This research was supported by the Brain Research Program through the National Research Foundation (NRF) funded by the Korean Ministry of Science, ICT, and Future Planning (NRF-2015M3C7A1028790).

Gli esperimenti sugli animali devono essere conformi a tutte le normative governative e istituzionali competenti. 1. Preparazione dei reagenti <ol><li> Per la soluzione di idrogel monomero (A4P0): Aggiungere 20 g di acrilamide per 450 ml di 0.1x PBS (PBS) e regolare il volume a 500 ml con 0.1x PBS. ATTENZIONE: monomeri Acrylamide sono tossici. Eseguire tutte le procedure in una cappa aspirante con dispositivi di protezione individuale, tra cui una visiera, un camice da laboratorio, guanti e scarpe chiuse. <ol><li> Immediatamente prima dell&#39;uso, aggiungere 100 mg di 2,2&#39;-azobis [2- (2-imidazolin-2-il) propano] dicloridrato di 40 mL di soluzione di idrogel monomero (A4P0) in una provetta da 50 ml sotto cappa aspirante . </li></ol></li><li> Per la compensazione tessuto elettroforetica tampone (ETC): Aggiungere 40 g di sodio dodecil solfato (SDS) e 12,37 g di acido borico a 800 mL di H 2 O deionizzata (dH 2 O). Regolare il pH a 8,5 con NaOH e regolare il volume di1 L con l&#39;aggiunta di dH 2 O. ATTENZIONE: SDS è una sostanza chimica nociva; Pertanto, maneggiarlo con cura. </li><li> Per la soluzione CUBIC montaggio: Aggiungere 250 g di saccarosio, 125 g di urea, e 125 g di N, N, N &#39;, N&#39; -tetrakis (2-idrossipropil) etilendiammina a 150 ml di dH 2 O e portare il volume a 500 ml con dH 2 O. </li></ol> 2. Preparazione del campione &amp; Fixation <ol><li> L&#39;eutanasia del mouse. <ol><li> Preparare la alfaxalone (1 mg / kg) e xilazina (0,5 mg / kg) nella stessa siringa. </li><li> Intraperitoneale iniettare la miscela di alfaxalone e xilazina e consentono 3 min per il mouse per perdere conoscenza. </li><li> Attendere fino a quando il mouse anestetizzato non risponde più agli stimoli dolorosi, come un pizzico di coda, prima di procedere. ATTENZIONE: Seguire appropriate linee guida istituzionali per la gestione degli animali. </li></ol></li><li> Transcardially profumato il mouse con 100 ml di NaCl allo 0,9% (pH 7,4-7,5) soluzionecontenente eparina (100 U / ml) per Exsanguinate, seguito da 100 mL di 4% paraformaldeide (PFA) in PBS 1x (pH 7,4) 14. ATTENZIONE: soluzione PFA è tossico. La preparazione della soluzione PFA e tutte le successive manipolazioni deve essere condotta in una cappa aspirante e con dispositivi di protezione individuale. </li><li> Tagliare la testa del mouse, aprire la pelle, e rompere il cranio tra gli occhi con piccole forbici. </li><li> Rimuovere pezzi del cranio con piccoli, pinze curve. </li><li> Estrarre il cervello o organi desiderati. </li><li> Incubare il cervello e gli organi in post-fix 4% soluzione PFA a 4 ° C durante la notte. NOTA: Per regione specifica compensazione dei tessuti, sezionare la regione specifica o tagliare il tessuto dopo la fissazione dei tessuti. ATTENZIONE: soluzione PFA è tossico. La perfusione transcardial e tutte le successive manipolazioni del mouse devono essere condotte in una cappa aspirante e con dispositivi di protezione individuale. </li></ol> 3. Hydrogel monomero infusione e Polymerization <ol><li> Incubare gli organi fissi in soluzione idrogel monomero A4P0 a 4 ° C per 12-24 ore con un leggero scuotimento. </li><li> Idrogel monomero-infuso polimerizzazione dei tessuti. <ol><li> Trasferire il campione in una provetta a fondo rotondo da 10 ml con 5 ml di soluzione di idrogel monomero. Avvolgere la parte superiore del tubo a fondo rotondo con parafilm. </li><li> Rimuovere l&#39;ossigeno dal tubo a fondo rotondo contenente tutta topo campione cervello idrogel infuso facendo gorgogliare azoto attraverso il liquido per 1 min. Rapidamente e chiudere ermeticamente la provetta contenente. </li></ol></li><li> Trasferire la provetta in un bagnomaria (37 ° C) per 2 ore. </li><li> Lavare il campione polimerizzato brevemente con 0.1x PBS per rimuovere l&#39;eccesso idrogel. ATTENZIONE: monomeri idrogel sono tossici. Per evitare il contatto della pelle con idrogel monomero, eseguire tutte le procedure in una cappa aspirante e con dispositivi di protezione individuale, tra cui una visiera, un camice da laboratorio e guanti. NOTA: polimerizzati tessutipossono essere memorizzati in 0.1x PBS contenente sodio azide per più di 2 settimane a 4 ° C. ATTENZIONE: sodio azide è altamente e tossicità acuta. Eseguire tutte le procedure in una cappa aspirante e con dispositivi di protezione individuale, tra cui una visiera, un camice da laboratorio e guanti. </li></ol> 4. elettroforetico tessuto Clearing (ETC) <ol><li> Trasferire il campione polimerizzato ad un contenitore di tessuto e posizionare il contenitore tessuto nella camera ETC. </li><li> Riempire la camera ETC ETC con il tampone usando pompa peristatic. </li><li> Impostare le condizioni di ETC ed eseguire il ETC. Utilizzare le seguenti impostazioni. <ol><li> Per le impostazioni ecc per organi interi, utilizzare le seguenti impostazioni: (1,5 amp), la temperatura (37 ° C), il tempo (6,0 h), la velocità della pompa (30 rpm) in esecuzione. </li><li> Per le impostazioni ecc per 1 a 2 mm di spessore fette di cervello del mouse, utilizzare le seguenti impostazioni: corrente (1,5 amp), la temperatura (37 ° C), il tempo (2,0 h), la velocità della pompa (30 rpm) in esecuzione. </li></ol></li><li> Trasferimento tsi schiarì campione ad un tubo conico da 50 ml con 45 ml di PBS 0.1x. Lavare più volte campione eliminato con 0.1x PBS fino a quando non si vedono bolle quando il tubo viene agitato brevemente (per confermare la rimozione completa del SDS). </li></ol> 5. immunomarcatura di tessuti ACT-lavorati <ol><li> Per topo intero cervello: incubare il campione in un volume di 3 ml di soluzione di anticorpo contenente PBS 1x, 6% di siero albumina bovina (BSA), 0,1% Triton X-100, e sodio azide 0,01% (Diluente anticorpo) con una diluizione fattore di 1/500 per tirosina idrossilasi (TH) anticorpo per 4 giorni a 37 ° C con agitazione delicata. Sostituire la soluzione di anticorpi a fine giornata 2. <ol><li> Lavare il campione in una provetta conica da 50 ml con 45 ml di PBS 0.1x per 3 - 5 h e modificare il buffer ogni ora. </li><li> Incubare il campione in un volume di 3 ml di soluzione di diluizione di anticorpo con un fattore di diluizione di 1/500 di asino anti-coniglio 488 anticorpo secondario per 4 giorni a 37 ° C con agitazione delicata. Replasso le soluzioni di anticorpi diluito su giorno 2. </li></ol></li><li> Per 1 a tessuto cerebrale a fette di spessore 2 mm: incubare il campione durante la notte o per un massimo di 1 giorno in una da 0,5 a 1 ml volume di soluzione di diluizione degli anticorpi con un fattore di diluizione di 1/500 di collagene di tipo IV anticorpo a 37 ° C con agitazione mite. <ol><li> Lavare il campione in una provetta conica da 15 ml con un volume di 12 mL di PBS 0.1x per 1-2 h. Modificare il buffer di ogni ora. </li><li> Incubare il campione in una da 0,5 a 1 mL di una soluzione di diluizione di anticorpo con un fattore di diluizione di 1/500 per Cy3-coniugato anti-coniglio anticorpo secondario durante la notte o fino a 1 giorno a 37 ° C con agitazione delicata. </li></ol></li><li> Lavare il campione in 0.1x PBS per 3-5 ore; modificare il buffer ogni ora. </li><li> Prima di imaging, incubare il campione in una quantità appropriata di soluzione cubi di montaggio per 1 ora a temperatura ambiente agitando delicatamente. Sostituire con soluzione fresca cubi di montaggio e incubare per un ulteriore 1 h. NOTA: </b&gt; 76 tipo di anticorpi ha funzionato bene nel topo tessuto ACT-Processing, tra cui 31 anticorpi monoclonali 14. Pre-marcato tessuto può essere combinato con il immunomarcatura di altri due fluorocromi nel tessuto ACT-trattati. </li></ol> 6. immunomarcatura di Dense tessuti (PRESTO) <ol><li> c-PRESTO NOTA: c-PRESTO è adatto per le piccole dimensioni dei campioni, come ad esempio tutta testicolo, tutto il rene, o piccole sezioni di organi più grandi. <ol><li> Trasferire il campione in una provetta da 1,5 mL, aggiungere 500 ml di soluzione di diluizione di anticorpo con un fattore di diluizione di 1/500 per anticorpi collagene di tipo IV e centrifugare la provetta a 600 g per 2 h. </li><li> Lavare il campione colorato con 0.1x PBS mediante centrifugazione a 600 g per 30 min. </li><li> Aggiungere 500 ml di soluzione di diluizione degli anticorpi con un fattore di diluizione di 1/500 per l&#39;anticorpo secondario anti-coniglio Cy3-coniugato e centrifugare a 600 g per 2 ore. </li><li> Lavare il campione colorato con 0.1x PBS mediante centrifugazione a 600 g per 30 min. </li></ol></li><li> s-PRESTO NOTA: s-PRESTO è adatto per i tessuti più grandi. <ol><li> Preparare una siringa (volume 30 ml) e collegarlo ad una valvola a 3 vie (Figura 1A). Colla la valvola con una pistola per colla per le condizioni di alta pressione (Figura 1B). </li><li> Trasferire il campione nella siringa a 3 vie valvola collegata in posizione di chiusura della valvola. </li><li> Aggiungere 5 - 7 mL di soluzione di diluizione anticorpo con un fattore di diluizione di 1/500 di collagene di tipo IV anticorpi. Rilasciare la soluzione di anticorpi nel campione aprendo la valvola. </li><li> Impostare il pistone della siringa alla posizione 17 mL per fornire spazio sufficiente per il movimento di infusione / ritiro. Questo può essere fatto in posizione di apertura della valvola. Chiudere la valvola a 3 vie dopo l&#39;impostazione della siringa è terminata. </li><li> Mettere la siringa contenente il campione in una pompa a siringa. Impostare le condizioni pompa siringa per un volume di soluzione / ritiro di 10 ml / min e un 4-min tempo di pausa in modalità ciclo continuo (Figura 1C). NOTA: La pompa infonde fino a raggiungere il volume bersaglio (10 mL), e quindi la direzione di flusso cambia dopo una breve pausa (4 min). </li><li> Far funzionare la pompa a siringa per 3 - 24 ore a temperatura ambiente (Figura 1F). </li><li> Aprire la valvola a 3 vie e sostituire la soluzione con 0.1x PBS. </li><li> Lavare il campione macchiato due volte con 0.1x PBS per 1 ora ogni volta usando la pompa a siringa. </li><li> Cambiare con la soluzione di diluizione di anticorpi contenente Cy3-coniugato anti-coniglio anticorpo secondario (fattore di diluizione di 1/500) e far funzionare la pompa a siringa per 3-24 ore. </li><li> Aprire la valvola a 3 vie e sostituire la soluzione con 0.1x PBS. </li></ol></li><li> Prima di imaging, incubare il campione macchiato in una quantità appropriata di soluzione cubi di montaggio per 1 ora a temperatura ambiente agitando delicatamente. Sostituire con soluzione fresca cubi di montaggio e incubare per un ulteriore 1 h. </li></ol> 7. IMaging <ol><li> Posizionare il tessuto etichettato in un piatto confocale e aggiungere CUBIC-mount soluzione fino a quando il tessuto è coperto. Collocare un coprioggetto sul tessuto. Utilizzare un microscopio confocale per l&#39;immagine del tessuto 14 sotto l&#39;obiettivo 10X. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Scadente fissaggio o immersione idrogel nei tessuti può causare la perdita di proteine ​​e la distorsione del tessuto durante il processo di compensazione del tessuto. L&#39;intero topo adulto cervello dovrebbe essere incubato in 4% paraformaldeide notte, seguito da immersione in un volume minimo di 20 mL di soluzione di monomero idrogel per 12 - 18 h agitando delicatamente. Per le grandi tessuti, tra cui i tessuti umani, come fettine di cervello e del midollo spinale, prolungato tempo immersi nella soluzione di idrogel monomero è necessaria. Il protocollo ACT è facilmente applicabile alla compensazione dei tessuti fissi, perché i passi di fissazione dei tessuti e infusione di polimero sono separati. Dopo compensazione dei tessuti, tessuti umani erano ben colorate con diversi anticorpi. Si noti che la tecnica ACT compensazione non è compatibile con fissativi alcool, quali etanolo e metanolo. La fase di polimerizzazione tessuto-idrogel è anche fondamentale per la produzione di tessuti di buona qualità a seguito del processo di compensazione. Perchéossigeno inibisce la polimerizzazione di acrilamide, dovrebbe essere rimosso mediante degasaggio della soluzione di tessuto contenente meno di un sistema di infusione di gas azoto. In alternativa, de-ossigenazione può essere eseguito utilizzando una camera a vuoto con un blocco di calore per 23 h. Il tasso di compensazione dipende da numerosi fattori, tra cui le dimensioni dell&#39;organo, il contenuto di lipidi o ECM proteine fibrose, la condizione di fissaggio, ecc maggior parte dei tessuti di topo adulto possono essere cancellati da ETC durante la notte. Tuttavia, vi è il rischio di inutile eccesso di compensazione e tumefazione dei tessuti; pertanto, le differenze nel tempo di compensazione sono di importante considerazione. condizioni del tessuto di sgombero dovrebbero essere empiricamente determinato. È importante sottolineare che il contenuto della ECM possono influenzare l&#39;aspetto del tessuto eliminato. Il colore dei tessuti rimane bianco o opaco, anche dopo l&#39;atto in buffer di ETC, perché ACT non cancella fibre proteiche dense. Tuttavia, quando questi organi sono stati immersi in soluzione corrispondenza RI, lay diventato trasparente. Il tasso di gonfiore tessuto sembra dipendere i contenuti ECM dei tessuti e organi molli, come il cervello, mostrano un maggior rapporto di rigonfiamento di organi densi. Perché aumento del tessuto gonfiore aiuterà la procedura di tessuti-clearing, ACT di routine utilizza distillato tampone a base di acqua nella maggior parte dei casi. In alcuni casi, quando gonfiore tessuto o deformità transitoria non è auspicabile, ad esempio negli embrioni, tampone contenente 0.1x PBS può essere applicato per immagini ad alta risoluzione. Va inoltre rilevato che elevate concentrazioni di sali nel buffer potrebbero causare il restringimento dei tessuti. Il metodo ACT può chiarire organi interi e anche tutto il corpo di un topo 14. Tuttavia, l&#39;imaging dei tessuti profondi del tessuto trasparente richiede microscopi e gli obiettivi speciali. Così, spessore tessuto cerebrale da 1 a 2 mm è più efficace per l&#39;imaging con un microscopio confocale convenzionale. Nelle nostre mani, rimozione dell&#39;etichettaanticorpi Ed da tessuti ACT-lavorati è anticorpo-dipendente, e non sono raccomandati giri di diversa etichettatura degli anticorpi. Diversi gli anticorpi, come TH e GFAP, ha lavorato particolarmente bene per tutto il cervello immunomarcatura 14. D&#39;altra parte, alcuni anticorpi, come TUJ1 o Map2, spesso etichettati solo la superficie dei tessuti. Questo potrebbe essere migliorata con altri metodi, come INTERRUTTORE 15. Un altro potenziale limitazione è che potrebbe essere difficile per conservare le strutture proteiche sottili nel tessuto ACT-trattati a causa del gonfiore dei tessuti e ritiro durante la fase di tessuto-compensazione. La tecnica PRESTO è applicabile ad un&#39;ampia varietà di tecniche tessuti etichettatura. Ad esempio, nei metodi di tessuto trasparente con tessuto pre-marcato, come SeeDB 4 e iDISCO 7, immunomarcatura di tessuto denso richiede periodi di incubazione più lunghi di diversi giorni o settimane. Tuttavia, PRESTO può abbreviare il tempo di incubazione a diverse ore, enabling il completamento dell&#39;intero processo entro un giorno con tessuto denso di spessore 1 mm. PRESTO può migliorare l&#39;efficacia di spessore profondo-etichettatura, i tessuti densi, o tessuti spessi anche non-eliminato. Poiché PRESTO utilizza una centrifuga da tavolo o pompa a siringa e non richiede particolari attrezzature, è relativamente facile da implementare questa tecnica con procedure di laboratorio di routine.

Una delle sfide nel campo delle neuroscienze è la visualizzazione di cablaggio del circuito neuronale e le cellule individuali all&#39;interno di tessuto cerebrale intatto. Fino a poco tempo, dimostrando le connessioni tra i neuroni in questo modo richiesto 1) sezionamento serie di tessuti; 2) l&#39;etichettatura molecolare di obiettivi specifici, come gli assoni o proteine; e 3) la visualizzazione per la ricostruzione 3D di tutto il cervello attraverso la registrazione di calcolo o l&#39;allineamento di immagini seriali 2D 1. Questi passaggi sono laboriosi, richiedono una grande quantità di tempo, e rischiano di perdere informazioni durante il sezionamento e l&#39;etichettatura, rendendo la mappatura della rete neuronale estremamente difficile. Tuttavia, sono stati sviluppati molti metodi che consentono la visualizzazione del tessuto intatto senza sezionamento. Tessuti biologici possono essere resi otticamente trasparente mediante tecniche tessuto sgombero 2-10. Uno dei principali metodi è quello di ridurre le differenze di indice di rifrazione tra il tessuto intatto e la soluzione di immersione in ordineper ridurre la dispersione della luce nel tessuto intatto, rendendo così il tessuto trasparente e consentire l&#39;osservazione delle strutture profonde. Alcuni tipi di soluzioni ad immersione hanno proprietà idrofobiche, che determinano quenching fluorescente veloce durante la procedura di disidratazione. Pertanto, tali metodi non sono compatibili con l&#39;imaging a fluorescenza per un lungo periodo di tempo 11,12. Invece di reagenti idrofobiche, altri metodi utilizzano reagenti idrofili per la compensazione dei tessuti, come ad esempio SeeDB 4 e Sca l e 6, che mantengono le informazioni strutturali e fluorescenza del 4,6,8 tessuto biologico. Tuttavia, macromolecole, compresi gli anticorpi, non possono raggiungere il nucleo di tessuto intatto sola diffusione. Pertanto, la pre-etichettatura delle molecole bersaglio in zone profonde dei tessuti densamente imballati è tecnicamente impegnativo. In un metodo tessuto-clearing recentemente sviluppato, CLARITY 3, a i tessuti biologici idrogel-embeddeds formate con acrilammide, e lipidi vengono rimossi mediante elettroforesi in sodio dodecil solfato (SDS) soluzione -contenenti. Il campione viene quindi immerso in una soluzione con un indice di riflessione di corrispondenza per ridurre la luce dispersione 3. Il sistema di rimozione dei lipidi è stato successivamente modificato in CHIAREZZA avanzate 13 e PACT (tecnica chiarezza passiva) 10. Dopo la polimerizzazione, catene di acrilammide reticolare con le proteine, formando idrogel-tessuto. componenti lipidici non può reticolare con acrilammide; pertanto, lipidi possono essere eliminati mediante elettroforesi in tampone SDS contenente. Attraverso l&#39;eliminazione attiva dei lipidi, tessuto cerebrale aumenta marcatamente in trasparenza 9. Tuttavia, questi metodi non affrontano l&#39;impossibilità di profonda etichettatura per diffusione libera. Per superare questa limitazione, sono necessarie tecniche di trasporto attivo di reagenti nelle parti più profonde dei tessuti spessi. Anche se CHIAREZZA permette compensazione dei tessuti e dei tessuti profondivisualizzazione, non è una procedura semplice e veloce. Si può richiedere diverse settimane per cancellare un intero 7,14 cervello di topo. compensazione rapida dei tessuti è essenziale per l&#39;applicazione di tali metodi per impostazioni di base o clinica di laboratorio per la ricerca delle scienze della vita o la diagnosi del volume. Il protocollo attuale prevede una procedura semplificata per la liquidazione tessuto biologico e l&#39;individuazione di proteine ​​successiva consegna da immuno-colorazione pressione assistita. È adatto per imaging volumetrico ad alta risoluzione di grandi depositato e 3D sistemi di elaborazione dei dati attraverso la combinazione con metodi di imaging.

<table><tbody><tr><td>4% Paraformaldehyde</td><td>Lugen SCI&amp;nbsp;</td><td>LGB-1175-4B</td><td>sample fixation&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Affymetrix</td><td>75820</td><td>Hydrogel monomer solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>2,2&amp;rsquo;-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl) propane] dihydrochloride</td><td>Wako Pure Chemical Industries&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>VA-044</td><td>Hydrogel monomer solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>Affymetrix</td><td>76324</td><td>ETC buffer</td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>Affymetrix</td><td>18220</td><td>ETC buffer</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide pellets</td><td>Junsei chemical</td><td>1310-73-2</td><td>ETC buffer</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2323A</td><td>Immunolabeling</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Immunolabeling</td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>Immunolabeling</td></tr><tr><td>Tyrosine hydroxylase (TH)</td><td>Millipore</td><td>AB152</td><td>Antibody/immunolabeling</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Cy3 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-165-152</td><td>Secondary antibody/ immunolabeling</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Life Technologies - Molecular Probes</td><td>A21206</td><td>Secondary antibody/ immunolabeling</td></tr><tr><td>Confocal dish</td><td>SPL lifesciences</td><td>101350</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Leica</td><td>SP8</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Junsei chemical</td><td>31365-0301</td><td>CUBIC-mount solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Affymetrix</td><td>23036</td><td>CUBIC-mount solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N,N&amp;rsquo;,N&amp;rsquo;&lt;/em&gt;-tetrakis(2-hydroxypropyl)ethylenediamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>122262</td><td>CUBIC-mount solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ECT chamber</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C10101</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>ECT chamber controller</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C10201</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>Temperature probe</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C12101</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>Peristatic pump</td><td>Baoding longer precision pump Co., Ltd</td><td>YZ1515X</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>Buffer reservoir</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C10401</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>Tissue container&amp;nbsp;</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C12001</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>Container holder for 1 tissue container</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C12002</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>Mouse brain slice holder</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C12004</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>Whole rat brain holder</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C12007</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>Peristaltic pump tubing</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C12104</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>Tabletop-centrifuge</td><td>Hanil science industrial Co., Ltd</td><td>MICRO 12</td><td>c-PRESTO</td></tr><tr><td>Syringe pump</td><td>Baoding longer precision pump Co., Ltd</td><td>LSP02-1B</td><td>s-PRESTO</td></tr><tr><td>Syringe (30 mL)</td><td>Korea vaccine Co., Ltd.</td><td>KV-S30</td><td>s-PRESTO</td></tr><tr><td>3-way stopcock</td><td>Hyupsung medical Co.,Ltd.</td><td>HS-T-01N</td><td>s-PRESTO</td></tr></tbody></table>

act-presto: biological tissue clearing and immunolabeling methods for volume imaging

L&#39;identificazione e l&#39;esplorazione della organizzazione dettagliata di organi o di tutto il corpo a livello cellulare sono sfide fondamentali in biologia. metodi transitorie richiedono una notevole quantità di tempo e sforzi per ottenere un&#39;immagine 3D e comprendente sezionare il tessuto intatto, immunomarcatura e imaging dei tessuti serialmente sezionata, che produce una perdita di informazioni in ogni fase del processo. Negli approcci di recente sviluppo per l&#39;imaging ad alta risoluzione all&#39;interno del tessuto intatto, la caratterizzazione molecolare è stato limitato l&#39;etichettatura delle proteine. Tuttavia, i protocolli attualmente disponibili per la compensazione organo richiedono un tempo considerevolmente lungo processo, il che rende difficile implementare tecniche di tessuti di compensazione in laboratorio. Recentemente abbiamo stabilito un protocollo rapida e altamente riproducibili chiamato ACT-PRESTO (un ctive c rità t echnique- p ressione r euforico e sere sufficienti e tavolo s t rasferimentodi macromolecole in o rgans), che consente di attestazione tessuto entro alcune ore. Inoltre, ACT-PRESTO consente un rapido immunomarcatura con metodi convenzionali e accelera la penetrazione degli anticorpi nel profondo strato di densamente-formate, i campioni di spessore applicando una pressione o convezione flusso. Descriviamo come preparare i tessuti, come cancellare dalla rimozione dei lipidi mediante elettroforesi, e come immuno-macchia per una consegna a pressione assistita. La rapidità e la coerenza del protocollo sarà accelerare il compimento di ricerche istologiche 3D e diagnosi in base al volume.

Clearing ACT-tessuto Un fattore importante che influenza compensazione dei tessuti è la fissazione dei tessuti. PFA fissazione e infusione di acrilamide sono fasi distinte in questo protocollo. Dopo la fase di polimerizzazione dei tessuti-idrogel, la soluzione A4P0 libero non è polimerizzato, sebbene idrogel di tessuto-infuso sono reticolato con macromolecole endogene. Pertanto, nessun gel deve formare all&#39;esterno del tessuto (Figura 2A). I risultati della procedura di ACT a meno cross-linking tra proteine ​​e acrilamide rispetto al protocollo di chiarezza. Di conseguenza, il campione di tessuto-idrogel è più poroso. Questa caratteristica consente l&#39;estrazione rapida di lipidi e la diffusione di macromolecole. Le sezioni di cervello di topo da 1 a 2 mm di spessore sono stati sufficientemente liquidati entro 1 - 2 h (Figura 2B), e 5 - 6 h di ETC era sufficiente per clearance di cervelli di topo interi (Figura 2C). Idrogel mediata compensazione tessuto indotto l&#39;espansione del tessuto dopo la fase ETC, ma il tessuto riportata alla sua dimensione originale in soluzione index-matched riflettente. Il campione di tessuto-idrogel formata nel procedimento ACT è altamente porosa, e quindi, piccoli composti e macromolecole può penetrare in modo efficiente e diffondere facilmente (Figura 3). Dopo 2 ore di incubazione delle fettine cerebrali 1 mm con tirosina idrossilasi (TH) e collagene tipo anticorpi IV, una successiva 2 h di incubazione con un anticorpo secondario era sufficiente per etichettare i neuroni dopaminergici a una profondità di 500 micron (Figura 3) . Immunomarcatura PRESTO-tessuto organi Dense hanno generalmente alte concentrazioni di fibre ECM, che colpisce la penetrazione di anticorpi nei tessuti. Così, gli anticorpi Penetvalutazione ad una profondità di soli 20-30 micron di tessuti densi, come il tessuto renale, dopo 12 ore di incubazione. Per superare questa limitazione, abbiamo progettato metodi penetrazione macromolecola attivi che consentono l&#39;erogazione dei reagenti nei tessuti profondi, cioè PRESTO (pressione correlato trasferimento efficiente e stabile di macromolecole in organi) (Figura 4). Rispetto alla incubazione statica del tessuto renale ACT-trattati con soluzioni di anticorpi, l&#39;applicazione di forze centrifughe (600 xg) con una centrifuga da tavolo (PRESTO centrifuga, c-PRESTO) notevolmente migliorato consegna anticorpi in tessuti profondi (Figura 5). Quando abbiamo applicato la procedura di c-PRESTO ai tessuti densi, 3 ore di incubazione era sufficiente per etichettare 250 a strutture profonde di 300 micron. Per migliorare la distorsione dei tessuti senza significative danni ai tessuti, abbiamo anche progettato una macchina che fornisce il flusso di convezione con una pompa a siringa (siringhe PRESTO, s-Presto). Questo processo simile migliorato pe anticorpinetration rispetto a diffusione passiva (Figura 5). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig1.jpg" /> Figura 1. Preparazione dell&#39;apparecchiatura s-PRESTO. A. Una siringa (30 ml) e tre vie rubinetto. B. La valvola a tre vie collegata e incollato alla siringa. C. La siringa contenente la soluzione campione e l&#39;anticorpo, e la siringa posto sulla pompa a siringa. D. La pompa a siringa e di lavoro di installazione condizione. E. La pompa infonde una soluzione contenente i reagenti di etichettatura nel campione. Quando il volume designato è raggiunto, i cambi di direzione di pompaggio e ritira la soluzione dopo un determinato periodo di tempo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Figura 2. ATTO tessuto compensazione di cervello di topo. A. Dopo la polimerizzazione, soluzioni A4P0 liberi non sono polimerizzati; idrogel di tessuto-infuso sono gelated da cross-linking con macromolecole endogene. B. 1 a 2 mm di spessore fettine cerebrali sono state autorizzate per 1 - 2 h, e il grado di espansione e recupero dimensione in indice di riflessione (RI) soluzione -matching sono stati registrati. C. Lo spessore di tutto il cervello di topo è di circa 0,8 cm, e 5 - 6 h di ETC è stato sufficiente a cancellare completamente il cervello. Dopo 3 h di ETC, c&#39;è stata una notevole quantità di tessuto non compensate. Con 6 h di ETC, tuttavia, si era verificato compensazione di tutto il cervello. Il colore dei tessuti dopo l&#39;ACT nel buffer di ETC è bianco o opaco. Con la regolazione del RI, i tessuti diventano trasparenti. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig2large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare il suo</a>e per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig3.jpg" /> Figura 3. immunomarcatura con il tessuto di cervello di topo ACT-eliminato. Immagini di 1 mm fettine di cervello di topo ACT-elaborati che mostrano la corteccia cerebrale del mouse macchiato con un anticorpo di collagene di tipo IV e parte del mesencefalo macchiato di un anticorpo per la tirosina idrossilasi (TH). barra della scala, 100 micron. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig4.jpg" /> Figura metodi immunomarcatura 4. PRESTO. Gli anticorpi non possono penetrare nei tessuti densi di diffusione. metodi PRESTO immunomarcatura sono stati progettati per infondere attivamente macromolecole e di consegnare i reagenti intessuti densi. L&#39;applicazione di forze centrifughe utilizzando una centrifuga da tavolo standard (PRESTO centrifuga, c-PRESTO) notevolmente facilitato la consegna di anticorpi. Applicando il flusso di convezione con una pompa a siringa (siringhe PRESTO, s-PRESTO) migliore penetrazione degli anticorpi. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig5.jpg" /> Figura 5. PRESTO immunomarcatura di tessuto denso ACT-eliminato. Per c-PRESTO, tessuti sono stati centrifugati a 600 xg per 3 h usando un tavolo centrifuga standard per accelerare la penetrazione degli anticorpi primari e secondari. Per s-PRESTO, una pompa a siringa è stato usato per fornire anticorpi. organi mouse, come i reni e il fegato, sono stati etichettati con collagene di tipo IV. Rispetto ai metodi convenzionali, 3 h diC o s-PRESTO migliora notevolmente la profondità di etichettatura. Nel rene ed il fegato, la profondità Z raggiunge i 300 - 350 micron o più in profondità nei campioni Presto (destra), mentre i campioni di controllo sono etichettati a una profondità di soli 40 - 50 micron (a sinistra). Una immagine ricostruita 3D è stata ottenuta con un microscopio confocale. barra della scala, 100 micron. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging

ACT-PRESTO (attivo chiarezza tecnica pressione legati trasferimento efficiente e stabile delle macromolecole in organi) consente una rapida, efficace, ma poco costoso compensazione dei tessuti e la penetrazione degli anticorpi rapida nei tessuti liberata da diffusione passiva o la consegna a pressione assistita. Utilizzando questo metodo, una vasta gamma di tessuti può essere cancellato, immunolabeled da più anticorpi e volume-ripreso.

ACT-PRESTO: Biological Clearing tessuti e Metodi immunomarcatura per Volume Imaging

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

12.0K Views.  Korea University College of Medicine.  ACT-PRESTO (attivo chiarezza tecnica pressione legati trasferimento efficiente e stabile delle macromolecole in organi) consente una rapida, efficace, ma poco costoso compensazione dei tessuti e la penetrazione degli anticorpi rapida nei tessuti liberata da diffusione passiva o la consegna a pressione assistita. Utilizzando questo metodo, una vasta gamma di tessuti può essere cancellato, immunolabeled da più anticorpi e volume-ripreso. 

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Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that makes up much of the parenchyma of the human placenta. The distal villous capillary network is the terminus of the fetal blood supply after several generations of branching of vessels extending out from the umbilical cord. This network has a contiguous cellular sheath, the syncytial trophoblast barrier layer, which prevents mixing of fetal blood and the maternal blood in which it is continuously bathed. Insults to the integrity of the placental capillary network, occurring in disorders such as maternal diabetes, hypertension and obesity, have consequences that present serious health risks for the fetus, infant, and adult. To better define the structural effects of these insults, a protocol was developed for this study that captures capillary network structure on the order of 1 - 2 mm3 wherein one can investigate its topological features in its full complexity. To accomplish this, clusters of terminal villi from placenta are dissected, and the trophoblast layer and the capillary endothelia are immunolabeled. These samples are then clarified with a new tissue clearing process which makes it possible to acquire confocal image stacks to z- depths of ~1 mm. The three-dimensional renderings of these stacks are then processed and analyzed to generate basic capillary network measures such as volume, number of capillary branches, and capillary branch end points, as validation of the suitability of this approach for capillary network characterization.

This study presents a protocol for the reversible tissue clearing, immunostaining, 3D-rendering and analysis of vascular networks in human placenta villi samples on the order of 1 - 2 mm3.

Rendering tridimensionale e l'analisi di Immunolabeled, chiarito reti vascolari Villous placentare umani

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Rapid Optical Clearing for Semi-High-Throughput Analysis of Tumor Spheroids

Tumor spheroids are fast becoming commonplace in basic cancer research and drug development. Obtaining data regarding protein expression within the spheroid at the cellular level is important for analysis, yet existing techniques are often expensive, laborious, use non-standard equipment, cause significant size distortion, or are limited to relatively small spheroids. This protocol presents a new method of mounting and clearing spheroids that address these issues while allowing for confocal analysis of the inner structure of spheroids. In contrast to existing approaches, this protocol provides for rapid mounting and clearing of a large number of spheroids using standard equipment and laboratory supplies. Mounting spheroids in a pH-neutral agarose-PBS gel solution before introducing a refractive-index-matched clearing solution minimizes size distortion common to other similar techniques. This allows for detailed quantitative and statistical analysis where the accuracy of size measurements is paramount. Furthermore, compared to liquid clearing solutions, the agarose gel technique keeps spheroids fixed in place, allowing for the collection of three-dimensional (3D) confocal images. The present article elaborates how the method yields high-quality two- and 3D images that provide information about inter-cell variability and inner spheroid structure.

Tumor spheroids are becoming increasingly utilized to assess tumor cell-microenvironment interactions and therapy response. The present protocol describes a robust but simple method for semi-high-throughput imaging of 3D tumor spheroids using rapid optical clearing.

Clearing ottico rapido per l'analisi semi-ad alto rendimento degli sferoidi tumorali

Tumor spheroids are fast becoming commonplace in basic cancer research and drug development. Obtaining data regarding protein expression within the ...

Ricerca sul cancro

Imaging Cleared Intact Biological Systems at a Cellular Level by 3DISCO

Tissue clearing and subsequent imaging of transparent organs is a powerful method to analyze fluorescently labeled cells and molecules in 3D, in intact organs. Unlike traditional histological methods, where the tissue of interest is sectioned for fluorescent imaging, 3D imaging of cleared tissue allows examination of labeled cells and molecules in the entire specimen. To this end, optically opaque tissues should be rendered transparent by matching the refractory indices throughout the tissue. Subsequently, the tissue can be imaged at once using laser-scanning microscopes to obtain a complete high-resolution 3D image of the specimen. A growing list of tissue clearing protocols including 3DISCO, CLARITY, Sca/e, ClearT2, and SeeDB provide new ways for researchers to image their tissue of interest as a whole. Among them, 3DISCO is a highly reproducible and straightforward method, which can clear different types of tissues and can be utilized with various microscopy techniques. This protocol describes this straightforward procedure and presents its various applications. It also discusses the limitations and possible difficulties and how to overcome them.

To obtain high-resolution images of fluorescently labeled cells within large tissues, ideally, the biological samples should be imaged without sectioning. 3DISCO is a straightforward tissue clearing procedure based on sequential incubation with organic solvents. Upon clearing, the organs become transparent allowing an end-to-end laser scan of the specimen.

Imaging Azzerato Sistemi Biologici intatti a livello cellulare da 3DISCO

Tissue clearing and subsequent imaging of transparent organs is a powerful method to analyze fluorescently labeled cells and molecules in 3D, in intact ...

Neuroscienze

Visualization, Quantification, and Mapping of Immune Cell Populations in the Tumor Microenvironment

The immune landscape of the tumor microenvironment (TME) is a determining factor in cancer progression and response to therapy. Specifically, the density and the location of immune cells in the TME have important diagnostic and prognostic values. Multiomic profiling of the TME has exponentially increased our understanding of the numerous cellular and molecular networks regulating tumor initiation and progression. However, these techniques do not provide information about the spatial organization of cells or cell-cell interactions. Affordable, accessible, and easy to execute multiplexing techniques that allow spatial resolution of immune cells in tissue sections are needed to complement single cell-based high-throughput technologies. Here, we describe a strategy that integrates serial imaging, sequential labeling, and image alignment to generate virtual multiparameter slides of whole tissue sections. Virtual slides are subsequently analyzed in an automated fashion using user-defined protocols that enable identification, quantification, and mapping of cell populations of interest. The image analysis is done, in this case using the analysis modules Tissuealign, Author, and HISTOmap. We present an example where we applied this strategy successfully to one clinical specimen, maximizing the information that can be obtained from limited tissue samples and providing an unbiased view of the TME in the entire tissue section.

Here, we describe a simple and accessible strategy for visualizing, quantifying, and mapping immune cells in formalin-fixed paraffin-embedded tumor tissue sections. This methodology combines existing imaging and digital analysis techniques with the purpose of expanding the multiplexing capability and multiparameter analysis of imaging assays.

Visualizzazione, quantificazione e mappatura delle popolazioni di cellule immunitarie nel microambiente tumorale

The immune landscape of the tumor microenvironment (TME) is a determining factor in cancer progression and response to therapy. Specifically, the density ...

Immunologia e infezioni

Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) imaging. They have received great attention in all research areas for the potential to analyze microscopic multicellular structures that extend over macroscopic distances. Given that kidney tubules, vasculature, nerves, and glomeruli extend in many directions, which have been only partially captured by traditional two-dimensional techniques so far, tissue clearing also opened up many new areas of kidney research. The list of optical clearing methods is rapidly growing, but it remains difficult for beginners in this field to choose the best method for a given research question. Provided here is a simple method that combines antibody labeling of thick mouse kidney slices; optical clearing with cheap, non-toxic and ready-to-use chemical ethyl cinnamate; and confocal imaging. This protocol describes how to perfuse kidneys and use an antigen-retrieval step to increase antibody- binding without requiring specialized equipment. Its application is presented in imaging different multicellular structures within the kidney, and how to troubleshoot poor antibody penetration into tissue is addressed. We also discuss the potential difficulties of imaging endogenous fluorophores and acquiring very large samples and how to overcome them. This simple protocol provides an easy-to-setup and comprehensive tool to study tissue in three dimensions.

The combination of antibody labeling, optical clearing, and advanced light microscopy allows three-dimensional analysis of complete structures or organs. Described here is a simple method to combine immunolabeling of thick kidney slices, optical clearing with ethyl cinnamate, and confocal imaging that enables visualization and quantification of three-dimensional kidney structures.

Cancellazione ottica e imaging del tessuto renale immunoetichettato

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) ...

Medicina

Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining and imaging of thick brain samples. However, this advanced technology has not yet been used for whole-mount retinas. Although the retina is partially transparent, its thickness of approximately 200 &#181;m (in mice) still limits the penetration of antibodies into the deep tissue as well as reducing light penetration for high-resolution imaging. Here, we adapted the CLARITY method for whole-mount mouse retinas by polymerizing them with an acrylamide monomer to form a nanoporous hydrogel and then clearing them in sodium dodecyl sulfate to minimize protein loss and avoid tissue damage. CLARITY-processed retinas were immunostained with antibodies for retinal neurons, glial cells, and synaptic proteins, mounted in a refractive index matching solution, and imaged. Our data demonstrate that CLARITY&#160;can improve the quality of standard immunohistochemical staining and imaging for retinal neurons and glial cells in whole-mount preparation. For instance, 3D resolution of fine axon-like and dendritic structures of dopaminergic amacrine cells were much improved by CLARITY. Compared to non-processed whole-mount retinas, CLARITY can reveal immunostaining for synaptic proteins such as postsynaptic density protein 95. Our results show that CLARITY renders the retina more optically transparent after the removal of lipids and preserves fine structures of retinal neurons and their proteins, which can be routinely used for obtaining high-resolution imaging of retinal neurons and their subcellular structures in whole-mount preparation.

Here we present a protocol to adapt the CLARITY method of the brain tissues for whole-mount retinas to improve the quality of standard immunohistochemical staining and high-resolution imaging of retinal neurons and their subcellular structures.

Immunostaining delle retine a montaggio intero con il metodo clarity tissue clearing

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining ...

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro and in vivo. Fluorescent probes are particularly useful in determining the bio-distribution of administered large molecules, where the addition of a small-molecule fluorescent label is unlikely to affect the kinetics or bio-distribution of the compound. A variety of methods exist to examine bio-distribution that vary significantly in the amount of effort required and whether the resulting measurements are fully quantitative, but using multiple methods in conjunction can provide a rapid and effective system for analyzing bio-distributions.
Ex vivo whole-organ imaging is a method that can be used to quickly compare the relative concentrations of fluorescent molecules within tissues and between multiple types of tissues or treatment groups. Using an imaging platform designed for live-animal or whole-organ imaging, fluorescence within intact tissues can be determined without further processing, saving time and labor while providing an accurate picture of the overall bio-distribution. This process is ideal in experiments attempting to determine the tissue specificity of a compound or for the comparison of multiple different compounds. Quantitative tissue histology on the other hand requires extensive further processing of tissues in order to create a quantitative measure of the labeled compounds. To accurately assess bio-distribution, all tissues of interest must be sliced, scanned, and analyzed relative to standard curves in order to make comparisons between tissues or groups. Quantitative tissue histology is the gold standard for determining absolute compound concentrations within tissues.
Here, we describe how both methods can be used together effectively to assess the ability of different administration methods and compound modifications to target and deliver fluorescently labeled molecules to the central nervous system1.

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Ex vivo whole-organ imaging is a rapid method for determining the relative concentrations of fluorescently labeled compounds within and between tissues or treatment groups. Conversely, quantitative fluorescence histology, while more labor intensive, allows for the quantification of the absolute tissue levels of labeled molecules.

L&#39;impiego di<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Imaging Whole-organo e quantitativa Istologia del tessuto per determinare la Bio-distribuzione delle molecole fluorescente

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

Biologia

Ricostruzione 3D ad alta risoluzione del cervello umano con SHORT e LSFM

Optical Clearing and Labeling for Light-sheet Fluorescence Microscopy in Large-scale Human Brain Imaging

Despite the numerous clearing techniques that emerged in the last decade, processing postmortem human brains remains a challenging task due to its dimensions and complexity, which make imaging with micrometer resolution particularly difficult. This paper presents a protocol to perform the reconstruction of volumetric portions of the human brain by simultaneously processing tens of sections with the SHORT (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) tissue transformation protocol, which enables clearing, labeling, and sequential imaging of the samples with light-sheet fluorescence microscopy (LSFM). SHORT provides rapid tissue clearing and homogeneous multi-labeling of thick slices with several neuronal markers, enabling the identification of different neuronal subpopulations in both white and grey matter. After clearing, the slices are imaged via LSFM with micrometer resolution and in multiple channels simultaneously for a rapid 3D reconstruction. By combining SHORT with LSFM analysis within a routinely high-throughput protocol, it is possible to obtain the 3D cytoarchitecture reconstruction of large volumetric areas at high resolution in a short time, thus enabling comprehensive structural characterization of the human brain.

Autore in primo piano: Avanzamento dell'analisi della citoarchitettura 3D - Ricostruzione volumetrica rapida del cervello umano 

The present protocol provides a step-by-step procedure for rapid and simultaneous optical clearing, muti-round labeling, and 3D volumetric reconstruction of tens of postmortem human brain sections by combining the (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) SHORT tissue transformation technique with light-sheet fluorescence microscopy imaging in a routinely high-throughput protocol.

ACT-PRESTO: Biological Clearing tessuti e Metodi immunomarcatura per Volume Imaging

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Rendering tridimensionale e l'analisi di Immunolabeled, chiarito reti vascolari Villous placentare umani

Clearing ottico rapido per l'analisi semi-ad alto rendimento degli sferoidi tumorali

Imaging Azzerato Sistemi Biologici intatti a livello cellulare da 3DISCO

Visualizzazione, quantificazione e mappatura delle popolazioni di cellule immunitarie nel microambiente tumorale

Cancellazione ottica e imaging del tessuto renale immunoetichettato

Immunostaining delle retine a montaggio intero con il metodo clarity tissue clearing

L'impiego di

Pulizia ottica ed etichettatura per la microscopia a fluorescenza a foglio luminoso nell'imaging cerebrale umano su larga scala

Pulizia ottica ed etichettatura per la microscopia a fluorescenza a foglio luminoso nell'imaging cerebrale umano su larga scala

Pulizia ottica ed etichettatura per la microscopia a fluorescenza a foglio luminoso nell'imaging cerebrale umano su larga scala