BURUNLARI-Brezilya, CNPq-Brezilya, FAP/DF mali destek için teşekkür ediyoruz. El yazması gözden geçirilmesi için Dr. Hugo Costa Paes için minnettarız.

1. çözümler ve medya
<ol><li>2 X Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) 1640 orta, fosfat tamponlu tuz (PBS), Sabouraud dekstroz suyu ve Sabouraud dekstroz agar Tablo 1göre hazırlayın.</li>
</ol>2. mantar Inoculum büyüme koşulları
<ol><li>İhtiyaç kadar % 35 gliserol-80 ° C'de donmuş hisselerinde olarak tüm mantar suşları depolar.</li>
	<li>Her deneme önce aşağıdaki adımları uygulayın.<ol>
<li>Candida albicans suşları için:<ol>
<li>Bir hisse senedi şişe çözülme ve Sabouraud dekstroz suyu bir kap ve kültür gecede 30 ° C'de ajitasyon (200 devir/dakika) ile bir steril 50 mL polipropilen tüp 10 mL 200 µL aktarmak. Tüp eğim ve kapağı biraz kültür daha iyi havalandırma için açık bırakmak hatırlıyorum.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Cryptococcus neoformans suşları için:<ol>
<li>Hisse senedi bir şişe donmuş yüzeyi kazıyorum. Hücreleri Sabouraud dekstroz agar plakalar üzerine plaka ve 30 ° C'de 48 h için kuluçkaya Sonra görünür büyüme izole kolonileri tabak buzdolabında (4 ° C) ile parafin film 15 gün için kapalı tutun.</li>
			<li>Bir orta ölçekli izole koloni bir steril kürdan veya steril aşı döngü kullanarak plaka toplamak ve Sabouraud dekstroz suyu bir steril 50 mL konik tüp 10 mL aşılamak. Ajitasyon (200 devir/dakika) altında 30 ° C'de yaklaşık 24 h için kuluçkaya.</li>
			<li>24 saat kuluçka fazla olamaz. Tüp eğim ve kapağı biraz daha iyi havalandırma için açık bırakmak hatırlıyorum. Bu Antimikrobiyal direnç etkileyen önemli bir faktör olduğu için önce her test hücreleri büyüme aşamasında standardize etmek her zaman iyidir. Not: Her iki mantarlar bizim deneylerde hızlı yayılma için 30 ° C'de yetiştirilmiştir ancak sıcaklık çalışma, örneğin klinik tedavi (37 ° C) amaçlarını yansıtacak şekilde değiştirilebilir. En önemlisi, bu ilk kuluçka süresi önceden her mantar izole etmek için kurulan ve tekrarlanabilirlik emin olmak için tüm testler muhafaza gerekir.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sonra mantar büyüme, konik tüpler 1200 x g oda sıcaklığında 5 min için de centrifuging tarafından hücreleri toplamak. Süpernatant atın ve PBS 10 mL ekleyin.</li>
	<li>Hücreleri ve santrifüj 1200 x g oda sıcaklığında 5 min için de tekrar resuspend.</li>
	<li>PBS yıkama ve aralıklarla iki kez daha tekrarlayın. Sonra üçüncü yıkama, 2 X RPMI-1640 orta 5 mL (göre Pelet boyutu) hücrelerde resuspend.</li>
	<li>1 mL 1: 100 veya 1:1,000 seyreltme (bağlı olarak hücre süspansiyon bulanıklık) bir microcentrifuge tüp hazırlayın.</li>
	<li>Bu seyreltme aliquot 10 µL hemasitometre odasında yerleştirin ve dört köşe çeyrek dairelerin mikroskop altında hücrelerde toplam sayısını saymak. Konsantrasyonu formülüne göre hesaplamak: (Toplam cep numarası/4) x seyreltme faktörü x 104 (odası seyreltme Sabit).<ol>
<li>% 100 canlılığı canlılığı sayar ve büyüme koşulları sistematik olarak okudu izole etmek için korelasyon düşünün. Not: Arka-kaplama uygun olarak Mayalar10 için antimikrobiyal duyarlılık testi (EUCAST) antifungal Minimum inhibitör konsantrasyonu (MIC) yöntemi Avrupa Komitesi tarafından standardizasyon ve kalite kontrol canlılığı sayıları yapılabilir .</li>
		<li>Büyüme/canlılığı korelasyon altında eğitim izole etmek için kurulmuştur değil, bir hemasitometre phloxine B11, trypan mavi gibi ölü hücreleri seçerek renk boya yardımı ile canlı hücrelerde sayarak mantar canlılığı ölçmek 12, veya Janus yeşil13. Mantar hücreleri yalnızca canlılık bu noktada nüfusunun % 90'ı ise veya yukarıda bu iletişim kuralı için kullan. Not: Ölü/canlı boyalar de seçim mantar ile çalışmayabilir. Lütfen onları kullanmadan önce sınayın. Örneğin, trypan mavi boya de C. neoformansile çalışmaz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bundan sonra hücre süspansiyonlar 2 X RPMI-1640 ortamda hazırlamak (2 X düzeltilmiş RPMI-1640 orta inoculum). 96-şey plakalar için her plaka için 5 mL hacmi göz önünde bulundurun.<ol>
<li>Tüm C. albicans suşları için 4 x 103 hücre/mL bir hisse senedi hücre süspansiyon hazırlamak. Bu 2 X her iyi (2 x 103 hücre/mL) son hücre konsantrasyon bölgedir.</li>
		<li>C. neoformans suşları için hücreleri 2 x 104 hücre/mL stok kültürünün hazırlayın. Bu iki kez her şey (1 x 104 hücre/mL) son hücre konsantrasyon bölgedir.</li>
		<li>Hangi konsantrasyon kuluçka süresi ile ilgili olarak belirli çalışma için ideal olacak bilinen bir antifungal ile diğer mantarlar için sınayın. Metabolizma ve çoğaltma zaman mantar göz önünde bulundurun.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. peptidler (bilinmeyen Aracısı)
<ol><li>-20 ° C'de lyophilized peptidler depolamak ve onları her deneme önce deiyonize su geçiyoruz. Bir kez suda en fazla saklama süresi her peptid niteliğine bağlıdır.</li>
	<li>İki kez tahlil (2 X) test en son yoğun aliquots hazırlayın. İdeal olarak, aliquots ile yeterli peptid donma-çözülme döngüsü önlemek tek seferlik kullanım için az sayıda hazır olun. Not: Seçtiğiniz toplama bir edebiyat ve peptid özelliklerini dayanmalıdır. Bu seri dilutions peptid, yaklaşık 100 µM ile başlamak ve daha sonra azaltmak veya bağlı olarak elde edilen sonuçları bu konsantrasyon aralığı artırmak için önerilir.</li>
</ol>4. başvuru Antifungaller (pozitif denetimleri)
<ol><li>Bu suda seyreltilmiş için: en yüksek konsantrasyon analizi 2 X çözeltisi hazırlamak (bkz. Bölüm 5: Antifungal tahlil seyreltme adımları için).<ol>
<li>C. albicans suşları için bir çözüm Flukonazol 128 µg/mL veya 128 µg/mL caspofungin hazırlayın. Her ikisi için de plaka konsantrasyon 64 µg/mL olacaktır.</li>
		<li>C. neoformans suşları için bir çözüm olarak 32 µg/mL amfoterisin b (suda çözünen çözelti) hazırlayın. Plaka konsantrasyon 16 µg/mL olacaktır. Not: Bu anti-mantar kötü suda çözünür olduğundan normal Amfoterisin B Dimetil sülfoksit (DMSO), seyreltilmiş. Ancak, piyasada bulunan suda çözünen Amfoterisin B hazırlıklar vardır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Organik bir çözücü içinde seyreltilmiş Antifungaller için: 100 X hisse senedi DMSO çözümde hazırlamak, sonra su kullanmak için 10 X oranında seyreltin. Not: Böylece, kuyuda, DMSO son konsantrasyonu % 1'i geçmeyecektir. Verilen bu bazı mantarlar iyi çözücü bu konsantrasyon tahammül yok nerede mantar %1 DMSO denetimi olarak içeren medya artacak bir de gereklidir. DMSO ışığa duyarlı olduğunu unutmayın, bu yüzden plaka folyo ile kapak veya kuluçka dönemi süresince karanlık bir odaya yerleştirin.</li>
</ol>5. antifungal tahlil
Not: Vitro antifungal deneyleri suyu microdilution duyarlılık testi bazı değişiklikler klinik ve laboratuvar Standartları Enstitüsü (CLSI) M27-A3 kurallarına göre gerçekleştirilir.
<ol><li>İki kat seri seyreltme her peptid, hazırlamak ve antifungal son hacmiyle 50 µL 96-şey polistren Mikroplaka içinde kontrol.<ol>
<li>Bir pipet kullanarak ekleyin antifungal/peptid 2 X konsantrasyon en yüksek 100 µL istediğiniz sütundaki son konsantrasyonu 1-3, içinde satır A.</li>
		<li>Bir çok kanallı pipet kullanarak, steril su 50 µL diğer wells, satırların H. B ekleyin.</li>
		<li>Wells en yüksek konsantrasyon (a satır) ile 50 µL kaldırmak, iyi bir sonraki konsantrasyonu (satır B) diğerine aktarmak ve homojenize.</li>
		<li>Kadar iyi en düşük konsantrasyon ile yukarıdaki adımları tekrarlayın ve bu iyi (satır H) 50 µL atın. Sütunları 11 ve 12 (satır A, B, C) boş denetim veya negatif/büyüme kontrol için sadece su ile bırakın.</li>
		<li>50 µL ayarlanan inoculum X 2 RPMI-1640 ortamda her şey (sütun 1-3 artı sütun 11 (negatif/büyüme denetimi)); ekleyin. C. neoformans suşları 104 hücre/mL olacaktır son konsantrasyonu C. albicans için 2 x 103 hücre/mL ve nihai toplama olacaktır.</li>
		<li>Boş denetimleri hazırlamak (50 µL su + 50 µL 2 X RPMI-1640 orta hücreleri olmadan) ve negatif/büyüme kontrol (50 µL su + 50 µL ayarlanabilir inoculum 2 X RPMI-1640 orta antifungal olmadan) ve yük içine iyi plaka yukarıda açıklandığı gibi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Test edilecek her bileşik için prosedür ve seçilen antifungal denetim (sütunlar 4-10) yineleyin. Not: Seri dilutions dikey olarak aşağıdaki deney olarak veya yatay olarak plaka (dilutions ekstresinin verilen bileşik/test edilmesi gereken sayısı sekiz veya daha fazla iseYani, ) yapılabilir.<ol>
<li>Bileşikler başvurursanız uyuşturucu, ya da herhangi bir bileşen ışığa duyarlı, düşük ışıkta tahlil yapmak, folyo ile kuruyucu veya karanlık bir odaya incubations sırasında yer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aşağıdaki isteğe bağlı önerileri göz önünde bulundurun.<ol>
<li>Bu yardımcı olur buharlaşma azaltmak gibi gaz değişimi, izin veren bir açık kapak plakasını ile plaka mühür.</li>
		<li>Plaka nemli bir odaya yerleştirin; Ayrıca buharlaşma azaltmak yardımcı olacaktır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Plakayı 37 ° C'de 24 saat veya 48 h 48 h ve tüm C. albicans suşları için 200 C. neoformansiçin sallayarak RPM kuluçkaya. Alt son hacim (100 µL) hiçbir yayılma oluştuğunu sağlar. Not: 24 h mikrofon ölçümlere ve C. albicans suşları için 48 h arasında anlamlı bir fark gözlendi. Yine de, okuma, 48 h görselleştirmek kolaydır.</li>
	<li>Morfoloji de bulaşma belirtileri kontrol olarak değişiklikleri doğrulamak için kuluçka dönemi önce ve sonra ters bir optik mikroskobu yardımı ile tüm wells, gözlemlemek. Not: Okuma görsel olarak yapılır ve deneme sonunda fotoğraflandı. Her okumadan önce biraz plaka lunaparkçı. Okur da onun OD 600 ölçerek gerçekleştirilebilir hücre kümeler Eğer nm, ya da filamentation değil görülmektedir.</li>
	<li>Deneyler en az üç kez ayrı tarihlerde gerçekleştirin.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Armstrong-James, D., Meintjes, G., Brown, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neglected+epidemic:+fungal+infections+in+HIV/AIDS.">A neglected epidemic: fungal infections in HIV/AIDS.</a> Trends Microbiol. 22 (3), 120-127 (2014).</li><li>Romani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+to+fungal+infections.">Immunity to fungal infections.</a> Nat Rev Immunol. 11 (4), 275-288 (2011).</li><li>Pfaller, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+drug+resistance:+mechanisms,+epidemiology,+and+consequences+for+treatment.">Antifungal drug resistance: mechanisms, epidemiology, and consequences for treatment.</a> Am J Med. 125 (1 Suppl), S3-S13 (2012).</li><li>Hancock, R. E., Diamond, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cationic+antimicrobial+peptides+in+innate+host+defences.">The role of cationic antimicrobial peptides in innate host defences.</a> Trends Microbiol. 8 (9), 402-410 (2000).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snake+cathelicidin+from+Bungarus+fasciatus+is+a+potent+peptide+antibiotics.">Snake cathelicidin from Bungarus fasciatus is a potent peptide antibiotics.</a> PLoS One. 3 (9), e3217 (2008).</li><li>Du, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AaeAP1+and+AaeAP2:+novel+antimicrobial+peptides+from+the+venom+of+the+scorpion,+Androctonus+aeneas:+structural+characterisation,+molecular+cloning+of+biosynthetic+precursor-encoding+cDNAs+and+engineering+of+analogues+with+enhanced+antimicrobial+and+anticancer+activities.">AaeAP1 and AaeAP2: novel antimicrobial peptides from the venom of the scorpion, Androctonus aeneas: structural characterisation, molecular cloning of biosynthetic precursor-encoding cDNAs and engineering of analogues with enhanced antimicrobial and anticancer activities.</a> Toxins (Basel). 7 (2), 219-237 (2015).</li><li>Benincasa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungicidal+activity+of+five+cathelicidin+peptides+against+clinically+isolated+yeasts.">Fungicidal activity of five cathelicidin peptides against clinically isolated yeasts.</a> J Antimicrob Chemother. 58 (5), 950-959 (2006).</li><li>CLSI. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibiliy Testing of Yeasts; Approved Standard -Third Edition. CLSI document M27-A3. , (2008).</li><li>Guilhelmelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+Scorpion+Venom-Derived+Antifungal+Peptides+against+Planktonic+Cells+of+Candida+spp.+and+Cryptococcus+neoformans+and+Candida+albicans+Biofilms.">Activity of Scorpion Venom-Derived Antifungal Peptides against Planktonic Cells of Candida spp. and Cryptococcus neoformans and Candida albicans Biofilms.</a> Front Microbiol. 7, 1844 (2016).</li><li>Roongruangsree, U. T., Kjerulf-Jensen, C., Olson, L. W., Lange, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viability+Tests+for+Thick+Walled+Fungal+Spores+(ex:+Oospores+of+Peronospora+manshurica).">Viability Tests for Thick Walled Fungal Spores (ex: Oospores of Peronospora manshurica).</a> Journal of Phytopathology. 123 (3), 244-252 (1988).</li><li>Boedijn, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+as+stain+for+fungi.">Trypan blue as stain for fungi.</a> Stain Technol. 31 (3), 115-116 (1956).</li><li>Goihman-Yahr, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+plating+efficiency+and+estimation+of+viability+of+suspensions+of+Paracoccidioides+brasiliensis+yeast+cells.">Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells.</a> Mycopathologia. 71 (2), 73-83 (1980).</li><li>Tati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histatin+5-spermidine+conjugates+have+enhanced+fungicidal+activity+and+efficacy+as+a+topical+therapeutic+for+oral+candidiasis.">Histatin 5-spermidine conjugates have enhanced fungicidal activity and efficacy as a topical therapeutic for oral candidiasis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 58 (2), 756-766 (2014).</li><li>Petrou, M. A., Shanson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Susceptibility+of+Cryptococcus+neoformans+by+the+NCCLS+microdilution+and+Etest+methods+using+five+defined+media.">Susceptibility of Cryptococcus neoformans by the NCCLS microdilution and Etest methods using five defined media.</a> J Antimicrob Chemother. 46 (5), 815-818 (2000).</li><li>Zaragoza, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Process+analysis+of+variables+for+standardization+of+antifungal+susceptibility+testing+of+nonfermentative+yeasts.">Process analysis of variables for standardization of antifungal susceptibility testing of nonfermentative yeasts.</a> Antimicrob Agents Chemother. 55 (4), 1563-1570 (2011).</li><li>Rodriguez-Tudela, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+shaking+on+antifungal+susceptibility+testing+of+Cryptococcus+neoformans:+a+comparison+of+the+NCCLS+standard+M27A+medium,+buffered+yeast+nitrogen+base,+and+RPMI-2%+glucose.">Influence of shaking on antifungal susceptibility testing of Cryptococcus neoformans: a comparison of the NCCLS standard M27A medium, buffered yeast nitrogen base, and RPMI-2% glucose.</a> Antimicrob Agents Chemother. 44 (2), 400-404 (2000).</li><li>Beggs, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+phase+in+relation+to+ketoconazole+and+miconazole+susceptibilities+of+Candida+albicans.">Growth phase in relation to ketoconazole and miconazole susceptibilities of Candida albicans.</a> Antimicrob Agents Chemother. 25 (3), 316-318 (1984).</li><li>Alcouloumre, M. S., Ghannoum, M. A., Ibrahim, A. S., Selsted, M. E., Edwards, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungicidal+properties+of+defensin+NP-1+and+activity+against+Cryptococcus+neoformans+in+vitro.">Fungicidal properties of defensin NP-1 and activity against Cryptococcus neoformans in vitro.</a> Antimicrob Agents Chemother. 37 (12), 2628-2632 (1993).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Microdilution testleri bir hedef bahçedeki küçük miktarlarda kullanarak bileşik potansiyel antifungal etkinliğini analiz ve aynı zamanda konsantrasyonları bir dizi test. Buna göre bu iletişim kuralı tarama potansiyel yeni mantar önleyici bileşikler için bir ilk adım olarak önerilir. Burada sunulan Protokolü başlangıçta klinikler, antifungal tedavi seçiminde yardımcı olmak için tasarlanmış M27-A3 Protokolü dayanmaktadır ve yeni mantar önleyici bileşikler çeşitli için adapte edilebilir. Gen...

Mantar enfeksiyonları haline gelmiştir önemli bir tıbbi endişe son yıllarda önemli ölçüde ana toprak dolay iden bu kanser tedavisi ve HIV/AIDS ile yaşayan geçiyor gibi immün sayisi bir artış artış veya organ1,2nakledilmektedir. Ancak, çok sınırlı bir dizi kullanılabilir antifungal ilaçların ve onlara mantar direnç raporlarda artan sayıda büyük sorunlar sistemik Mikozlar3tedavi ile ilgili katkıda bulunur.
Yeni mantar önleyici bileşikler potansiyel kaynağı antimikrobiyal peptidler (Amper), enfeksiyon4onların doğuştan gelen bağışıklık yanıtı parçası olarak çoğu organizma tarafından üretilen küçük Katyonik peptidler vardır. Yine de, bu bileşiklerin mantar patojenlere karşı test etmek için tarama yöntemi standart değil. Farklı yordamlar aynı modeli mikroorganizma5,6,7bazen amper, antifungal faaliyetten değerlendirmek için kullanılmaktadır. Bu farklılıklar ve ayrıntılı olarak bazı protokoller eksikliği engellemektedir ve bileşikleri tekrarlanabilirlik arasında karşılaştırmalar karıştırmak.
Yeni ilaç adaylarının test standart hale getirmek için bir yol antifungal duyarlılık gibi klinik klinik ayarları tanımlamak için kullanılan kurallar ve laboratuvar Standartları Enstitüsü (CLSI) M27-A3 yönergeleri takip etmektir. Ancak, bu antifungal duyarlılık testleri fazla kısıtlayıcıdır ve onlar sadece birkaç seçim maddeleri için kuruldu gibi metabolizma dikkate varyasyon içine türler arasında yapmayız. Örneğin, onlar sigara fermantasyon Mayalar metabolik ihtiyaçlarını dikkate almayın.
Bu iletişim kuralı değerlendirme faaliyet potansiyel antifungal bileşiklerin sağlar ve burada aramak için antifungal peptidler uygulanır. Suyu microdilution duyarlılık testi yeni bileşikler8,9tarama en iyi duruma getirme değişiklikler CLSI M27-A3 kurallarına dayanmaktadır. Bu değişiklikler sonuçları başvuru Antifungaller denetimleri olarak kullanımı ile standartlaştırılması ise en iyi ön-test büyüme için az miktarda bileşik, sıcaklık veya ilk inoculum ve farklı medya kullanımı için izin verir. Bu yöntemle çok iyi kültür Kaplamalar, kullanımı hızla ve güvenle bileşikler çok sayıda ekran olanak sağlar.
Doğal esnekliği nedeniyle bu protokolü farklı kimyasal sınıflar bileşiklerin ve birkaç uyarlamalar ile diğer mikroorganizmalar karşı kullanılabilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Media and Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium with l-glutamine, without sodium bicarbonate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31800-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS) (o que a gente usa tem um s&#243;dio, completa o nome dele please)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Use to buffer 2X RPMI medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Din&#226;mica</td>
			<td>1528-1</td>
			<td>137 mM for Phosphate buffered saline (PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>3040-01</td>
			<td>2.7 mM for Phosphate buffered saline (PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V000129</td>
			<td>10 mM for Phosphate buffered saline (PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60230</td>
			<td>2 mM for Phosphate buffered saline (PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Difco Sabouraud dextrose broth</td>
			<td>BD</td>
			<td>238230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Difco Sabouraud Dextrose Agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>210950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V000123</td>
			<td>35% for (solu&#231;&#227;o de estoque? Criopreserva&#231;&#227;o?)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Para dilui&#231;&#227;o das drogas na dilui&#231;&#227;o seriada</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifungal drugs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluconazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspofungin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PHR1160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastics</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dish petri</td>
			<td>J.Prolab</td>
			<td>0304-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Solution Reservoir</td>
			<td>KASVI</td>
			<td>K30-208</td>
			<td>Use to pippet the solutions using the multichannel pippet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment and other materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>E200MV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugue</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>MegaFuge 16R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Ethik Technology</td>
			<td>403-3D</td>
			<td>Set to 37&#176; C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Excella E25</td>
			<td>Set to 37&#176; C, 200 RPM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting chamber, Neubauer</td>
			<td>BOECO Germany</td>
			<td>BOE 13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette</td>
			<td>HTL</td>
			<td>5123</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

broth microdilution in vitro screening: an easy and fast method to detect new antifungal compounds

Mantar enfeksiyonları son yıllarda önemli bir sağlık sorunu haline gelmiştir, ancak kullanılabilir antifungal ilaçlar sayısı sınırlıdır. Bu senaryoda, yeni antifungal ilaçlar için arama gereklidir. Rapor burada protokol ekran peptidler bir yönteme antifungal özellikleri için ayrıntıları. Suyu microdilution duyarlılık testi olarak potansiyel yeni Antifungaller antimikrobiyal peptidler araştırma uygun değişiklikler klinik ve laboratuvar Standartları Enstitüsü (CLSI) M27-A3 kurallarına dayanmaktadır. Bu iletişim kuralı antifungal bileşikler etkinliğini değerlendirmek için işlevsel bir tahlil açıklar ve soruşturma altında moleküllerin belirli herhangi bir sınıf uyacak şekilde kolayca değiştirilebilir. Deneyleri 96-şey levha küçük birimleri kullanarak gerçekleştirilen bu yana, büyük ölçekli bir tarama zaman, kısa bir miktarda Eğer özellikle bir otomasyon ortamda yürütülen tamamlanabilir. Bu yordamı bir standart ve ayarlanabilir klinik protokol Mantar hastalıkları tedavi geliştirmek için yeni moleküller tezgah-iş arayışı nasıl yardımcı gösterilmiştir.

Mikrofon tamamen kuluçka dönemi sonundaki görünür mantar büyümesini engeller en düşük antimikrobiyal bileşik toplama olarak tanımlanır. Amacı bu iletişim kuralı, ekran potansiyel Antifungaller hızlı bir yönteme sahip olduğundan, herhangi bir şey ile bulanıklık negatif/büyüme denetim wells için benzer ise herhangi bir şey ile açık kitle iletişim araçları için boş wells benzer olumlu bir sonuç olarak kabul edilir negatif olarak kabul. Ancak, belirli bir AM...

Watch this Scientific Journal Video about Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds at JoVE.com

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

Mantar önleyici bileşikler ve özleri süzmek için bir kolay ve uyarlanabilir suyu microdilution yöntem.

Suyu Microdilution Vitro tarama: yeni mantar önleyici bileşikler algılamak için kolay ve hızlı bir yöntem

Fungal infections have become an important medical condition in the last decades, but the number of available antifungal drugs is limited. In this ...

broth-microdilution-vitro-screening-an-easy-fast-method-to-detect-new

Research

JoVE Journal

Biology

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

18.7K Görüntüleme.  University of Brasília. Mantar önleyici bileşikler ve özleri süzmek için bir kolay ve uyarlanabilir suyu microdilution yöntem.

Video: Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

Using Laser Tweezers For Manipulating Isolated Neurons In Vitro

In this paper and video, we describe the protocols used in our laboratory to study the targeting preferences of regenerating cell processes of adult retinal neurons in vitro. Procedures for preparing retinal cell cultures start with the dissection, digestion and trituration of the retina, and end with the plating of isolated retinal cells on dishes made especially for use with laser tweezers. These dishes are divided into a cell adhesive half and a cell repellant half. The cell adhesive side is coated with a layer of Sal-1 antibodies, which provide a substrate upon which our cells grow. Other adhesive substrates could be used for other cell types. The cell repellant side is coated with a thin layer of poly-HEMA. The cells plated on the poly-HEMA side of the dish are trapped with the laser tweezers, transported and then placed adjacent to a cell on the Sal-1 side to create a pair. Formation of cell groups of any size should be possible with this technique. "Laser-tweezers-controlled micromanipulation" means that the investigator can choose which cells to move, and the desired distance between the cells can be standardized. Because the laser beam goes through transparent surfaces of the culture dish, cell selection and placement are done in an enclosed, sterile environment. Cells can be monitored by video time-lapse and used with any cell biological technique required. This technique may help investigations of cell-cell interactions.

This video describes the manipulation of cultured neurons using laser tweezers in vitro.

In Vitro İzole Nöronlar kurgulama için Lazer Cımbız

In this paper and video, we describe the protocols used in our laboratory to study the targeting preferences of regenerating cell processes of adult ...

Biyoloji

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level. There are several methods, both in vitro and in vivo, to evaluate protein binding, and at least two methods that complement the shortcomings of each other should be conducted to obtain reliable insights. 
For an in vivo assay, the bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assay represents the most popular and least invasive approach that enables to detect protein-protein interaction within living cells, as well as identify the intracellular localization of the interacting proteins 1,2. In this assay, non-fluorescent N- and C-terminal halves of GFP or its variants are fused to tested proteins, and when the two fusion proteins are brought together due to the tested proteins&#x2019; interactions, the fluorescent signal is reconstituted3-6. Because its signal is readily detectable by epifluorescence or confocal microscopy, BiFC has emerged as a powerful tool of choice among cell biologists for studying about protein-protein interactions in living cells 3. This assay, however, can sometimes produce false positive results. For example, the fluorescent signal can be reconstituted by two GFP fragments arranged as far as 7 nm from each other due to close packing in a small subcellular compartment, rather that due to specific interactions7.
Due to these limitations, the results obtained from live cell imaging technologies should be confirmed by an independent approach based on a different principle for detecting protein interactions. Co-immunoprecipitation (Co-IP) or glutathione transferase (GST) pull-down assays represent such alternative methods that are commonly used to analyze protein-protein interactions in vitro. However, iIn these assays, however, the tested proteins must be readily soluble in the buffer that supportsused for the binding reaction. Therefore, specific interactions involving an insoluble protein cannot be assessed by these techniques.
 Here, we illustrate the protocol for the protein membrane overlay binding assay, which circumvents this difficulty. In this technique, interaction between soluble and insoluble proteins can be reliably tested because one of the proteins is immobilized on a membrane matrix. This method, in combination with in vivo experiments, such as BiFC, provides a reliable approach to investigate and characterize interactions faithfully between soluble and insoluble proteins. In this article, binding between Tobacco mosaic virus (TMV) movement protein (MP), which exerts multiple functions during viral cell-to-cell transport8-14, and a recently identified plant cellular interactor, tobacco ankyrin repeat-containing protein (ANK) 15, is demonstrated using this technique.

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Testing protein-protein interaction is indispensable for dissection of protein functionality. Here, we introduce an in vitro protein-protein binding assay to probe a membrane-immobilized protein with a soluble protein. This assay provides a reliable method to test interaction between an insoluble protein and a protein in solution.

Protein Membran Kaplama Testi: Çözünür ve çözünmez Proteinler Arasında Etkileşim Test Protokolü In vitro</em

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level.  There are several ...

Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to extracellular agents is predominantly regulated by the phospholipase C&beta;- G&alpha;q pathway localized on the plasma membrane which is stimulated by agents such as acetylcholine 3,4. We have recently found that plasma membrane protein domains called caveolae5,6 can entrap activated G&alpha;q 7. This entrapment has the effect of stabilizing the activated state of G&alpha;q and resulting in prolonged Ca2+ signals in cardiomyocytes and other cell types8. We uncovered this surprising result by measuring dynamic calcium responses on a fast scale in living cardiomyocytes. Briefly, cells are loaded with a fluorescent Ca2+ indicator. In our studies, we used Ca2+ Green (Invitrogen, Inc.) which exhibits an increase in fluorescence emission intensity upon binding of calcium ions. The fluorescence intensity is then recorded for using a line-scan mode of a laser scanning confocal microscope. This method allows rapid acquisition of the time course of fluorescence intensity in pixels along a selected line, producing several hundreds of time traces on the microsecond time scale. These very fast traces are transferred into excel and then into Sigmaplot for analysis, and are compared to traces obtained for electronic noise, free dye, and other controls. To dissect Ca2+ responses of different flux rates, we performed a histogram analysis that binned pixel intensities with time. Binning allows us to group over 500 traces of scans and visualize the compiled results spatially and temporally on a single plot. Thus, the slow Ca2+ waves that are difficult to discern when the scans are overlaid due to different peak placement and noise, can be readily seen in the binned histograms. Very fast fluxes in the time scale of the measurement show a narrow distribution of intensities in the very short time bins whereas longer Ca2+ waves show binned data with a broad distribution over longer time bins. These different time distributions allow us to dissect the timing of Ca2+fluxes in the cells, and to determine their impact on various cellular events.

We present a method to isolate rapid (microsecond) calcium events from slower fluxes in living cells using laser scanning confocal microscopy. The method measures fluorescence intensity fluctuations of calcium indicators by recording line scans of several hundred pixels in a cell. Histogram analysis allows us to isolate the time scales of different calcium fluxes.

Hızlı Kalsiyum Dekapanları kardiyomiyositlerde Ölçme

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

HeLa Hücre Transfeksiyon Ardından Gaussia Lusiferaz mRNA in vitro transkripsiyon ve Kapatma yılında

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Construction of an Affordable and Easy-to-Build Zebrafish Facility

In vivo biomedical research is pivotal to translate in vitro findings into clinical advances. Small academic institutions with limited resources find it virtually impossible to build and maintain typical rodent facilities for research. Zebrafish research has been demonstrated to be a valuable alternative for in vivo research in pharmacology, physiology, development and genetic studies. This article demonstrates that a functional zebrafish facility can be built in an easy and affordable manner. We demonstrate that such a facility could be built in about one working day with minimal tools and expertise. The cost of the 27 1.8 L fish tank zebrafish facility constructed in this study was approximately $1,500. We estimate that the maintenance of an initial working 150 fish colony for 3 months is $1,000. This project involved students, who were introduced to aquaculturing of zebrafish for research proposes.

A Zebrafish facility suitable for breeding and in vivo research is built in an easy and affordable manner. Maintenance is minimal. This facility is ideal for student involvement and independent research.

Bir Ekonomik ve Kolay oluşturun Zebra balığı Tesisi İnşaatı

In vivo biomedical research is pivotal to translate in vitro findings into clinical advances. Small academic institutions with limited resources find it ...

A Fast Air-dry Dropping Chromosome Preparation Method Suitable for FISH in Plants

Preparation of chromosome spreads is a prerequisite for the successful performance of fluorescence in situ hybridization (FISH). Preparation of high quality plant chromosome spreads is challenging due to the rigid cell wall. One of the approved methods for the preparation of plant chromosomes is a so-called drop preparation, also known as drop-spreading or air-drying technique. Here, we present a protocol for the fast preparation of mitotic chromosome spreads suitable for the FISH detection of single and high copy DNA probes. This method is an improved variant of the air-dry drop method performed under a relative humidity of 50%-55%. This protocol comprises a reduced number of washing steps making its application easy, efficient and reproducible. Obvious benefits of this approach are well-spread, undamaged and numerous metaphase chromosomes serving as a perfect prerequisite for successful FISH analysis. Using this protocol we obtained high-quality chromosome spreads and reproducible FISH results for Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum and Secale cereale.

A protocol is described for the preparation of high-quality mitotic plant chromosome spreads by a fast air-dry dropping method suitable for the FISH detection of single and high copy DNA probes.

Bitkilerde FISH için uygun bir Hızlı Hava kuru Damlama Kromozom Hazırlama Yöntemi

Preparation of chromosome spreads is a prerequisite for the successful performance of fluorescence in situ hybridization (FISH). Preparation of high ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that involves the construction, cloning and expression of mutant libraries, coupled to high frequency homologous DNA recombination in vivo. Here, we present a protocol to create and screen mutant libraries in yeast based on the example of a fungal aryl-alcohol oxidase (AAO) to enhance its total activity. Two protein segments were subjected to focused-directed evolution by random mutagenesis and in vivo DNA recombination. Overhangs of ~50 bp flanking each segment allowed the correct reassembly of the AAO-fusion gene in a linearized vector giving rise to a full autonomously replicating plasmid. Mutant libraries enriched with functional AAO variants were screened in S. cerevisiae supernatants with a sensitive high-throughput assay based on the Fenton reaction. The general process of library construction in S. cerevisiae described here can be readily applied to evolve many other eukaryotic genes, avoiding extra PCR reactions, in vitro DNA recombination and ligation steps.

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

Evrim Yöntemi yönettiği<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Kütüphane Oluşturma ve Tarama

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the analysis of translational regulation. The method described here is an easy and economical way for fractionating polysomes from various plant tissues. A sucrose gradient is made without the need for a gradient maker by sequentially freezing each layer. Cytosolic extracts are then prepared in a buffer containing cycloheximide and chloramphenicol to immobilize the cytosolic and chloroplastic ribosomes to mRNA and are loaded onto the sucrose gradient. After centrifugation, six fractions are directly collected from the bottom to the top of the gradient, without piercing the ultracentrifugation tube. During collection, the absorbance at 260 nm is read continuously to generate a polysome profile that gives a snapshot of global translational activity. Fractions are then pooled to prepare three different mRNA populations: the polysomes, mRNAs bound to several ribosomes; the monosomes, mRNAs bound to one ribosome; and mRNAs that are not bound to ribosomes. mRNAs are then extracted. This protocol has been validated for different plants and tissues including Arabidopsis thaliana seedlings and adult plants, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum, and Oryza sativa leaves.

This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.

Bitki Polizom Profiling için bir Kolay Yöntem

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction channels, which is a major intercellular process by which tissue homeostasis is maintained. Interruption of gap junctional intercellular communication (GJIC) by toxicants, toxins, drugs, etc. has been linked to numerous adverse health effects. Many genetic-based human diseases have been linked to mutations in gap junction genes. The SL-DT technique is a simple functional assay for the simultaneous assessment of GJIC in a large population of cells. The assay involves pre-loading cells with a fluorescent dye by briefly perturbing the cell membrane with a scalpel blade through a population of cells. The fluorescent dye is then allowed to traverse through gap junction channels to neighboring cells for a designated time. The assay is then terminated by the addition of formalin to the cells. The spread of the fluorescent dye through a population of cells is assessed with an epifluorescence microscope and the images are analyzed with any number of morphometric software packages that are available, including free software packages found on the public domain. This assay has also been adapted for in vivo studies using tissue slices from various organs from treated animals. Overall, the SL-DT assay can serve a broad range of in vitro pharmacological and toxicological needs, and can be potentially adapted for high throughput set-up systems with automated fluorescence microscopy imaging and analysis to elucidate more samples in a shorter time.

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer technique that measures intercellular communication through gap junction channels. Gap junctional intercellular communication is a major cellular process by which tissue homeostasis is maintained and disruption of this cell signaling has adverse health effects.

Gap Junctional Hücreler arası iletişim: Doğal Ürünler Toksikantların ve Toksinler Yan Etkileri değerlendirmek için Fonksiyonel Biyomarker ve Sağlık Faydaları

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

An Easy and Flexible Inoculation Method for Accurately Assessing Powdery Mildew-Infection Phenotypes of Arabidopsis and Other Plants

Reducing crop losses due to fungal diseases requires improved understanding of the mechanisms governing plant immunity and fungal pathogenesis, which in turn requires accurate determination of disease phenotypes of plants upon infection with a particular fungal pathogen. However, accurate disease phenotyping with unculturable biotrophic fungal pathogens such as powdery mildew is not easy to achieve and can be a rate-limiting step of a research project. Here, we have developed a safe, efficient, and easy-to-operate disease phenotyping system using the Arabidopsis-powdery mildew interaction as an example. This system mainly consists of three components: (i) a wooden inoculation box fitted with a removable lid mounted with a stainless steel or nylon mesh of ~50 &#181;m pores for inoculating a flat of plants with fungal spores, (ii) a transparent plastic chamber with a small front opening for minimizing spore escape while conducting inoculation inside, and (iii) a spore-dislodging and distribution method for even and effective inoculation. The protocols described here include the steps and parameters for making the inoculation box and the plastic chamber at a low cost, and a video demonstration of how to use the system to enable even inoculation with powdery mildew spores, thereby improving accuracy and reproducibility of disease phenotyping.

We present a protocol for constructing a simple spore-distribution system consisting of an inoculation box with a ~50 &#181;m mesh and a transparent plastic chamber. This can be used to evenly inoculate plants with powdery mildew spores, thereby enabling accurate and reproducible assessment of disease phenotypes of plants under study.

Arabidopsis ve diğer bitkilerin külleme enfeksiyonu fenotiplerini doğru bir şekilde değerlendirmek için kolay ve esnek bir aşılama yöntemi

Reducing crop losses due to fungal diseases requires improved understanding of the mechanisms governing plant immunity and fungal pathogenesis, which in ...

Suyu Microdilution Vitro tarama: yeni mantar önleyici bileşikler algılamak için kolay ve hızlı bir yöntem

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler