Wir danken Sabine Reckinger für exzellente technische Hilfe und Unterstützung.

1. Vorbereitungen <ol><li> Beispielsammlung Hinweis: Der Magnetrührer Verfahren kann für einzelne oder gepoolte Muskelproben verwendet werden. <ol><li> Die Proben aus den entsprechenden Prädilektionsstellen und in einer angemessenen Menge 9. Beachten Sie die länderspezifischen Anforderungen oder den Empfehlungen der IKT, der OIE oder ISO. <ol><li> Für die Europäische Union, zum Beispiel, nehmen Sie eine 1 g Probe aus einem Zwerchfellpfeiler am Übergang zum sehnigen Teil von Hausschweinen. Stellen Sie sicher, dass alle Muskelproben frei von Fett und Bindegewebe sind. </li></ol></li><li> Wenn die Zunge getestet wird, entfernen Sie die Oberflächenschicht vor dem Test. </li><li> Achten Sie darauf , ob die Proben eingefroren werden, da die meisten Trichinenlarven nicht beständig einfrieren und abrollen nach dem Tod, sind weniger resistent gegen die Verdauung und neigen dazu , an den Behälterwänden zu haften, zu einer verringerten Empfindlichkeit des Assays führt. Hinweis: Wenn gefroren, verdoppeln die Stichprobengröße bei lOsten und die Sedimentation Zeit zu erhöhen (siehe unten). </li></ol></li><li> Vorbereitung der Verdauungsflüssigkeit <ol><li> In 25% HCl (16 ± 0,5 ml) auf 2 l Leitungswasser vorgewärmt bei 46 bis 48 ° C in einen 3 L Becherglas. Eine zu niedrige Temperatur führt zu einer unvollständigen Verdauung; zu hohe Temperatur deaktiviert die enzymatischen Eigenschaften von Pepsin. </li><li> Legen Sie einen Rührstab in den Becher, und rühren Sie die Lösung auf eine vorgewärmte Platte (46-48 ° C). </li><li> Werden 10 ± 0,2 g Pepsin (1: 10.000 NF, 1: 12.500, BP, 2.000 FIP) mit der sauren Lösung. Hinweis: Die Qualität des Pepsin ist von größter Bedeutung, und die Enzymaktivität muss vom Hersteller zertifiziert werden. Für Labor Gründen der Sicherheit und der Pepsin Aktivität zu erhalten, wobei die Reihenfolge Verdauungsflüssigkeit Komponenten der Zugabe muss eingehalten werden. </li></ol></li><li> Muskel - Probenvorbereitung <ol><li> Hacken Sie bis zu 100 g Muskelproben in einem Mixer oder Schleifer. Zur Erleichterung der blending, 2 ml für 2 Wasser zu den Proben und mischen bei max Geschwindigkeit vorgewärmt - 3 s. </li><li> Vor der zweiten Mischung, öffnen Sie den Mixer geben und übertragen jede Muskelprobe an der Spitze des Mischschüssel Kantenrand auf den Boden und wiederholen Sie Blending. Weiter mit Ausbrüchen von 2 Mischen - 3 s, bis keine sichtbaren Fleischstücke bleiben. Hinweis: Eine zu geringe Vermischung in unvollständiger Verdauung führen, während zu viel Verschnitt 6 die Trichinella Larven in den Proben vorhandenen beschädigen. </li></ol></li></ol> 2. Verfahren <ol><li> Muscle Probenaufschluss <ol><li> Übertragung 1 L des Verdauungsflüssigkeit in einen Zylinder. Übertragen Sie das Hackfleisch in den Becher und zu verbreiten, in der Verdauungsflüssigkeit mit einem Löffel oder Gabel. Spülen Sie den Mixer Deckel, Messer und Mixer Schüssel mit 500 ml des vorgewärmten Verdauungsflüssigkeit in den 3-Liter-Becher. Hinweis: Unvollständige Spülen in dem Verlust von sens führen kannitivity. </li><li> Decken Sie den Becher mit Aluminiumfolie und halten eine konstante Temperatur von 44-46 ° C und Monitor mit einem Thermometer. </li><li> Rühren Sie die Verdauungsflüssigkeit für 30 Minuten einen tiefen Wirbel ohne Spritzen zu schaffen, bis die Fleischpartikel verschwinden. Je nach der Art des Fleisches getestet (zB Fleisch von Wildtieren), erhöhen die Verdauungszeit bis maximal 60 min. </li></ol></li><li> Filtration und Sedimentation des Verdauungsflüssigkeit <ol><li> Um die Menge der unverdauten Gewebe bestimmen, stellen Sie die Waage auf Null, wiegen das Sieb vor dem Gebrauch, und beachten Sie dessen Gewicht. Das Sieb sollte sauber und frei von irgendwelchen Gewebepartikel sein, die die Trichinenlarven Erreichen des Sedimentationstrichter behindern könnten. Überprüfen Sie, ob die Trennung Trichter vertikal nivelliert. </li><li> Nach der Verdauung, gießen Sie vorsichtig die Verdauungsflüssigkeit durch ein 180 um Sieb in einen Trichter Trennung Glas. Die Breite des Trennglastrichter sollte nicht be größer als 55% der Länge gute Larve Sedimentation zu ermöglichen. Achten Sie darauf, um ein Überlaufen zu vermeiden. </li><li> Um zu vermeiden, Verlust der Empfindlichkeit, gründlich den Glasbecher und das Sieb mit etwa 200 ml Leitungswasser aus einer Spritzflasche und übertragen das Spülwasser in die Sedimentation Glastrichter. Achten Sie sorgfältig die Ränder des 3-Liter-Becher spülen. Heben Sie das Sieb und spülen Sie gründlich die Fläche unter dem Sieb. </li></ol></li><li> Bestimmung von unverdauten Gewebemenge Anmerkung: Aufgrund von Fehlern in der Ausführung des Verfahrens kann Muskelgewebe verbleiben auf dem Sieb als auch Faszie und Bindegewebe, die unverdaulich sind. Die Menge der unverdauten Gewebe wird während der ersten 10 min Sedimentationsschritt (siehe 2.5) bestimmt. Auf diese Weise können etwa 30 Minuten für das Sieb, um zu trocknen, als Restwasser das ermittelte Gewicht des unverdauten Gewebe beeinflussen können. <ol><li> Legen Sie ein Papiertuch auf einer Skala und wiegen das Sieb mit den undigested Gewebe. </li><li> Ziehen Sie das Sieb Gewicht vor der Filtration aus dem Sieb Gewicht mit unverdauten Gewebe. Der Verdauungsvorgang wird als zufriedenstellend angesehen , wenn nicht mehr als 5% des Gewichts der Probe auf dem Sieb bleibt (dh 5 g / 100 g Ausgangsmaterial). </li><li> Wenn die Menge an unverdauten Gewebe 5% übersteigt, wiederholen Sie den Test mit frischen Muskelproben. Wenn das verbleibende Gewebe überwiegend aus unverdauten Muskelgewebe besteht und frische Proben nicht verfügbar sind, verdauen die unverdaute Reste wieder und zusätzlich zu den Originalproben untersuchen. </li></ol></li><li> Sedimentation des Verdauungsflüssigkeit <ol><li> Halten des gefilterten Verdauungsflüssigkeit in dem Scheidetrichter während 30 min. Wenn in Ruhe gelassen, wird die Trichinenlarven am Boden des Trichters zu begleichen. </li><li> Wenn gefrorene Proben verwendet werden, auf maximal 60 min die Sedimentationszeit erhöhen. </li><li> Sobald Sedimentation abgeschlossen ist, öffnen Sie die Hahnmindestens 40 ml der Verdauungsflüssigkeit schnell ablaufen in einen Messzylinder (80 ml, wenn Muskelproben zuvor gefroren gewesen war) des Trenntrichter zu lassen. </li><li> Zunächst wird die Hälfte der Flüssigkeit in den Zylinder lassen und dann vollständig öffnen Sie den Hahn in die entgegengesetzte Richtung 10 ml der Verdauungsflüssigkeit passieren zu lassen. Schließlich öffnen Sie den Hahn in die entgegengesetzte Richtung für weitere 10 mL. Dieses Verfahren stellt sicher , dass Trichinella - Larven werden in den Hahn nicht eingeschlossen. Hinweis: Eine ausreichende Geschwindigkeit benötigt wird, um Larven zu vermeiden, in dem Scheidetrichter verbleibende, abnehmende Empfindlichkeit. </li></ol></li><li> Sedimentation der Verdauungsflüssigkeit in dem Zylinder <ol><li> Lassen Sie das Sediment in dem Zylinder für 10 min Larven zu ermöglichen, zu sedimentieren. Entfernen Sie 30 ml Überstand mit einer Pipette Absaugen des 10 ml Sediment ohne zu stören. </li><li> Um die Menge an Gewebefasern in der Probe zu reduzieren, 30 ml Leitungswasser auf dem Sediment und lassen für weitere 10 mWiederholen Sie in., Bis die Flüssigkeit klar ist. </li><li> Überstand entfernen und übertragen die 10 ml Sediment zu einem gerasterten Petrischale oder Larvenzählbecken gewaschen. Spülen Sie den Zylinder mit 10 ml Leitungswasser und dann das Wasser auf die Probe hinzufügen. Hinweis: Da große Mengen von Verunreinigungen in der Probe , die die Identifizierung der Trichinenlarven verhindern kann (Abbildung 1), sollten weitere Waschschritte durchgeführt werden, falls erforderlich. </li></ol></li><li> Mikroskopische Untersuchung <ol><li> Verwenden Sie einen Trichinoskop oder ein Stereo-Mikroskop mit einer Unterstufe Durchlichtquelle mit einstellbarer Intensität bei einer 15 bis 20-facher Vergrößerung, die Proben unmittelbar nach den Waschschritten zu untersuchen. </li><li> Nachdem die Probe in die gerasterten Petrischale gegossen, untersuchen Sie die Schale / Becken systematisch Raster durch Gitter. Wenn keine verdächtigen Strukturen gefunden werden, bewegen sich sanft die Flüssigkeit in der gerasterten Petrischale oder Larvenzählbecken in einer kreisförmigen Art und Weise jede Trichinella la zu ermöglichenrvae, die möglicherweise übersehen wurden, in der Mitte der Petrischale zu akkumulieren. Wiederholen Sie die Prüfung. </li><li> Wenn ein Verdächtiger Struktur gefunden wird, erhöhen Vergrößerung auf 40 - 100X. Entfernen Trichinenlarven aus der Schale / Becken mit einer Pipette und sammeln sich in einem Rohr mit 90% Ethanol. </li><li> Nachdem das komplette Gericht untersucht worden ist, wiederholen Sie den Vorgang, aus dem leichtem Schütteln der Schale / Becken beginnen. Wiederholen Sie das Verfahren mindestens dreimal oder bis keine Larven gefunden. </li><li> Zählen Sie die Anzahl der Larven. Korrelieren auf die Menge an Muskelgewebe getestet und Gegenwart als Larven pro Gramm (LPG). </li><li> Wenn zu viele Larven in der Verdauungsflüssigkeit sind die Larvenzahl zuverlässig zu bestimmen, kehren die Flüssigkeit die Larven in den Messzylinder enthält, Spülen mit Leitungswasser aus einer Spritzflasche, und lassen Larven auf den Boden absetzen. </li><li> Nach 10 min Sedimentationszeit, reduzieren den Überstand zu einem definierten Volumen (zB10 ml). Um das genaue Volumen, den Überstand in ein neues Zylinder mit einer Pipette bestimmen. </li><li> Suspend Larven homogen in der Flüssigkeit durch kräftiges Schütteln. Während der Schüttelbewegung, fügen Sie 12 Tropfen von 20 &amp; mgr; l Larvensuspension auf eine Petrischale. </li><li> Untersuchen Sie jeden Tropfen unter dem Mikroskop. Bestimmen Sie die Anzahl der Larven in 240 &amp; mgr; l und löschen Sie den höchsten und den niedrigsten zählen. Extrapolieren die Anzahl der Larven auf das Gesamtvolumen (zB 10 ml) des Überstandes. Hinweis: Die Qualität des Stereomikroskop ist von größter Bedeutung für die Identifikation von Trichinella - Larven. </li><li> Wenn Larven werden in ein Röhrchen mit einer Pipette gesammelt, sorgfältig zu prüfen, dass die Larven nicht an der Pipettenwand kleben haben, sind aber auf das Rohr übertragen. Hinweis: Positive Trichinella Erkenntnisse aus gepoolten Proben aus dem Pool zurückgeführt auf die Karkasse Herkunfts werden müssen. Hier sollte die Poolgröße schrittweise verringert werden, bis die positive Karkasse Iden istzierten. Die Stichprobengröße kann auch während dieses Prozesses erhöht werden Empfindlichkeit zu erhöhen. Bei der Untersuchung einer Sammelprobe ein positives oder nicht eindeutiges Ergebnis wird eine weitere 20-g-Probe von jedem Schwein entnommen. Die 20 g-Proben von fünf Schweinen werden gepoolt und untersucht die beschriebene Methode verwendet. Auf diese Weise Proben aus 20 Gruppen von fünf Schweinen untersucht. Wenn Trichinella in einer Sammelprobe von fünf Schweinen festgestellt wird, 20 g Proben werden von den einzelnen Schweine in der Gruppe gesammelt und jeweils getrennt untersucht , bis die positive Karkasse Ursprungs erkannt wird. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Obwohl die Magnetrührverfahren leicht durchgeführt werden, nicht unbedingt an den technischen Details Einhaltung führt zu einer unzureichenden Empfindlichkeit und damit die Gesundheit der Verbraucher gefährden. Die kritischen Kontrollpunkte wurden im Text oben hervorgehoben. Darüber hinaus ist die Verwendung von geeigneter Ausrüstung entscheidend für das erfolgreiche Ergebnis des Tests. Alle Schiffe sollten mit Silizium an der Oberfläche das Anhaften von Larven zu reduzieren beschichteten aus Glas und Pipettenspitzen werden. Die Empfindlichkeit des Verdauungsmethode hängt von der Larvendichte in den Muskeln und das Ausmaß der Muskel getesteten Probe. Für einen Larvendichte von 3 bis 5 lpg von Muskelgewebe, wurde eine Empfindlichkeit von 100% angegeben, aber unter 1 lpg sank die Empfindlichkeit auf 40% 13. In Abhängigkeit von den getesteten Wirtstierarten kann die Empfindlichkeit des Tests durch die Erhöhung der Menge der Probe verbessert werden verwendet. Das infection Belastung in Tierwelt ist in der Regel gering, daher größere Proben Größen 14 verwendet. Prädilektionsstellen variieren auch bei den Wirtstieren. Dabei wird die geringere Verdaulichkeit von einigen Muskelgewebe wie die Zunge berücksichtigt werden muss, die auch in größeren Probe führen kann Größen 15. Ferner ist es wichtig, daß der Magnetrührer Verfahren internen Kontrollen nicht enthalten zu verstehen. Daher ist Qualitätsmanagement von der Probenahme bis hin zur Dokumentation wesentlich genaue und präzise Ergebnisse zu erhalten. Die Qualität der Laborleistung zu Trichinenlarven in Muskelproben erkennen sollte durch regelmäßige Teilnahme jedes Analyst in Eignungsprüfungen überwacht werden. Weitere Einschränkungen des Verfahrens sind, dass die endgültige Identifizierung Stufe der Muskellarven unter dem Mikroskop sehr subjektiv ist und heavily abhängig von der Kenntnis der Larvenmorphologie von der Prüfungs Analyst. Eine interessante Alternative Methode, dieses Problem zu umgehen, ist die Magnetrührverfahren / auf Filtertrennung gefolgt von Larven Erfassung durch einen Latex-Agglutinationstest. Doch nach EU - Gesetzgebung wird diese Methode nur dann als gleichwertig betrachtet für die Prüfung von Fleisch von Hausschweinen , aber nicht für Tiere , die 4 ein höheres Risiko einer Infektion wie Wildschweine sind. Die Identifizierung des Larven Antigen mit monoklonalen Antikörpern , macht den Test Ziel, bestreitet aber das Labor die Möglichkeit , 16 , um die Anzahl der Larven pro Gramm Fleisch zu bestimmen. Weitere Variationen des Magnetrührverfahren umfassen die mechanisch unterstützt Verdauung von Sammelproben-Methode / Sedimentation Technik, die mechanisch unterstützte Sammelprobe digestion Verfahren / auf Filterisolationstechnik und die automatische Verdauungsverfahren für Sammelproben von bis zu 35 g Technik. Diese Verfahren basieren alle auf der künstlichen Verdauung des Fleisches und die Visualisierung und Zählen von Trichinella Larven, unterscheiden sich aber in der Ausrüstung für die Filtration und Sedimentation Schritte verwendet. Die isolierte Larven können weiter auf Artenebene durch einen molekularen Test (zB Multiplex - PCR) 17 identifiziert werden. Nach der EU - Gesetzgebung, alle positiven Proben müssen an das nationale Referenzlabor oder auf EURLP für die Trichinenart Bestimmung weitergeleitet werden.

Nematoden der Gattung Trichinella in gestreifter Muskeln von carnivore und omnivore Säugetiere, Vögel und Reptilien weltweit nachgewiesen werden. Diese Zoonose-Nematoden können Menschen erreichen, wenn roh oder halb rohes Fleisch und Fleischprodukte aus Schwein, Pferd und Wildtiere aufgenommen werden. Diese Zoonose kann eine ernsthafte Erkrankung des Menschen durch pathognomonische Anzeichen und Symptome, zum Beispiel Durchfall, Fieber, periorbitales Ödem und Myalgie und mögliche Komplikationen wie Myokarditis, thromboembolischen Erkrankungen und Enzephalitis 1 gekennzeichnet sein. Trichinella spiralis ist die am weitesten verbreitete Erreger der Trichinella - Infektion bei Wild- und Haustieren und bewirkt , dass die meisten der Infektionen beim Menschen weltweit. In Europa, Nord- und Westafrika und Westasien, ist Trichinella britovi eine weitere Quelle von Infektionen beim Menschen. Zusätzlich sind zehn anderen Taxa weniger häufig als verursachendes berichtet<html> Agenten der Krankheit beim Menschen und sind in verschiedenen Regionen der Welt, in der Regel bei Wildtieren 2 gefunden. Neben Wildtiere wie Wildschweine, Bären, Walrosse und Dachse, stellt Schweinefleisch die wichtigste Quelle für eine Infektion beim Menschen weltweit. Der beste Weg , Trichinellose zu verhindern , ist durch den Verzehr von rohen Fleischprodukten zu verzichten und kein Fleisch zu kochen, vor allem Wildfleisch zu sicheren Temperaturen (&gt; 65 ° C für 1 min, das heißt , um die Fleischfarbe in den Kern des zu braun aus rosa ändern Fleischprodukt) 3. Die Europäische Union und USDA haben Einfrieren und Garzeiten und Temperaturen für Schweinefleisch - Produkte angegeben , die verwendet werden können , um T. spiralis Larven in Fleisch 4, 5 töten. Darüber hinaus Empfehlungen für die Inaktivierung von Trichinen in Fleisch und Fleischwaren wurden von der Internationalen Kommission für Trichinellose veröffentlicht&quot;xref&quot;&gt; 6. In Europa, zusätzlich zu der Einführung von kontrollierten Bedingungen in kommerziellen Schweineherden in denen das Risiko von Trichinen - Infektion vernachlässigbar ist, ist die Prävention von Menschen Trichinellose auf der Basis der Laboruntersuchung von Muskelproben von empfänglichen Tieren 4. Für die Ernährungssicherheit, die Verdauung Assays sind die einzigen zuverlässigen Verfahren für den direkten Nachweis von Trichinella - Larven im Fleisch 3, 7. Wenn es auch mehrere Varianten des Verdauungstest sind, ist der Magnetrührer Verfahren der international akzeptierten Referenzverfahren 3, 4, 7. Dieser Test basiert auf dem Nachweis von Trichinen Larven in quergestreifter Muskeln. Nach der enzymatischen Verdauung von Muskelproben und anschließender Filtration und Sedimentation Schritte, Trichinella Larven werden durch Mikroskopie identifiziert. Je nach Handelsverpflichtungen und der nationalen Gesetzgebung, gibt es eine Vielzahl von kleinen Variationen in dem allgemeinen Protokoll des Magnetrührverfahren. Hier werden technische Details basierend auf den Anforderungen der EU 4, ISO - Spezifikationen 8, ICT - Richtlinien 6 und die Erfahrung der Europäischen Union Referenzlabor für Parasites (EURLP) und dem deutschen Referenzlabor für Trichinella.

<table><tbody><tr><td>Knife, Scissors, Tweezers</td><td></td><td></td><td>Cutting samples and removing non-digestible tissue</td></tr><tr><td>Blender&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>With a sharp chopping blade</td></tr><tr><td>Magnetic stirrer</td><td></td><td></td><td>With thermostatically controlled heating plate</td></tr><tr><td>Stirring Rod</td><td></td><td></td><td>Teflon-coated, approximately 5 cm long</td></tr><tr><td>Conical glass separation funnel</td><td></td><td></td><td>Capacity of at least 2 L, preferably fitted with Teflon safety plugs. The width should not be larger than 55% of the length to allow a good larva sedimentation.</td></tr><tr><td>Stands, rings and clamps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sieve</td><td></td><td></td><td>Mesh size 180 microns, external diameter 11 cm, with stainless steel mesh</td></tr><tr><td>Funnel</td><td></td><td></td><td>Internal diameter not less than 12&amp;nbsp;cm, to support the sieves</td></tr><tr><td>Glass beaker</td><td></td><td></td><td>Capacity 3 L</td></tr><tr><td>Glass measuring cylinder</td><td></td><td></td><td>Capacity 50 to 100 mL, or centrifuge tube</td></tr><tr><td>Stereo-microscope</td><td></td><td></td><td>With a substage transmitted light source of adjustable intensity or trichinoscope with a horizontal table</td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td></td><td></td><td>9 cm diameter, marked on their undersides into 10 &amp;times; 10 mm square examination areas using a pointed instrument or a larval counting basin for the tricinoscope</td></tr><tr><td>Aluminium foil</td><td></td><td></td><td>Alternatively a lid to cover the beakers</td></tr><tr><td>25% hydrochloric acid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pepsin</td><td></td><td></td><td>Strength: 1:10,000 NF (US National Formulary) corresponding to 1:12,500 BP (British Pharmacopoeia) and to 2,000 FIP (F&amp;eacute;d&amp;eacute;ration internationale de pharmacie), or stabilised liquid pepsin with minimum 660 European Pharmacopoeia units/mL</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td>70-90% ethyl alcohol</td></tr><tr><td>Tap water</td><td></td><td></td><td>Heated to 46-48 &amp;deg;C before use</td></tr><tr><td>Balance</td><td></td><td></td><td>Accurate to at least 0.1 g</td></tr><tr><td>Metal tray</td><td></td><td></td><td>Capacity 10 to 15 L, to collect the remaining digestive juice</td></tr><tr><td>Pipettes and pipette holder</td><td></td><td></td><td>Different sizes (1, 10 and 25 mL)</td></tr><tr><td>Thermometer</td><td></td><td></td><td>Accurate to 0.5 &amp;deg;C, temperature range at least from 20 &amp;deg; C to 70&amp;nbsp;&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Siphon</td><td></td><td></td><td>For tap water</td></tr></tbody></table>

magnetic stirrer method for the detection of trichinella larvae in muscle samples

Trichinellose ist eine schwächende Krankheit beim Menschen und wird durch den Verzehr von rohen oder ungekochten Fleisch von infizierten Tieren mit der Nematodenlarven der Gattung Trichinella verursacht. Die wichtigsten Quellen von Infektionen beim Menschen weltweit sind Wildfleisch und Schweinefleisch oder Schweinefleischprodukte. In vielen Ländern ist die Verhinderung von menschlichen Trichinellosis basierend auf der Identifizierung von infizierten Tieren mittels der künstlichen Verdauung von Muskelproben von anfälligen Tierkadavern. Es gibt mehrere Methoden, die auf die Verdauung von Fleisch, aber der Magnetrührer Methode wird als Goldstandard. Dieses Verfahren erlaubt den Nachweis von Trichinen Larven durch Mikroskopie nach der enzymatischen Verdauung von Muskelproben und anschließender Filtration und Sedimentation Schritte. Obwohl dieses Verfahren nicht spezielle und teure Ausrüstung erfordert, können interne Kontrollen nicht verwendet werden. Daher sollten strengen Qualitätsmanagement Applie werdenwährend des gesamten Tests d. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist es detaillierte Anweisungen zum Umgang und kritischen Kontrollpunkte des Verfahrens der Analysten zur Verfügung zu stellen, auf der Grundlage der Erfahrungen der Europäischen Union Referenzlabor für Parasiten und das nationale Referenzlabor in Deutschland für Trichinella.

<html> Nach dem Verdau kann die Form des infektiösen Larven Muskel variieren, erschwert Identifizierung. Typische Formen sind eng gewickelten Larven, leicht aufgerollt Larven oder C-förmigen oder vollständig abgewickelte Larven (2B - 2C). Die Anzahl der Larven pro Gramm gefunden kann beträchtlich variieren und von einer Larve zu einigen hundert Larven reichen kann. Die Morphologie der infektiösen Muskel Larve wird in 2A gezeigt. Trichinella Larven sind 0,7 bis 1,5 mm lang und etwa 0,3 mm in der Breite. Die Speiseröhre ist schmal und hat eine leicht abgerundete Ende. Die Nagelhaut ist glatt. In der vorderen Hälfte des Körperhohlraums, der stichosome, die eine Struktur eines langen schlanken Röhre durch eine Reihe von 45 bis 55 große Zellen (stichocytes) umgeben gebildet beobachtet werden. Das Rektum ist auch abgerundet ohne Vorsprünge oder Anhängsel 10, 11. t &quot;&gt; Andere Strukturen, neben Trichinenlarven kann nach Muskel Verdauung gefunden werden Einige Beispiele sind in den 3A gezeigt -.. 3F Wilde Tiere werden oft mit anderen Parasiten oder den Muskelproben zur Verfügung infizierte zum Testen während der Ausweidung Prozess durch belebtes verunreinigt oder unbelebter Strukturen / Organismen. die Länge der Larven, das Aussehen der vorderen und hinteren Enden und das Auftreten der stichosome Hilfe zwischen verschiedenen Nematodengattungen 12 zu unterscheiden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55354/55354fig1.jpg" /> Abbildung 1: Die mikroskopische Untersuchung von Trichinenlarven Nach (A) Unzureichende und (B) ausreichend Spülschritte. Maßstabsbalken zeigen an 100 &amp; mgr; m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55354/55354fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55354/55354fig1large.jpg" target="_blank">um eine größere ve</a>rsion dieser Figur. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55354/55354fig2.jpg" /> Abbildung 2: Morphologie der Infektiöse Trichinenlarven Anzeigen der Rektum, Stichosome und Speiseröhren der Larve (A). Mögliche Formen der Muskel Larven nach der Verdauung zeigt (B) eng gewickelten und leicht aufgerollt Larven bewegen und (C) abgespult Larven. Maßstabsbalken zeigen an 100 &amp; mgr; m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55354/55354fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55354/55354fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/55354/55354fig3.jpg" /> Abbildung 3: Beispiele für Zufallsbefunde nach der Verdauung von Muskel - Proben mit dem Magnetrührverfahren. (A) borstenartigen HaarenErde Wurm in Wildschwein gefunden; (B) Alaria alata von Wildschweinen; (C) Muskelfaser von Wildschweinen; (D) Metastrongylus sp. von Wildschweinen; Toxocara sp: (E) aus Pflanzenfasern in Wildschwein (F) gefunden. Larve von Wildschwein. Maßstabsbalken zeigen an 100 &amp; mgr; m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55354/55354fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55354/55354fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Die Verhinderung von menschlichen Trichinellosis in vielen Ländern der Welt wird durch Verfahren des Verdaus auf der Laboruntersuchung von Muskelproben von empfänglichen Tieren basiert, von denen der Magnetrührer Verfahren der Goldstandard gilt.

Magnetrührers Verfahren zum Nachweis von<em&gt; Trichinella</em&gt; Larvae in Muskelproben

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

28.6K Aufrufe.  Federal Institute for Risk Assessment.  Die Verhinderung von menschlichen Trichinellosis in vielen Ländern der Welt wird durch Verfahren des Verdaus auf der Laboruntersuchung von Muskelproben von empfänglichen Tieren basiert, von denen der Magnetrührer Verfahren der Goldstandard gilt. 

Serie: Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris is a natural pathogen of mice and is biologically and antigenically similar to species of Trichuris that 
infect humans and livestock1. Infective eggs are given by oral gavage, hatch in the distal small intestine, invade the intestinal epithelial cells (IECs) 
that line the crypts of the cecum and proximal colon and upon maturation the worms release eggs into the environment1. This model is a powerful tool to 
examine factors that control CD4+ T helper (Th) cell activation as well as changes in the intestinal epithelium. The immune response that occurs in 
resistant inbred strains, such as C57BL/6 and BALB/c, is characterized by Th2 polarized cytokines (IL-4, IL-5 and IL-13) and expulsion of worms while Th1-associated 
cytokines (IL-12, IL-18, IFN-&gamma;) promote chronic infections in genetically susceptible AKR/J mice2-6. Th2 cytokines promote physiological changes in 
the intestinal microenvironment including rapid turnover of IECs, goblet cell differentiation, recruitment and changes in epithelial permeability and smooth muscle 
contraction, all of which have been implicated in worm expulsion7-15. Here we detail a protocol for propagating Trichuris muris eggs which can 
be used in subsequent experiments. We also provide a sample experimental harvest with suggestions for post-infection analysis. Overall, this protocol will provide 
researchers with the basic tools to perform a Trichuris muris mouse infection model which can be used to address questions pertaining to Th proclivity in 
the gastrointestinal tract as well as immune effector functions of IECs.

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris infection is an intestinal model of Th2 immunity where resistant mice generate a protective Th2 response and susceptible mice generate a pathological Th1 response.

Trichuris muris Infektion: Ein Modell des Typ-2-Immunität und Entzündung im Darm

Trichuris muris is a natural pathogen of mice and is biologically and antigenically similar to species of Trichuris that 
infect humans and livestock1. ...

Forschung

Immunologie und Infektion

ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) Method for Mycotoxin Detection

Immunoassays are a valid alternative to the more expensive and time consuming quantitative HPLC or GC1, 2 methods for the screening detection of hazardous mycotoxins in food commodities. In this protocol we show how to fabricate and interrogate an electrochemical competitive Enzyme linked immunomagnetic assay based on the use of magnetic beads as solid support for the immunochemical chain3 and screen printed electrodes as sensing platform.
Our method aims to determine the total amount of HT-2 and T-2 toxins, mycotoxins belonging to the trichothecenes family and of great concern for human health4. The use of an antibody clone with a cross reactivity of 100% towards HT-2 and T-2 allows to simultaneously detect both toxins with similar sensitivity5.
The first step of our assay is the coating step where we immobilize HT2-KLH conjugate toxin on the surface of magnetic beads. After a blocking step, necessary to avoid non-specific absorptions, the addition of a monoclonal antibody allows the competition between immobilized HT-2 and free HT-2 or T-2 present in the sample or dissolved in a standard solution.
At the end of the competition step, the amount of monoclonal antibody linked to the immobilized HT-2 will be inversely proportional to the amount of toxin in the sample solution.
A secondary antibody labeled with alkaline phosphatase (AP) is used to reveal the binding between the specific antibody and the immobilized HT-2. The final measurement step is performed by dropping an aliquot of magnetic bead suspension, corresponding to a specific sample/standard solution, on the surface of a screen-printed working electrode; magnetic beads are immobilized and concentrated by means of a magnet placed precisely under the screen-printed electrode. After two minutes of incubation between magnetic beads and a substrate for AP, the enzymatic product is detected by Differential Pulse Voltammetry (DPV) using a portable instrument (PalmSens) also able to initiate automatically eight measurements within an interval of few seconds.

ELIME Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical Method for Mycotoxin Detection

A protocol to detect trichothecenes (mycotoxins of concern for human health) using a newly developed screening method based on a competitive immunochemical method and a final electrochemical detection is demonstrated.

ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Elektrochemische) Verfahren zur Mykotoxin-Erkennung

Immunoassays are a valid alternative to the more expensive and time consuming quantitative HPLC or GC1, 2 methods for the screening detection of hazardous ...

Biologie

Examining Muscle Regeneration in Zebrafish Models of Muscle Disease

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, the muscle stem cell is activated and undergoes cell proliferation to generate a pool of myoblasts, which subsequently differentiate to form new muscle fibers. In many muscle wasting conditions, including muscular dystrophy and ageing, this process is impaired resulting in the inability of muscle to regenerate. The process of muscle regeneration in zebrafish is highly conserved with mammalian systems providing an excellent system to study muscle stem cell function and regeneration, in muscle wasting conditions such as muscular dystrophy. Here, we present a method to examine muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease. The first step involves the use of a genotyping platform that allows the determination of the genotype of the larvae prior to eliciting an injury. Having determined the genotype, the muscle is injured using a needle stab, following which polarizing light microscopy is used to determine the extent of muscle regeneration. We therefore provide a high throughput pipeline which allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

Skeletal muscle regeneration is driven by tissue resident muscle stem cells, which are impaired in many muscle diseases such as muscular dystrophy, and this results in the inability of muscle to regenerate. Here, we describe a protocol that allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

Untersuchung der Muskelregeneration in Zebrafischmodellen von Muskelerkrankungen

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, ...

Entwicklungsbiologie

Intramuscular Injections Along the Motor End Plates: A Minimally Invasive Approach to Shuttle Tracers Directly into Motor Neurons

Diseases affecting the integrity of spinal cord motor neurons are amongst the most debilitating neurological conditions. Over the last decades, the development of several animal models of these neuromuscular disorders has provided the scientific community with different therapeutic scenarios aimed at delaying or reversing the progression of these conditions. By taking advantage of the retrograde machinery of neurons, one of these approaches has been to target skeletal muscles in order to shuttle therapeutic genes into corresponding spinal cord motor neurons. Although once promising, the success of such gene delivery approach has been hampered by the sub-optimal number of transduced motor neurons it has so far shown to yield. Motor end plates (MEPs) are highly specialized regions on the skeletal musculature that are in direct synaptic contact to the spinal cord &#945; motor neurons. In this regard, it is important to note that, so far, the efforts to retrogradely transfer genes into motor neurons were made without reference to the location of the MEP region in the targeted muscles. Here, we describe a simple protocol 1) to reveal the exact location of the MEPs on the surface of skeletal muscles and 2) to use this information to guide the intramuscular delivery and subsequent optimal retrograde transport of retrograde tracers into motor neurons. We hope to utilize the results from these tracing experiments in further studies into investigating retrograde transport of therapeutic genes to spinal cord motor neurons through the targeting of MEPs.

The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.

Intramuskuläre Injektionen Entlang der motorischen Endplatten: eine minimal-invasive Ansatz zur Shuttle Tracers Direkt in Motoneuronen

Diseases affecting the integrity of spinal cord motor neurons are amongst the most debilitating neurological conditions. Over the last decades, the ...

Neurowissenschaften

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in communication with the epidermal cells they innervate and thus their analysis benefits from in situ visualization of both neuronally and epidermally expressed proteins by immunofluorescence. Traditional methods of preparing larval fillets for immunofluorescence experiments leave intact the muscle tissue that covers most of the body wall, presenting several challenges to imaging neuronal and epidermal proteins. Here we describe a method for removing muscle tissue from Drosophila larval fillets. This protocol enables imaging of proteins that are otherwise obscured by muscle tissue, improves signal to noise ratio, and facilitates the use of super-resolution microscopy to study da neuron development.

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Studies of neuronal morphogenesis using Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons benefit from in situ visualization of neuronal and epidermal proteins by immunofluorescence. We describe a procedure that improves immunofluorescence analysis of da neurons and surrounding epidermal cells by removing muscle tissue from the larval body wall.

Entfernung von<em&gt; Drosophila</em&gt; Muskelgewebe aus Larval Filets für Immunfluoreszenzanalyse von sensorischen Neuronen und epidermalen Zellen

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional measures of muscle health. In this video article, we demonstrate a method to measure force generation during contraction of zebrafish larval trunk muscle. Force measurements are accomplished by placing an anesthetized larva into a chamber filled with a salt solution. The anterior end of the larva is tied to a force transducer and the posterior end of the larva is tied to a length controller. An isometric twitch contraction is elicited by electric field stimulation and the force response is recorded for analysis. Force generation during contraction provides a measure of overall muscle health and specifically provides a measure of muscle function. Although we describe this technique for use with wild-type larvae, this method can be used with genetically modified larvae or with larvae treated with drugs or toxicants, to characterize muscle disease models and evaluate treatments, or to study muscle development, injury, or chemical toxicity.

Force measurements can be used to demonstrate changes in muscle function due to development, injury, disease, treatment or chemical toxicity. In this video, we demonstrate a method to measure force during a maximal contraction of zebrafish larval trunk muscle.

Kraftmessung während der Kontraktion zu Muscle Funktion in Zebrafisch-Larven bewerten

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate filament proteins that sustain the nuclear envelope and the components of the nucleoplasm. We recently reported that muscle wasting in EDMD can be ascribed to intrinsic epigenetic dysfunctions affecting muscle (satellite) stem cells regenerative capacity. Isolation and culture of single myofibers is one of the most physiological ex-vivo approaches to monitor satellite cells behavior within their niche, as they remain between the basal lamina surrounding the fiber and the sarcolemma. Therefore, it represents an invaluable experimental paradigm to study satellite cells from a variety of murine models. Here, we describe a re-adapted method to isolate intact and viable single myofibers from post-natal hindlimb muscles (Tibialis Anterior, Extensor Digitorum Longus, Gastrocnemius and Soleus). Following this protocol, we were able to study satellite cells from Lamin &#916;8-11 -/- mice, a severe EDMD murine model, at only 19 days after birth.
We detail the isolation procedure, as well as the culture conditions for obtaining a good amount of myofibers and their associated satellite-cells-derived progeny. When cultured in growth-factors rich medium, satellite cells derived from wild type mice activate, proliferate, and eventually differentiate or undergo self-renewal. In homozygous Lamin &#916;8-11 -/- mutant mice these capabilities are severely impaired.
This technique, if strictly followed, allows to study all processes linked to the myofiber-associated satellite cell even in early post-natal developmental stages and in fragile muscles.

Here, we propose a method to efficiently obtain single muscle fibers at early post-natal developmental stages from homozygous mutant Lamin &#916;8-11 mouse model, a very severe model for Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD).

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate ...

Medizin

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Isolierung von Mitochondrien von minimalen Mengen an Maus-Skelettmuskel für die Hochdurchsatz-Mikroplatten-Atemmessungen

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Betrachtung von Mikrotubuli-Netzwerken in neuromuskulären Verbindungen und Muskelzellen von Drosophila

Using Drosophila Larval Neuromuscular Junction and Muscle Cells to Visualize Microtubule Network

The microtubule network is an essential component of the nervous system. Mutations in many microtubules regulatory proteins are associated with neurodevelopmental disorders and neurological diseases, such as microtubule-associated protein Tau to neurodegenerative diseases, microtubule severing protein Spastin and Katanin 60 cause hereditary spastic paraplegia and neurodevelopmental abnormalities, respectively. Detection of microtubule networks in neurons is advantageous for elucidating the pathogenesis of neurological disorders. However, the small size of neurons and the dense arrangement of axonal microtubule bundles make visualizing the microtubule networks challenging. In this study, we describe a method for dissection of the larval neuromuscular junction and muscle cells, as well as immunostaining of &#945;-tubulin and microtubule-associated protein Futsch to visualize microtubule networks in Drosophila melanogaster. The neuromuscular junction permits us to observe both pre-and post-synaptic microtubules, and the large size of muscle cells in Drosophila larva allows for clear visualization of the microtubule network. Here, by mutating and overexpressing Katanin 60 in Drosophila melanogaster,&#160;and then examining the microtubule networks in the neuromuscular junction and muscle cells, we&#160;accurately reveal the regulatory role of Katanin 60 in neurodevelopment. Therefore, combined with the powerful genetic tools of Drosophila&#160;melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

Autor im Rampenlicht: Verständnis des Mikrotubuli-Netzwerks in neuromuskulären Verbindungen von Drosophila 

Here, we present a detailed protocol to visualize the microtubule networks in neuromuscular junctions and muscle cells. Combined with the powerful genetic tools of Drosophila melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule-dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

Magnetrührers Verfahren zum Nachweis von

Zusammenfassung

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