This research was supported by the Brain Research Program through the National Research Foundation (NRF) funded by the Korean Ministry of Science, ICT, and Future Planning (NRF-2015M3C7A1028790).

Tierversuche müssen auf alle relevanten staatlichen und institutionellen Vorschriften entsprechen. 1. Vorbereitung der Reagenzien <ol><li> Für das Hydrogel Monomerlösung (A4P0): In 20 g Acrylamid zu 450 ml 0,1 × phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und das Volumen auf 500 ml mit 0,1X PBS einzustellen. ACHTUNG: Acrylamidmonomere giftig sind. Führen Sie alle in einem Abzug mit persönlicher Schutzausrüstung, einschließlich eines Gesichtsschutz, Laborkittel, Handschuhe und geschlossene Schuhe. <ol><li> Unmittelbar vor der 40 ml Hydrogel Monomerlösung (A4P0) in einem 50 ml konischen Röhrchen unter einer Abzugshaube 100 mg 2,2&#39;-Azobis [2- (2-imidazolin-2-yl) propan] dihydrochlorid zu verwenden, fügen . </li></ol></li><li> Für die elektrophoretische Gewebe Clearing (ETC) Puffer: In 40 g Natriumdodecylsulfat (SDS) und 12,37 g Borsäure zu 800 ml entionisiertem H 2 O (dH 2 O). Der pH-Wert mit NaOH auf 8,5 und die Lautstärke zu1 L mit zusätzlichen dH 2 O. ACHTUNG: SDS ist eine schädliche Chemikalie; daher sollte diese sorgfältig behandelt. </li><li> Für die CUBIC-Mount - Lösung: In 250 g Saccharose, 125 g Harnstoff und 125 g N, N, N &#39;, N&#39; Tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylendiamin zu 150 ml dH 2 O und bringen die Lautstärke auf 500 ml mit dH 2 O. </li></ol> 2. Probenvorbereitung &amp; Fixierungen <ol><li> Euthanasie der Maus. <ol><li> Bereiten Sie die Alfaxalon (1 mg / kg) und Xylazin (0,5 mg / kg) in derselben Spritze. </li><li> Intraperitoneal injizieren, um die Mischung aus Alfaxalon und Xylazin und erlauben 3 min für die Maus bewusstlos zu werden. </li><li> Warten Sie, bis die narkotisierten Maus reagiert nicht mehr auf schmerzhafte Reize, wie ein Schwanz und Zuziehen, bevor Sie fortfahren. ACHTUNG: Befolgen Sie die entsprechenden institutionellen Richtlinien für den Umgang mit Tieren. </li></ol></li><li> Transkardial perfundiert die Maus mit 100 ml 0,9% NaCl (pH 7,4-7,5) -Lösungenthaltend Heparin (100 U / ml) zu exsanguinate, um 100 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) in 1x PBS (pH 7,4) 14 gefolgt. ACHTUNG: PFA - Lösung ist giftig. Die Herstellung von PFA-Lösung und die gesamte anschließende Handhabung muss in einem Abzug und mit persönlicher Schutzausrüstung durchgeführt werden. </li><li> Schneiden Sie die Maus den Kopf ab, öffnen die Haut, und brechen den Schädel zwischen den Augen mit einer kleinen Schere. </li><li> Entfernen Stücke des Schädels mit kleinen, gebogenen Pinzette. </li><li> Nehmen Sie das Gehirn oder gewünschten Organe aus. </li><li> Inkubiere das Gehirn und Organe in der Post-fix 4% PFA-Lösung bei 4 ° C über Nacht. HINWEIS: Für spezifische Region Gewebe Clearing, die spezifische Region sezieren oder das Gewebe nach Gewebefixierung trimmen. ACHTUNG: PFA - Lösung ist giftig. Die transkardialer Perfusion und alle nachfolgenden Maus Handhabung muss in einem Abzug und mit persönlicher Schutzausrüstung durchgeführt werden. </li></ol> 3. Hydrogel Monomer Infusion und Polymerization <ol><li> Inkubieren der festen Organe in A4P0 Hydrogel-Monomer-Lösung bei 4 ° C für 12-24 h unter leichtem Schütteln. </li><li> Hydrogelmonomer-infundiert Gewebe Polymerisation. <ol><li> Übertragung der Probe in einen 10 ml Rundbodenröhrchen mit 5 ml Hydrogel Monomerlösung. Wickeln Sie das obere Ende der Rundbodenrohr mit Parafilm. </li><li> Entfernen des Sauerstoffs aus der Rundbodenrohr, das Hydrogel-infundiert gesamten Gehirn der Maus enthaltenden Probe von 1 min Stickstoff durch die Flüssigkeit sprudeln. Schnell und dicht schließen Sie die Probe enthaltenden Röhre. </li></ol></li><li> Übertragen, um das Rohr zu dem Wasserbad (37 ° C) für 2 h. </li><li> Waschen Sie die polymerisierte Probe kurz mit 0.1x PBS Überschuss Hydrogel zu entfernen. ACHTUNG: Hydrogele Monomere sind giftig. Hautkontakt mit Hydrogelmonomer, führen Sie alle Verfahren in einem Abzug und mit persönlicher Schutzausrüstung, einschließlich eines Gesichtsschutz, Laborkittel und Handschuhe zu vermeiden. HINWEIS: Polymerisierte Gewebekann für mehr als 2 Wochen bei 4 ° C in 0,1 × PBS, das Natriumazid gelagert werden. ACHTUNG: Natriumazid ist hoch und akut toxisch. Führen Sie alle in einem Abzug und mit persönlicher Schutzausrüstung, einschließlich eines Gesichtsschutz, Laborkittel und Handschuhe. </li></ol> 4. Die elektrophoretische Tissue Clearing (ETC) <ol><li> Übertragen Sie die polymerisierte Probe auf einen Gewebebehälter und legen Sie den Gewebebehälter in der ETC-Kammer. </li><li> Füllen Sie das ETC-Kammer mit ETC-Puffer mit peristatische Pumpe. </li><li> Stellen Sie die ETC-Bedingungen und führen Sie den ETC. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen. <ol><li> Für ETC-Einstellungen für ganze Organe, verwenden Sie die folgenden Einstellungen: (1,5 Ampere), Temperatur (37 ° C), Laufzeit (6,0 h), Pumpendrehzahl (30 Umdrehungen pro Minute). </li><li> Für ETC-Einstellungen für 1- bis 2 mm dicke Maus Hirnschnitten, verwenden Sie die folgenden Einstellungen: Strom (1,5 Ampere), Temperatur (37 ° C), Laufzeit (2,0 h), Pumpendrehzahl (30 Umdrehungen pro Minute). </li></ol></li><li> Transfer ter gelöscht Probe auf einem 50 ml konischen Röhrchen mit 45 ml 0,1X PBS. Waschen Sie die gelöscht Probe mehrmals mit 0.1x PBS, bis keine Blasen zu sehen sind, wenn das Rohr kurz geschüttelt wird (um die vollständige Entfernung von SDS bestätigen). </li></ol> 5. Immunmarkierung von ACT-verarbeitete Gewebe <ol><li> Für Maus gesamte Gehirn: Inkubieren der Probe in einer 3-ml-Volumen der Antikörperlösung, enthaltend 1x PBS, 6% Rinderserumalbumin (BSA), 0,1% Triton X-100 und 0,01% Natriumazid (Antikörperverdünnungslösung) mit einem Verdünnungs Faktor 1/500 für Tyrosin-Hydroxylase (TH) Antikörper für 4 Tage bei 37 ° C mit leichtem Schütteln. Ersetzen Sie die Antikörperlösung am Ende des Tages 2. <ol><li> Waschen Sie die Probe in einem 50 ml konischen Röhrchen mit 45 ml 0,1 x PBS 3 - 5 h und wechselt jede Stunde Puffer. </li><li> Inkubieren der Probe in einer 3-ml-Volumen der Antikörperverdünnungslösung mit einem Verdünnungsfaktor von 1/500 für Esel-anti-Kaninchen-488 sekundärem Antikörper für 4 Tage bei 37 ° C mit leichtem Schütteln. replAss der verdünnten Antikörperlösungen am Tag 2. </li></ol></li><li> Für 1- bis 2 mm dicke Scheiben geschnitten Hirngewebe: Inkubieren der Probe über Nacht oder bis zu 1 Tag in einem 0,5- bis 1-ml-Volumen der Antikörperverdünnungslösung mit einem Verdünnungsfaktor von 1/500 für Kollagen Typ IV-Antikörper bei 37 ° C mit leichtem Schütteln. <ol><li> Waschen Sie die Probe in einem 15-ml konischen Röhrchen mit einem 12-ml-Volumen von 0,1 × PBS für 1-2 h. Ändern Sie den Puffer jede Stunde. </li><li> Inkubieren der Probe in einer 0,5- bis 1-ml-Volumen der Antikörperverdünnungslösung mit einem Verdünnungsfaktor von 1/500 für Cy3-konjugiertem anti-Kaninchen Sekundär-Antikörper über Nacht oder bis zu 1 Tag bei 37 ° C mit leichtem Schütteln. </li></ol></li><li> Waschen Sie die Probe in 0,1 × PBS 3 - 5 h; wechselt jede Stunde Puffer. </li><li> Vor der Bebilderung, die Probe in einer geeigneten Menge kubisch-Mount-Lösung für 1 h bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubiert. Ersetzen mit frischem CUBIC-Mount-Lösung und Inkubation für 1 weitere Stunde. HINWEIS: </b&gt; 76 Typ von Antikörpern funktionierte gut in Maus ACT-verarbeitete Gewebe, darunter 31 monoklonale Antikörper 14. Pre-markiertes Gewebe kann mit der Immunmarkierung von zwei Fluorochromen in ACT-verarbeitete Gewebe kombiniert werden. </li></ol> 6. Immunmarkierung von dichten Gewebe (PRESTO) <ol><li> c-PRESTO HINWEIS: c-PRESTO eignet sich für kleine Proben, wie Voll testis, gesamte Niere oder kleine Abschnitte größerer Organe. <ol><li> Übertragung der Probe in ein 1,5-ml-Röhrchen, 500 &amp; mgr; l Antikörperverdünnungslösung mit einem Verdünnungsfaktor von 1/500 für Kollagen Typ IV-Antikörper und zentrifugieren Sie das Rohr bei 600 × g für 2 h. </li><li> Waschen der gefärbten Probe mit 0,1X PBS durch Zentrifugation bei 600 × g für 30 min. </li><li> Fügen 500 ul Antikörperverdünnungslösung mit einem Verdünnungsfaktor von 1/500 für Cy3-konjugiertes anti-Kaninchen-Sekundärantikörper und Zentrifuge bei 600 × g für 2 h. </li><li> Waschen Sie die gefärbte Probe mit 0.1x PBS durch Zentrifugation bei 600 × g für 30 min. </li></ol></li><li> s-PRESTO HINWEIS: s-PRESTO ist für größere Gewebe geeignet. <ol><li> Bereiten Sie eine Spritze (30 ml Volumen) und verbinden Sie es mit einem 3-Wege - Ventil (Abbildung 1A). Kleben Sie das Ventil mit einer Klebepistole für den Hochdruckbedingungen (1B). </li><li> Transfer der Probe in die 3-Wege-Ventil angeschlossenen Spritze in der geschlossenen Ventilstellung. </li><li> Hinzufügen von 5 bis 7 ml Antikörperverdünnungslösung mit einem Verdünnungsfaktor von 1/500 für Kollagen Typ IV-Antikörper. Lösen der Antikörperlösung in die Probe durch Öffnen des Ventils. </li><li> Stellen Sie den Spritzenkolben in die 17-ml-Position ausreichend Platz zu schaffen für die Infusion / Rückzugsbewegung. Dies kann in der offenen Ventilstellung erfolgen. Schließen das 3-Wegeventil, nachdem die Spritze Einstellung beendet ist. </li><li> Legen Sie die Spritze die Probe auf eine Spritzenpumpe enthält. Set die Spritzenpumpe Bedingungen in einem Infusions- / Entnahmevolumen von 10 ml / min und einem 4-min Zeit auf Dauerzyklus Pause - Modus (Abbildung 1C). HINWEIS: Die Pumpe infundiert , bis er das Zielvolumen (10 ml) erreicht hat , und dann die Strömungsrichtung ändert sich nach einer kurzen Pause (4 min). </li><li> Führen Sie die Spritzenpumpe 3 - 24 h bei Raumtemperatur (1F). </li><li> Öffnen Sie das 3-Wege-Ventil und ersetzen Sie die Lösung mit 0,1 x PBS. </li><li> Waschen Sie die gefärbte Probe zweimal mit 0,1X PBS für 1 h bei jedem der Spritzenpumpe. </li><li> Ändern Sie mit Antikörperverdünnungslösung, die Cy3-konjugierten Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (Verdünnungsfaktor von 1/500) und führen Sie die Spritzenpumpe 3 - 24 h. </li><li> Öffnen Sie das 3-Wege-Ventil und ersetzen Sie die Lösung mit 0,1 x PBS. </li></ol></li><li> Vor der Bildgebung, brüten die gefärbte Probe in einer geeigneten Menge CUBIC-Mount-Lösung für 1 h bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. Ersetzen mit frischem CUBIC-Mount-Lösung und Inkubation für 1 weitere Stunde. </li></ol> 7. ichmaging <ol><li> Legen Sie das markierte Gewebe in einem konfokalen Schüssel und fügen Sie CUBIC-Mount-Lösung, bis das Gewebe bedeckt ist. Legen Sie ein Deckglas auf das Gewebe. Verwenden Sie ein konfokales Mikroskop zur Abbildung des Gewebes 14 unter dem 10X - Objektiv. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Schlechte Fixierung oder Hydrogel Eintauchen in das Gewebe kann den Verlust von Proteinen führen und die Verzerrung des Gewebes während des Gewebes Clearing-Prozess. Die ganze erwachsenen Gehirn der Maus sollte über Nacht in 4% Paraformaldehyd inkubiert werden, gefolgt von Eintauchen in einem minimalen Volumen von 20 ml Hydrogel Monomerlösung für 12 bis 18 h unter leichtem Schütteln. Für große Gewebe einschließlich menschliches Gewebe wie Gehirn und Rückenmark slices verlängerte Zeit in dem Hydrogel Monomerlösung Einweichen erforderlich. Das ACT-Protokoll ist leicht anwendbar für das Clearing von fixierten Gewebe, weil die Gewebefixierung und Polymerinfusionsschritte getrennt sind. Nach Gewebe Lichtung wurden menschliche Gewebe mit mehreren Antikörpern gut gefärbt. Beachten Sie, dass die ACT Verrechnungsverfahren mit Alkohol Fixiermitteln, wie Ethanol und Methanol nicht kompatibel ist. Das Gewebe-Hydrogel-Polymerisationsschritt ist auch wichtig, gute Qualität Gewebe nach dem Clearing-Verfahren herzustellen. weilSauerstoff inhibiert die Polymerisation von Acrylamid, sollte es durch Entgasen des Gewebe enthaltenden Lösung unter einem Stickstoffgasinfusionssystem entfernt werden. Alternativ kann De-Sauerstoffversorgung für 23 h mit einer Vakuumkammer unter Verwendung von mit einem Wärmeblock ausgeführt werden. Die Clearing - Rate hängt von zahlreichen Faktoren ab , einschließlich der Organgröße, die Inhalte von Lipiden oder ECM Faserproteine, den Zustand der Fixierung, usw. Die meisten erwachsenen Mausgeweben kann über Nacht durch ETC gelöscht werden. Es besteht jedoch die Gefahr einer unnötigen Über Clearing- und Gewebe Schwellung; Somit sind die Unterschiede in der Klärungszeit von wichtiger Gesichtspunkt. Tissue-Clearing-Bedingungen sollten empirisch ermittelt werden. Wichtig ist, dass der Inhalt der ECM kann das Aussehen des Gewebes beeinträchtigen gelöscht. Die Farbe des Gewebes bleibt weiß oder opak, selbst nach dem ACT in ETC-Puffer, da ACT nicht dichten Proteinfasern löschen. Wenn jedoch wurden diese Organe in RI passende Lösung eingetaucht, diey wurde durchsichtig. Die Rate der Gewebeschwellung erscheint auf den ECM Inhalte der Gewebe und weiche Organe, wie das Gehirn, weisen ein höheres Quellverhältnis als dichte Organe abhängig. Da erhöhte Gewebe nutzt ACT Schwellung wird das Gewebe-Clearing-Verfahren helfen, routinemäßig auf Wasserbasis Puffer in den meisten Fällen destilliert. In einigen Fällen, wenn Gewebeschwellung oder transient Deformierung nicht erwünscht ist, wie beispielsweise in Embryonen, Puffer, enthaltend 0,1X PBS für hochauflösende Bildgebung angewendet werden. Es sollte auch bemerkt werden, dass höhere Salzkonzentrationen in dem Puffer die Schrumpfung des Gewebes verursachen könnten. Die ACT - Methode können ganze Organe zu klären und auch den ganzen Körper einer Maus 14. Allerdings erfordert tiefen Gewebe-Bildgebung von transparenten Gewebe speziellen Mikroskopen und Ziele. Somit Hirngewebe 1- bis 2 mm dick ist am effektivsten für die Bildgebung mit einem herkömmlichen konfokalen Mikroskop. In unseren Händen, das Entfernen des Etikettsed Antikörper aus ACT-verarbeitete Gewebe ist die Antikörper-abhängige und Runden von verschiedenen Antikörpermarkierung sind nicht zu empfehlen. Mehrere Antikörper, wie TH und GFAP arbeitete besonders gut für die Ganzhirnimmunmarkierung 14. Auf der anderen Seite können einige Antikörper, wie TuJ1 oder Map2, oft nur die Oberfläche der Gewebe gekennzeichnet. Dies kann durch andere Verfahren verbessert werden, wie beispielsweise Schalter 15. Eine weitere potenzielle Einschränkung ist, dass es schwierig sein könnte, feine Proteinstrukturen in ACT-verarbeitete Gewebe zu erhalten, weil das Gewebe Schwellung und Schrumpfung während des Gewebe-Löschschritt. Presto-Technik ist auf eine breite Vielfalt von Gewebemarkierungstechniken. Beispielsweise in gewebe transparent Methoden vormarkiert Gewebe, wie SeeDB 4 und iDISCO 7, Immunmarkierung von dichtem Gewebe erfordert Inkubationszeiten länger als mehrere Tage bis Wochen. Allerdings PRESTO kann die Inkubationszeit bis zu mehreren Stunden zu verkürzen, enabling die Fertigstellung des gesamten Prozesses innerhalb eines Tages mit 1 mm dicken dichten Gewebe. PRESTO kann die Wirksamkeit von tief Kennzeichnung dicken, dichten Gewebe oder sogar un-geklärt dicke Gewebe verbessern. Weil PRESTO eine Tischzentrifuge oder Spritzenpumpe verwendet und erfordert keine spezielle Ausrüstung, ist es relativ einfach, diese Technik mit Routinelaborverfahren zu implementieren.

Eine der Herausforderungen in den Neurowissenschaften ist die Visualisierung der neuronalen Verdrahtung und einzelne Zellen innerhalb intakten Hirngewebe. Bis vor kurzem demonstriert die Verbindungen zwischen den Neuronen auf diese Weise erforderlich 1) Serienschnitt von Geweben; 2) molekulare Kennzeichnung spezifischer Ziele, wie Axone oder Proteine; und 3) die Visualisierung von 3D - Rekonstruktion des gesamten Gehirns über Rechen Registrierung oder Ausrichtung von 2D - Serienbilder 1. Diese Schritte sind mühsam, erfordert viel Zeit und haften Informationen zu verlieren, während des Schneidens und Kennzeichnung, so dass neuronale Netzwerk-Mapping äußerst schwierig. viele Methoden jedoch, dass für die Visualisierung von intaktem Gewebe ohne Schnitte erlauben entwickelt worden. Biologische Gewebe können durch Gewebe-Clearing - Techniken 2-10 optisch transparent gemacht werden. Eine der wichtigsten Methoden der Brechungsindexunterschiede zwischen dem intakten Gewebe und der Eintauchlösung zu reduzieren, umLichtstreuung im intakten Gewebe zu reduzieren, wodurch das Gewebe transparent zu machen und ermöglicht die Beobachtung von tiefen Strukturen. Einige Arten von Eintauchlösungen hydrophobe Eigenschaften aufweisen, die während des Entwässerungsverfahrens in schnellen Fluoreszenzlöschung führen. Daher sind diese Verfahren nicht mit Fluoreszenzabbildung über einen langen Zeitraum 11,12 kompatibel. Anstelle von hydrophoben Reagenzien verwenden , um andere Methoden hydrophile Reagenzien zur Gewebe Clearing-, wie SeeDB 4 und Sca l e 6, das die Strukturinformation und Fluoreszenz des biologischen Gewebes 4,6,8 aufrechtzuerhalten. Allerdings Makromoleküle, einschließlich Antikörper, kann nicht den Kern des intakten Gewebes durch Diffusion allein erreichen. Daher ist die vorge Markierung von Zielmolekülen in tiefen Bereichen dicht gepackte Gewebe technisch anspruchsvoll. In einem kürzlich entwickelten Gewebe-Clearing - Verfahren, CLARITY 3, ein Hydrogel eingebettet biologisches Gewebe iS mit Acrylamid gebildet und Lipiden durch Elektrophorese unter Natriumdodecylsulfat (SDS) -haltigen Lösung entfernt werden. Die Probe wird dann in einer Lösung mit einem passenden Brechungsindex Licht 3 Streuung reduzieren getaucht. Die Lipidentfernungssystem wurde später in fortgeschrittenen CLARITY 13 und PACT (passive Klarheit Technik) 10 modifiziert. Nach der Polymerisation vernetzen acrylamid Ketten mit Proteinen, hydrogel-bildenden Gewebe. Lipidkomponenten mit Acrylamid nicht vernetzen können; Somit Lipide können durch Elektrophorese unter dem SDS-enthaltenden Puffer eliminiert werden. Durch die aktive Eliminierung von Lipiden, Hirngewebe deutlich erhöht Transparenz 9. Allerdings sind diese Methoden nicht die Unmöglichkeit, tief Kennzeichnung durch freie Diffusion adressieren. Um diese Einschränkung zu, Techniken für den aktiven Transport von Reagenzien in die tiefsten Teile der dicken Gewebe zu überwinden sind erforderlich. Obwohl ermöglicht CLARITY Gewebe Clearing- und TiefengewebsmassageVisualisierung, es ist keine einfache oder schnelle Prozedur. Es kann mehrere Wochen dauern , eine ganze Mäusegehirn 7,14 zu löschen. Schnelle Abwicklung von Gewebe ist wesentlich für die Anwendung solcher Methoden auf der Grundlagen- oder klinischen Labor-Einstellungen für Life-Science-Forschung oder Volumen Diagnose. Das aktuelle Protokoll sieht ein vereinfachtes Verfahren zur biologischen Gewebe Freigabe und nachfolgende Proteinnachweis durch druckunterstützten Lieferung Immunfärbung. Es ist geeignet für hochauflösende Abbildungsvolumen großer abgelegt und 3D-Datenverarbeitungssysteme durch Kombination mit bildgebenden Verfahren.

<table><tbody><tr><td>4% Paraformaldehyde</td><td>Lugen SCI&amp;nbsp;</td><td>LGB-1175-4B</td><td>sample fixation&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Affymetrix</td><td>75820</td><td>Hydrogel monomer solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>2,2&amp;rsquo;-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl) propane] dihydrochloride</td><td>Wako Pure Chemical Industries&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>VA-044</td><td>Hydrogel monomer solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>Affymetrix</td><td>76324</td><td>ETC buffer</td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>Affymetrix</td><td>18220</td><td>ETC buffer</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide pellets</td><td>Junsei chemical</td><td>1310-73-2</td><td>ETC buffer</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2323A</td><td>Immunolabeling</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Immunolabeling</td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>Immunolabeling</td></tr><tr><td>Tyrosine hydroxylase (TH)</td><td>Millipore</td><td>AB152</td><td>Antibody/immunolabeling</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Cy3 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-165-152</td><td>Secondary antibody/ immunolabeling</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Life Technologies - Molecular Probes</td><td>A21206</td><td>Secondary antibody/ immunolabeling</td></tr><tr><td>Confocal dish</td><td>SPL lifesciences</td><td>101350</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Leica</td><td>SP8</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Junsei chemical</td><td>31365-0301</td><td>CUBIC-mount solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Affymetrix</td><td>23036</td><td>CUBIC-mount solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N,N&amp;rsquo;,N&amp;rsquo;&lt;/em&gt;-tetrakis(2-hydroxypropyl)ethylenediamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>122262</td><td>CUBIC-mount solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ECT chamber</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C10101</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>ECT chamber controller</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C10201</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>Temperature probe</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C12101</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>Peristatic pump</td><td>Baoding longer precision pump Co., Ltd</td><td>YZ1515X</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>Buffer reservoir</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C10401</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>Tissue container&amp;nbsp;</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C12001</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>Container holder for 1 tissue container</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C12002</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>Mouse brain slice holder</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C12004</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>Whole rat brain holder</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C12007</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>Peristaltic pump tubing</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C12104</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>Tabletop-centrifuge</td><td>Hanil science industrial Co., Ltd</td><td>MICRO 12</td><td>c-PRESTO</td></tr><tr><td>Syringe pump</td><td>Baoding longer precision pump Co., Ltd</td><td>LSP02-1B</td><td>s-PRESTO</td></tr><tr><td>Syringe (30 mL)</td><td>Korea vaccine Co., Ltd.</td><td>KV-S30</td><td>s-PRESTO</td></tr><tr><td>3-way stopcock</td><td>Hyupsung medical Co.,Ltd.</td><td>HS-T-01N</td><td>s-PRESTO</td></tr></tbody></table>

act-presto: biological tissue clearing and immunolabeling methods for volume imaging

Die Identifizierung und Erforschung der detaillierten Organisation von Organen oder des ganzen Körpers auf zellulärer Ebene sind grundlegende Herausforderungen in der Biologie. Übergangsverfahren erfordern eine erhebliche Menge an Zeit und Mühe, ein 3D-Bild zu erhalten, und das intakte Gewebe, einschließlich Schneiden, Immunmarkierung, und Abbildungs ​​seriell geschnittene Gewebe, die bei jedem Schritt des Prozesses einen Informationsverlust erzeugt. In jüngster Zeit entwickelten Ansätze für hochauflösende Bildgebung in intaktem Gewebe, molekulare Charakterisierung wurde auf die Markierung von Proteinen beschränkt. Doch derzeit verfügbaren Protokolle für Orgel Clearing erfordern eine beträchtlich lange Prozesszeit, wodurch es schwierig Gewebe Clearing-Techniken im Labor zu implementieren. Wir stellten kürzlich eine schnelle und hoch reproduzierbare Protokoll bezeichnet ACT-PRESTO (a ctive c nungsmäßigkeit t echnique- p ruck r beschwingt e ffizient und s Tabelle t ransfervon Makromolekülen in o rgans), die für die Gewebezwischenraum innerhalb mehrerer Stunden ermöglicht. Darüber hinaus ermöglicht ACT-PRESTO schnelle Immunmarkierung mit konventionellen Methoden und beschleunigt Antikörper das Eindringen in die tiefe Schicht aus dicht gebildeten, dicken Proben durch Druck oder Konvektionsströmung Anwendung. Wir beschreiben, wie Gewebe herzustellen, wie durch Lipidentfernung zu löschen Elektrophorese und wie-Fleck Immuno durch einen druckunterstützten Lieferung. Die Schnelligkeit und Konsistenz des Protokolls wird die Leistung von 3D-histologischen Forschung und volumenbasierte Diagnosen beschleunigen.

ACT-Gewebe Clearing Ein wichtiger Faktor Gewebe Clearing beeinflusst, ist Gewebefixierung. PFA Fixierung und Acrylamid Infusion sind separate Schritte in diesem Protokoll. Nach dem gewebe Hydrogel Polymerisationsschritt wird die freie A4P0 Lösung nicht polymerisiert, obwohl gewebe infundiert Hydrogele vernetzte mit endogenen Makromoleküle sind. Kein Gel sollte außerhalb des Gewebes (2A) bilden daher. Die ACT-Verfahren führt zu einer geringeren Vernetzung zwischen Proteinen und Acrylamid zu der CLARITY-Protokoll verglichen. Dementsprechend ist das gewebe Hydrogelprobe poröser. Diese Funktion ermöglicht die schnelle Extraktion von Lipiden und die Diffusion von Makromolekülen. Abschnitte des Mausgehirn 1- bis 2-mm Dicke wurden innerhalb von 1 ausreichend gelöscht - 2 h (2B), und 5 - 6 h der ETC war ausreichend für clearance ganzer Mäusehirnen (Abbildung 2C). Hydrogel-vermittelte induzierte Gewebe Clearing die Expansion des Gewebes nach dem ETC-Schritt, aber das Gewebe wieder auf seine ursprüngliche Größe in Brechungsindex angepassten Lösung. Das Gewebe-Hydrogelprobe in dem ACT Verfahren gebildet ist hochporös und somit kleinen Verbindungen und Makromoleküle konnten eindringen effizient und leicht diffundieren (Abbildung 3). Nach einer 2-stündigen Inkubation von 1-mm Hirnschnitten mit Tyrosin - Hydroxylase (TH) und Typ IV - Antikörper Collagen, ein anschließender 2-stündiger Inkubation mit einem sekundären Antikörper ausreichend war , dopaminergen Neuronen in einem 500 &amp; mgr; m Tiefe (Figur 3) zu etikettieren . PRESTO-Gewebe Immunmarkierung Dense Organe haben im allgemeinen hohe Konzentrationen an ECM-Fasern, die das Eindringen von Antikörpern in das Gewebe wirkt. So Antikörper PENETbis zu einer Tiefe von nur 20-30 &amp; mgr; m in dichtem Gewebe, wie Nierengewebe, nach 12 Stunden Inkubation bewertet. Um diese Einschränkung zu überwinden, entwarfen wir aktive Makromolekül Penetration Methoden, die die Lieferung von Reagenzien in tiefe Gewebe zu ermöglichen, nämlich PRESTO (druckabhängig effiziente und stabile Übertragung von Makromolekülen in die Organe) (Abbildung 4). Im Vergleich zur statischen Inkubation von ACT-processed Nierengewebe mit Antikörperlösungen, die Anwendung von Zentrifugalkräften (600 · g) mit einer Tischzentrifuge (Schleuder PRESTO, c-PRESTO) stark verbessert Antikörper Lieferung in tiefe Gewebe (Abbildung 5). Wenn wir die c-PRESTO Verfahren zu dichten Gewebe aufgetragen, 3 h Inkubation ausreichend war, 250- bis 300 &amp; mgr; m tiefen Strukturen zu beschriften. Um die Gewebeverzerrung ohne signifikante Gewebeschäden zu verbessern, die wir entworfen auch eine Maschine, die Konvektionsströmung mit einer Spritzenpumpe (Spritze PRESTO, s-PRESTO) zur Verfügung stellt. Dieser Prozess ähnlich Antikörper pe verbessertnetration Vergleich zu passiven Diffusion (Abbildung 5). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig1.jpg" /> Figure 1. Herstellung des s-PRESTO Vorrichtung. A. Eine Spritze (30 ml) und Dreiwegehahn. B. Der Dreiwegehahn verbunden und mit der Spritze aufgeklebt. C. Die Spritze , die die Probe und Antikörperlösung enthält, und die Spritze auf der Spritzenpumpe gegeben. D. Die Spritzenpumpe und Arbeitsbedingung - Setup. E. Die Pumpe flößt eine Lösung , die die Markierungsreagenzien in die Probe enthält. Wenn das bezeichnete Volumen erreicht ist, zieht sich die Pumprichtung ändert und die Lösung nach einer bestimmten Zeitspanne. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Abbildung 2. ACT Gewebe Clearing von Gehirn der Maus. A. Nach der Polymerisation werden freie A4P0 Lösungen nicht polymerisiert werden ; Gewebe infundiert Hydrogele werden durch Vernetzung mit endogenen Makromoleküle geliert. B. 1- bis 2 mm dicke Gehirnschnitte wurden für 1 gelöscht - 2 h, und das Ausmaß der Expansion und Größe Erholung Reflexionsindex (RI) Zusammenpassender Lösung wurden aufgezeichnet. C. Die Dicke der gesamten Gehirn der Maus beträgt etwa 0,8 cm und 5 - 6 h der ETC ausreichend wurde zum Gehirn vollständig klar. Nach 3 h von ETC gab es eine erhebliche Menge an nicht geräumten Gewebe. Mit 6 h von ETC hatte jedoch das Löschen des gesamten Gehirns auftrat. Die Farbe des Gewebes nach ACT in dem ETC-Puffer ist weiß oder undurchsichtig. Durch RI Einstellung, werden Gewebe transparent. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken sie</a>e eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig3.jpg" /> Abbildung 3. Immunmarkierung mit ACT-gelöscht Maus Gehirngewebe. Bilder von ACT-processed 1-mm Maushirnschnitten der Maus Hirnrinde mit einem Antikörper gegen Kollagen Typ IV und ein Teil des Mittelhirns mit einem Antikörper gefärbt gefärbten zeigt, auf Tyrosinhydroxylase (TH). Maßstabsbalken, 100 &amp; mgr; m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig4.jpg" /> Abbildung 4. PRESTO Immunmarkierungsmethoden. Antikörper können nicht in dichtem Gewebe durch Diffusion eindringen. PRESTO Immunomarkierung Methoden wurden entwickelt, um aktiv Makromoleküle ziehen lassen und Reagenzien zu liefern indichte Gewebe. Die Anwendung von Zentrifugalkräften eine Standard-Tischzentrifuge (Schleuder PRESTO, c-PRESTO) unter Verwendung erleichtert deutlich die Lieferung von Antikörpern. Appling Konvektionsströmung mit einer Spritzenpumpe (Spritze PRESTO, s-PRESTO) verbesserte Antikörper Penetration. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig5.jpg" /> Abbildung 5. PRESTO Immunmarkierung von ACT-gelöscht dichtem Gewebe. Für c-PRESTO wurden die Gewebe bei 600 × g für 3 Stunden zentrifugiert, um eine Standard-Tischzentrifuge, um das Eindringen von primären und sekundären Antikörpern zu beschleunigen. Für s-PRESTO wurde eine Spritzenpumpe verwendet, um die Antikörper zu liefern. Maus-Organen, wie Niere und Leber wurden mit Kollagen Typ IV bezeichnet. Im Vergleich zu herkömmlichen Methoden, 3 hc- oder s-PRESTO verbessert deutlich die Kennzeichnung Tiefe. In der Niere und Leber, erreicht die Tiefe der Z-Achse von 300 bis 350 um oder tiefer in PRESTO Proben (rechts), während die Kontrollproben in einer Tiefe von nur 40 - gekennzeichnet sind, 50 &amp; mgr; m (links). Ein 3D-rekonstruierte Bild wurde mit einem konfokalen Mikroskop erhalten. Maßstabsbalken, 100 &amp; mgr; m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging

ACT-PRESTO (aktiv Klarheit Technik druckabhängig effiziente und stabile Übertragung von Makromolekülen in Organe) ermöglicht eine schnelle, effiziente, aber kostengünstige Gewebe Clearing- und schnelle Antikörper das Eindringen in Gewebe gelöscht durch passive Diffusion oder druckunterstützten Lieferung. Unter Verwendung dieses Verfahrens kann eine Vielzahl von Geweben durch multiple Antikörper gelöscht, immunmarkiert werden und volumen abgebildet.

ACT-PRESTO: Biologische Gewebe Clearing und Immunmarkierung Methoden für Volume Imaging

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in ...

act-presto-biological-tissue-clearing-immunolabeling-methods-for

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

12.0K Aufrufe.  Korea University College of Medicine.  ACT-PRESTO (aktiv Klarheit Technik druckabhängig effiziente und stabile Übertragung von Makromolekülen in Organe) ermöglicht eine schnelle, effiziente, aber kostengünstige Gewebe Clearing- und schnelle Antikörper das Eindringen in Gewebe gelöscht durch passive Diffusion oder druckunterstützten Lieferung. Unter Verwendung dieses Verfahrens kann eine Vielzahl von Geweben durch multiple Antikörper gelöscht, immunmarkiert werden und volumen abgebildet. 

Serie: ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that makes up much of the parenchyma of the human placenta. The distal villous capillary network is the terminus of the fetal blood supply after several generations of branching of vessels extending out from the umbilical cord. This network has a contiguous cellular sheath, the syncytial trophoblast barrier layer, which prevents mixing of fetal blood and the maternal blood in which it is continuously bathed. Insults to the integrity of the placental capillary network, occurring in disorders such as maternal diabetes, hypertension and obesity, have consequences that present serious health risks for the fetus, infant, and adult. To better define the structural effects of these insults, a protocol was developed for this study that captures capillary network structure on the order of 1 - 2 mm3 wherein one can investigate its topological features in its full complexity. To accomplish this, clusters of terminal villi from placenta are dissected, and the trophoblast layer and the capillary endothelia are immunolabeled. These samples are then clarified with a new tissue clearing process which makes it possible to acquire confocal image stacks to z- depths of ~1 mm. The three-dimensional renderings of these stacks are then processed and analyzed to generate basic capillary network measures such as volume, number of capillary branches, and capillary branch end points, as validation of the suitability of this approach for capillary network characterization.

This study presents a protocol for the reversible tissue clearing, immunostaining, 3D-rendering and analysis of vascular networks in human placenta villi samples on the order of 1 - 2 mm3.

Dreidimensionale Darstellung und Analyse der Immunolabeled, geklärt menschlichen Plazenta Zotten vaskulärer Netzwerke

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Imaging Cleared Intact Biological Systems at a Cellular Level by 3DISCO

Tissue clearing and subsequent imaging of transparent organs is a powerful method to analyze fluorescently labeled cells and molecules in 3D, in intact organs. Unlike traditional histological methods, where the tissue of interest is sectioned for fluorescent imaging, 3D imaging of cleared tissue allows examination of labeled cells and molecules in the entire specimen. To this end, optically opaque tissues should be rendered transparent by matching the refractory indices throughout the tissue. Subsequently, the tissue can be imaged at once using laser-scanning microscopes to obtain a complete high-resolution 3D image of the specimen. A growing list of tissue clearing protocols including 3DISCO, CLARITY, Sca/e, ClearT2, and SeeDB provide new ways for researchers to image their tissue of interest as a whole. Among them, 3DISCO is a highly reproducible and straightforward method, which can clear different types of tissues and can be utilized with various microscopy techniques. This protocol describes this straightforward procedure and presents its various applications. It also discusses the limitations and possible difficulties and how to overcome them.

To obtain high-resolution images of fluorescently labeled cells within large tissues, ideally, the biological samples should be imaged without sectioning. 3DISCO is a straightforward tissue clearing procedure based on sequential incubation with organic solvents. Upon clearing, the organs become transparent allowing an end-to-end laser scan of the specimen.

Imaging Geräumte Intact Biological Systems auf zellulärer Ebene durch 3DISCO

Tissue clearing and subsequent imaging of transparent organs is a powerful method to analyze fluorescently labeled cells and molecules in 3D, in intact ...

Neurowissenschaften

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and study the distribution, tropism, and abundance of pathogens inside of organ tissues provides pivotal data on disease development and progression. Using conventional microscopy methods, immunolabeling is mostly restricted to thin sections obtained from paraffin-embedded or frozen samples. However, the limited 2D image plane of these thin sections may lead to the loss of crucial information on the complex structure of an infected organ and the cellular context of the infection. Modern multicolor, immunostaining-compatible tissue clearing techniques now provide a relatively fast and inexpensive way to study high-volume 3D image stacks of virus-infected organ tissue. By exposing the tissue to organic solvents, it becomes optically transparent. This matches the sample&#8217;s refractive indices and eventually leads to a significant reduction of light scattering. Thus, in combination with long free working distance objectives, large tissue sections up to 1 mm in size can be imaged by conventional confocal laser scanning microscopy (CLSM) at high resolution. Here, we describe a protocol to apply deep-tissue imaging after tissue clearing to visualize rabies virus distribution in infected brains in order to study topics like virus pathogenesis, spread, tropism, and neuroinvasion.

Novel, immunostaining-compatible tissue clearing techniques like the ultimate 3D imaging of solvent-cleared organs allow the 3D visualization of rabies virus brain infection and its complex cellular environment. Thick, antibody-labeled brain tissue slices are made optically transparent to increase imaging depth and to enable 3D analysis by confocal laser scanning microscopy.

Hochauflösende 3D-Bildgebung der Tollwut-Virusinfektion im lösungsmittelfreien Hirngewebe

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...

Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) imaging. They have received great attention in all research areas for the potential to analyze microscopic multicellular structures that extend over macroscopic distances. Given that kidney tubules, vasculature, nerves, and glomeruli extend in many directions, which have been only partially captured by traditional two-dimensional techniques so far, tissue clearing also opened up many new areas of kidney research. The list of optical clearing methods is rapidly growing, but it remains difficult for beginners in this field to choose the best method for a given research question. Provided here is a simple method that combines antibody labeling of thick mouse kidney slices; optical clearing with cheap, non-toxic and ready-to-use chemical ethyl cinnamate; and confocal imaging. This protocol describes how to perfuse kidneys and use an antigen-retrieval step to increase antibody- binding without requiring specialized equipment. Its application is presented in imaging different multicellular structures within the kidney, and how to troubleshoot poor antibody penetration into tissue is addressed. We also discuss the potential difficulties of imaging endogenous fluorophores and acquiring very large samples and how to overcome them. This simple protocol provides an easy-to-setup and comprehensive tool to study tissue in three dimensions.

The combination of antibody labeling, optical clearing, and advanced light microscopy allows three-dimensional analysis of complete structures or organs. Described here is a simple method to combine immunolabeling of thick kidney slices, optical clearing with ethyl cinnamate, and confocal imaging that enables visualization and quantification of three-dimensional kidney structures.

Optische Seimierung und Bildgebung von immunomarkiertem Nierengewebe

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) ...

Medizin

Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining and imaging of thick brain samples. However, this advanced technology has not yet been used for whole-mount retinas. Although the retina is partially transparent, its thickness of approximately 200 &#181;m (in mice) still limits the penetration of antibodies into the deep tissue as well as reducing light penetration for high-resolution imaging. Here, we adapted the CLARITY method for whole-mount mouse retinas by polymerizing them with an acrylamide monomer to form a nanoporous hydrogel and then clearing them in sodium dodecyl sulfate to minimize protein loss and avoid tissue damage. CLARITY-processed retinas were immunostained with antibodies for retinal neurons, glial cells, and synaptic proteins, mounted in a refractive index matching solution, and imaged. Our data demonstrate that CLARITY&#160;can improve the quality of standard immunohistochemical staining and imaging for retinal neurons and glial cells in whole-mount preparation. For instance, 3D resolution of fine axon-like and dendritic structures of dopaminergic amacrine cells were much improved by CLARITY. Compared to non-processed whole-mount retinas, CLARITY can reveal immunostaining for synaptic proteins such as postsynaptic density protein 95. Our results show that CLARITY renders the retina more optically transparent after the removal of lipids and preserves fine structures of retinal neurons and their proteins, which can be routinely used for obtaining high-resolution imaging of retinal neurons and their subcellular structures in whole-mount preparation.

Here we present a protocol to adapt the CLARITY method of the brain tissues for whole-mount retinas to improve the quality of standard immunohistochemical staining and high-resolution imaging of retinal neurons and their subcellular structures.

Immunfärbung von Whole-Mount-Netzhäuten mit der CLARITY Tissue Clearing Methode

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining ...

Imaging and Quantification of Intact Neuronal Dendrites via CLARITY Tissue Clearing

Brain activity, the electrochemical signals passed between neurons, is determined by the connectivity patterns of neuronal networks, and from the morphology of processes and substructures within these neurons. As such, much of what is known about brain function has arisen alongside developments in imaging technologies that allow further insight into how neurons are organized and connected in the brain. Improvements in tissue clearing have allowed for high-resolution imaging of thick brain slices, facilitating morphological reconstruction and analyses of neuronal substructures, such as dendritic arbors and spines. In tandem, advances in image processing software provide methods of quickly analyzing large imaging datasets. This work presents a relatively rapid method of processing, visualizing, and analyzing thick slices of labeled neural tissue at high-resolution using CLARITY tissue clearing, confocal microscopy, and image analysis. This protocol will facilitate efforts toward understanding the connectivity patterns and neuronal morphologies that characterize healthy brains, and the changes in these characteristics that arise in diseased brain states.

Neuronal dendritic morphology often underlies function. Indeed, many disease processes that affect the development of neurons manifest with a morphological phenotype. This protocol describes a simple and powerful method for analyzing intact dendritic arbors and their associated spines.

Bildgebung und Quantifizierung intakter neuronaler Dendriten mittels CLARITY Tissue Clearing

Brain activity, the electrochemical signals passed between neurons, is determined by the connectivity patterns of neuronal networks, and from the ...

A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging from neural circuits to subcellular neuronal structures are visualized in mouse brain slices optically cleared with ScaleSF. This clearing method is a modified version of ScaleS and is a hydrophilic tissue clearing method for tissue slices that achieves potent clearing capability as well as a high-level of preservation of fluorescence signals and structural integrity. A customizable three dimensional (3D)-printed imaging chamber is designed for reliable mounting of cleared brain tissues. Mouse brains injected with an adeno-associated virus vector carrying enhanced green fluorescent protein gene were fixed with 4% paraformaldehyde and cut into slices of 1-mm thickness with a vibrating tissue slicer. The brain slices were cleared by following the clearing protocol, which include sequential incubations in three solutions, namely, ScaleS0 solution, phosphate buffer saline (&#8211;), and ScaleS4 solution, for a total of 10.5&#8211;14.5 h. The cleared brain slices were mounted on the imaging chamber and embedded in 1.5% agarose gel dissolved in ScaleS4D25(0) solution. The 3D image acquisition of the slices was carried out using a confocal laser scanning microscope equipped with a multi-immersion objective lens of a long working distance. Beginning with mesoscopic neuronal imaging, we succeeded in visualizing fine subcellular neuronal structures, such as dendritic spines and axonal boutons, in the optically cleared brain slices. This protocol would facilitate understanding of neuronal structures from circuit to subcellular component scales.

The protocol provides a detailed method of neuronal imaging in brain slice using a tissue clearing method, ScaleSF. The protocol includes brain tissue preparation, tissue clarification, handling of cleared slices and confocal laser scanning microscopy imaging of neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels.

Eine Gewebereinigungsmethode für die neuronale Bildgebung von der mesoskopischen bis zur mikroskopischen Skala

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging ...

Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of structural changes caused by genetic or environmental perturbations. Whole-brain imaging results in more accurate quantification of cells and the study of region-specific differences that may be missed with commonly used microscopy of physically sectioned tissue. Using light-sheet microscopy to image cleared brains greatly increases acquisition speed as compared to confocal microscopy. Although these images produce very large amounts of brain structural data, most computational tools that perform feature quantification in images of cleared tissue are limited to counting sparse cell populations, rather than all nuclei.
Here, we demonstrate NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), a group of analysis tools, to quantify all nuclei and nuclear markers within annotated regions of a postnatal day 4 (P4) mouse brain after clearing and imaging on a light-sheet microscope. We describe magnetic resonance imaging (MRI) to measure brain volume prior to shrinkage caused by tissue clearing dehydration steps, tissue clearing using the iDISCO+ method, including immunolabeling, followed by light-sheet microscopy using a commercially available platform to image mouse brains at cellular resolution. We then demonstrate this image analysis pipeline using NuMorph, which is used to correct intensity differences, stitch image tiles, align multiple channels, count nuclei, and annotate brain regions through registration to publicly available atlases.
We designed this approach using publicly available protocols and software, allowing any researcher with the necessary microscope and computational resources to perform these techniques. These tissue clearing, imaging, and computational tools allow measurement and quantification of the three-dimensional (3D) organization of cell-types in the cortex and should be widely applicable to any wild-type/knockout mouse study design.

This protocol describes methods for conducting magnetic resonance imaging, clearing, and immunolabeling of intact mouse brains using iDISCO+, followed by a detailed description of imaging using light-sheet microscopy, and downstream analyses using NuMorph.

Ganzhirn-Einzelzellbildgebung und Analyse intakter neonataler Mausgehirne mittels MRT, Gewebereinigung und Lichtblattmikroskopie

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of ...

Hochauflösende 3D-Rekonstruktion des menschlichen Gehirns mit SHORT und LSFM

Optical Clearing and Labeling for Light-sheet Fluorescence Microscopy in Large-scale Human Brain Imaging

Despite the numerous clearing techniques that emerged in the last decade, processing postmortem human brains remains a challenging task due to its dimensions and complexity, which make imaging with micrometer resolution particularly difficult. This paper presents a protocol to perform the reconstruction of volumetric portions of the human brain by simultaneously processing tens of sections with the SHORT (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) tissue transformation protocol, which enables clearing, labeling, and sequential imaging of the samples with light-sheet fluorescence microscopy (LSFM). SHORT provides rapid tissue clearing and homogeneous multi-labeling of thick slices with several neuronal markers, enabling the identification of different neuronal subpopulations in both white and grey matter. After clearing, the slices are imaged via LSFM with micrometer resolution and in multiple channels simultaneously for a rapid 3D reconstruction. By combining SHORT with LSFM analysis within a routinely high-throughput protocol, it is possible to obtain the 3D cytoarchitecture reconstruction of large volumetric areas at high resolution in a short time, thus enabling comprehensive structural characterization of the human brain.

Autor im Rampenlicht: Fortschrittliche 3D-Zytoarchitekturanalyse - Schnelle volumetrische Rekonstruktion des menschlichen Gehirns 

The present protocol provides a step-by-step procedure for rapid and simultaneous optical clearing, muti-round labeling, and 3D volumetric reconstruction of tens of postmortem human brain sections by combining the (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) SHORT tissue transformation technique with light-sheet fluorescence microscopy imaging in a routinely high-throughput protocol.