolls ist es, eine schnelle Methode, um potentielle Antimykotika Bildschirm haben, jeder Brunnen mit klaren Medien ähnlich wie die leeren Brunnen ein positives Ergebnis gilt während jeder mit Trübung analog zu den negativen/Wachstum-Kontroll-Vertiefungen gut als negativ bewertet. Allerdings besteht ein Interes...

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Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

Eine einfach und anpassungsfähig Brühe Microdilution Methode für das screening von Antimykotika Verbindungen und Extrakte.

Brühe Microdilution In Vitro Screening: eine einfache und schnelle Methode, um neue Antimykotika Verbindungen erkennen

Fungal infections have become an important medical condition in the last decades, but the number of available antifungal drugs is limited. In this ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

18.7K Aufrufe.  University of Brasília. Eine einfach und anpassungsfähig Brühe Microdilution Methode für das screening von Antimykotika Verbindungen und Extrakte.

Serie: Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

Using Laser Tweezers For Manipulating Isolated Neurons In Vitro

In this paper and video, we describe the protocols used in our laboratory to study the targeting preferences of regenerating cell processes of adult retinal neurons in vitro. Procedures for preparing retinal cell cultures start with the dissection, digestion and trituration of the retina, and end with the plating of isolated retinal cells on dishes made especially for use with laser tweezers. These dishes are divided into a cell adhesive half and a cell repellant half. The cell adhesive side is coated with a layer of Sal-1 antibodies, which provide a substrate upon which our cells grow. Other adhesive substrates could be used for other cell types. The cell repellant side is coated with a thin layer of poly-HEMA. The cells plated on the poly-HEMA side of the dish are trapped with the laser tweezers, transported and then placed adjacent to a cell on the Sal-1 side to create a pair. Formation of cell groups of any size should be possible with this technique. "Laser-tweezers-controlled micromanipulation" means that the investigator can choose which cells to move, and the desired distance between the cells can be standardized. Because the laser beam goes through transparent surfaces of the culture dish, cell selection and placement are done in an enclosed, sterile environment. Cells can be monitored by video time-lapse and used with any cell biological technique required. This technique may help investigations of cell-cell interactions.

This video describes the manipulation of cultured neurons using laser tweezers in vitro.

Mit Laser-Pinzette zur Manipulation isolierter Neuronen In Vitro

In this paper and video, we describe the protocols used in our laboratory to study the targeting preferences of regenerating cell processes of adult ...

Forschung

Biologie

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level. There are several methods, both in vitro and in vivo, to evaluate protein binding, and at least two methods that complement the shortcomings of each other should be conducted to obtain reliable insights. 
For an in vivo assay, the bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assay represents the most popular and least invasive approach that enables to detect protein-protein interaction within living cells, as well as identify the intracellular localization of the interacting proteins 1,2. In this assay, non-fluorescent N- and C-terminal halves of GFP or its variants are fused to tested proteins, and when the two fusion proteins are brought together due to the tested proteins&#x2019; interactions, the fluorescent signal is reconstituted3-6. Because its signal is readily detectable by epifluorescence or confocal microscopy, BiFC has emerged as a powerful tool of choice among cell biologists for studying about protein-protein interactions in living cells 3. This assay, however, can sometimes produce false positive results. For example, the fluorescent signal can be reconstituted by two GFP fragments arranged as far as 7 nm from each other due to close packing in a small subcellular compartment, rather that due to specific interactions7.
Due to these limitations, the results obtained from live cell imaging technologies should be confirmed by an independent approach based on a different principle for detecting protein interactions. Co-immunoprecipitation (Co-IP) or glutathione transferase (GST) pull-down assays represent such alternative methods that are commonly used to analyze protein-protein interactions in vitro. However, iIn these assays, however, the tested proteins must be readily soluble in the buffer that supportsused for the binding reaction. Therefore, specific interactions involving an insoluble protein cannot be assessed by these techniques.
 Here, we illustrate the protocol for the protein membrane overlay binding assay, which circumvents this difficulty. In this technique, interaction between soluble and insoluble proteins can be reliably tested because one of the proteins is immobilized on a membrane matrix. This method, in combination with in vivo experiments, such as BiFC, provides a reliable approach to investigate and characterize interactions faithfully between soluble and insoluble proteins. In this article, binding between Tobacco mosaic virus (TMV) movement protein (MP), which exerts multiple functions during viral cell-to-cell transport8-14, and a recently identified plant cellular interactor, tobacco ankyrin repeat-containing protein (ANK) 15, is demonstrated using this technique.

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Testing protein-protein interaction is indispensable for dissection of protein functionality. Here, we introduce an in vitro protein-protein binding assay to probe a membrane-immobilized protein with a soluble protein. This assay provides a reliable method to test interaction between an insoluble protein and a protein in solution.

Proteinmembran Overlay Assay: Ein Protokoll, die Interaktion zwischen löslichen und unlöslichen Proteinen testen In-vitro-</em

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level.  There are several ...

Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to extracellular agents is predominantly regulated by the phospholipase C&beta;- G&alpha;q pathway localized on the plasma membrane which is stimulated by agents such as acetylcholine 3,4. We have recently found that plasma membrane protein domains called caveolae5,6 can entrap activated G&alpha;q 7. This entrapment has the effect of stabilizing the activated state of G&alpha;q and resulting in prolonged Ca2+ signals in cardiomyocytes and other cell types8. We uncovered this surprising result by measuring dynamic calcium responses on a fast scale in living cardiomyocytes. Briefly, cells are loaded with a fluorescent Ca2+ indicator. In our studies, we used Ca2+ Green (Invitrogen, Inc.) which exhibits an increase in fluorescence emission intensity upon binding of calcium ions. The fluorescence intensity is then recorded for using a line-scan mode of a laser scanning confocal microscope. This method allows rapid acquisition of the time course of fluorescence intensity in pixels along a selected line, producing several hundreds of time traces on the microsecond time scale. These very fast traces are transferred into excel and then into Sigmaplot for analysis, and are compared to traces obtained for electronic noise, free dye, and other controls. To dissect Ca2+ responses of different flux rates, we performed a histogram analysis that binned pixel intensities with time. Binning allows us to group over 500 traces of scans and visualize the compiled results spatially and temporally on a single plot. Thus, the slow Ca2+ waves that are difficult to discern when the scans are overlaid due to different peak placement and noise, can be readily seen in the binned histograms. Very fast fluxes in the time scale of the measurement show a narrow distribution of intensities in the very short time bins whereas longer Ca2+ waves show binned data with a broad distribution over longer time bins. These different time distributions allow us to dissect the timing of Ca2+fluxes in the cells, and to determine their impact on various cellular events.

We present a method to isolate rapid (microsecond) calcium events from slower fluxes in living cells using laser scanning confocal microscopy. The method measures fluorescence intensity fluctuations of calcium indicators by recording line scans of several hundred pixels in a cell. Histogram analysis allows us to isolate the time scales of different calcium fluxes.

Mess-Fast-Flux Calcium in Kardiomyozyten

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

In vitro Transkription und Capping von Gaussia-Luciferase mRNA von HeLa-Zelle Transfektion Gefolgt

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Construction of an Affordable and Easy-to-Build Zebrafish Facility

In vivo biomedical research is pivotal to translate in vitro findings into clinical advances. Small academic institutions with limited resources find it virtually impossible to build and maintain typical rodent facilities for research. Zebrafish research has been demonstrated to be a valuable alternative for in vivo research in pharmacology, physiology, development and genetic studies. This article demonstrates that a functional zebrafish facility can be built in an easy and affordable manner. We demonstrate that such a facility could be built in about one working day with minimal tools and expertise. The cost of the 27 1.8 L fish tank zebrafish facility constructed in this study was approximately $1,500. We estimate that the maintenance of an initial working 150 fish colony for 3 months is $1,000. This project involved students, who were introduced to aquaculturing of zebrafish for research proposes.

A Zebrafish facility suitable for breeding and in vivo research is built in an easy and affordable manner. Maintenance is minimal. This facility is ideal for student involvement and independent research.

Bau eines erschwinglichen und einfach zu bauen Zebrafisch Einrichtung

In vivo biomedical research is pivotal to translate in vitro findings into clinical advances. Small academic institutions with limited resources find it ...

A Fast Air-dry Dropping Chromosome Preparation Method Suitable for FISH in Plants

Preparation of chromosome spreads is a prerequisite for the successful performance of fluorescence in situ hybridization (FISH). Preparation of high quality plant chromosome spreads is challenging due to the rigid cell wall. One of the approved methods for the preparation of plant chromosomes is a so-called drop preparation, also known as drop-spreading or air-drying technique. Here, we present a protocol for the fast preparation of mitotic chromosome spreads suitable for the FISH detection of single and high copy DNA probes. This method is an improved variant of the air-dry drop method performed under a relative humidity of 50%-55%. This protocol comprises a reduced number of washing steps making its application easy, efficient and reproducible. Obvious benefits of this approach are well-spread, undamaged and numerous metaphase chromosomes serving as a perfect prerequisite for successful FISH analysis. Using this protocol we obtained high-quality chromosome spreads and reproducible FISH results for Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum and Secale cereale.

A protocol is described for the preparation of high-quality mitotic plant chromosome spreads by a fast air-dry dropping method suitable for the FISH detection of single and high copy DNA probes.

Eine schnelle Klima trockenen Dropping Chromosom Herstellungsverfahren Geeignet für FISH in Pflanzen

Preparation of chromosome spreads is a prerequisite for the successful performance of fluorescence in situ hybridization (FISH). Preparation of high ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that involves the construction, cloning and expression of mutant libraries, coupled to high frequency homologous DNA recombination in vivo. Here, we present a protocol to create and screen mutant libraries in yeast based on the example of a fungal aryl-alcohol oxidase (AAO) to enhance its total activity. Two protein segments were subjected to focused-directed evolution by random mutagenesis and in vivo DNA recombination. Overhangs of ~50 bp flanking each segment allowed the correct reassembly of the AAO-fusion gene in a linearized vector giving rise to a full autonomously replicating plasmid. Mutant libraries enriched with functional AAO variants were screened in S. cerevisiae supernatants with a sensitive high-throughput assay based on the Fenton reaction. The general process of library construction in S. cerevisiae described here can be readily applied to evolve many other eukaryotic genes, avoiding extra PCR reactions, in vitro DNA recombination and ligation steps.

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

Entwicklung Methode Regie in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Bibliothek Schöpfung und Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the analysis of translational regulation. The method described here is an easy and economical way for fractionating polysomes from various plant tissues. A sucrose gradient is made without the need for a gradient maker by sequentially freezing each layer. Cytosolic extracts are then prepared in a buffer containing cycloheximide and chloramphenicol to immobilize the cytosolic and chloroplastic ribosomes to mRNA and are loaded onto the sucrose gradient. After centrifugation, six fractions are directly collected from the bottom to the top of the gradient, without piercing the ultracentrifugation tube. During collection, the absorbance at 260 nm is read continuously to generate a polysome profile that gives a snapshot of global translational activity. Fractions are then pooled to prepare three different mRNA populations: the polysomes, mRNAs bound to several ribosomes; the monosomes, mRNAs bound to one ribosome; and mRNAs that are not bound to ribosomes. mRNAs are then extracted. This protocol has been validated for different plants and tissues including Arabidopsis thaliana seedlings and adult plants, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum, and Oryza sativa leaves.

This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.

Eine einfache Methode für Pflanzen Polysomen Profilieren

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction channels, which is a major intercellular process by which tissue homeostasis is maintained. Interruption of gap junctional intercellular communication (GJIC) by toxicants, toxins, drugs, etc. has been linked to numerous adverse health effects. Many genetic-based human diseases have been linked to mutations in gap junction genes. The SL-DT technique is a simple functional assay for the simultaneous assessment of GJIC in a large population of cells. The assay involves pre-loading cells with a fluorescent dye by briefly perturbing the cell membrane with a scalpel blade through a population of cells. The fluorescent dye is then allowed to traverse through gap junction channels to neighboring cells for a designated time. The assay is then terminated by the addition of formalin to the cells. The spread of the fluorescent dye through a population of cells is assessed with an epifluorescence microscope and the images are analyzed with any number of morphometric software packages that are available, including free software packages found on the public domain. This assay has also been adapted for in vivo studies using tissue slices from various organs from treated animals. Overall, the SL-DT assay can serve a broad range of in vitro pharmacological and toxicological needs, and can be potentially adapted for high throughput set-up systems with automated fluorescence microscopy imaging and analysis to elucidate more samples in a shorter time.

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer technique that measures intercellular communication through gap junction channels. Gap junctional intercellular communication is a major cellular process by which tissue homeostasis is maintained and disruption of this cell signaling has adverse health effects.

Interzelluläre Gap Junction-Kommunikation: Eine funktionelle Biomarker zur Beurteilung Unerwünschte Auswirkungen von Schadstoffen und Toxinen und gesundheitlichen Vorteile von Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

An Easy and Flexible Inoculation Method for Accurately Assessing Powdery Mildew-Infection Phenotypes of Arabidopsis and Other Plants

Reducing crop losses due to fungal diseases requires improved understanding of the mechanisms governing plant immunity and fungal pathogenesis, which in turn requires accurate determination of disease phenotypes of plants upon infection with a particular fungal pathogen. However, accurate disease phenotyping with unculturable biotrophic fungal pathogens such as powdery mildew is not easy to achieve and can be a rate-limiting step of a research project. Here, we have developed a safe, efficient, and easy-to-operate disease phenotyping system using the Arabidopsis-powdery mildew interaction as an example. This system mainly consists of three components: (i) a wooden inoculation box fitted with a removable lid mounted with a stainless steel or nylon mesh of ~50 &#181;m pores for inoculating a flat of plants with fungal spores, (ii) a transparent plastic chamber with a small front opening for minimizing spore escape while conducting inoculation inside, and (iii) a spore-dislodging and distribution method for even and effective inoculation. The protocols described here include the steps and parameters for making the inoculation box and the plastic chamber at a low cost, and a video demonstration of how to use the system to enable even inoculation with powdery mildew spores, thereby improving accuracy and reproducibility of disease phenotyping.

We present a protocol for constructing a simple spore-distribution system consisting of an inoculation box with a ~50 &#181;m mesh and a transparent plastic chamber. This can be used to evenly inoculate plants with powdery mildew spores, thereby enabling accurate and reproducible assessment of disease phenotypes of plants under study.

Eine einfache und flexible Impfmethode zur genauen Beurteilung von Phänotypen von Arabidopsis und anderen Pflanzen bei Mehltauinfektionen

Reducing crop losses due to fungal diseases requires improved understanding of the mechanisms governing plant immunity and fungal pathogenesis, which in ...

Brühe Microdilution In Vitro Screening: eine einfache und schnelle Methode, um neue Antimykotika Verbindungen erkennen

Zusammenfassung

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