The authors thank the three anonymous reviewers for their helpful comments on the manuscript. This work was partly supported by Grant-in-Aid for JSPS Fellows (26.11613).

Hinweis: Dieser Artikel basiert auf unserer bisherigen Arbeit 30. Einige Teile sind mit Genehmigung der Botanical Society of Japan und Springer Japan wieder aufgelegt. 1. Die Beobachtung der Blumen Besucher <ol><li> Die Auswahl der Beobachtungsfelder <ol><li> Suche die Bereiche , in denen die Pflanzenmaterialien verteilt sind, und wählen Sie die Kandidaten Prüfzentren mit verlässlichen Ressourcen, wie Bild Bücher, Fachzeitschriften, usw. Stellen Sie die Anzahl der Studienzentren , die Forschungsziele zu passen (zB ein breites Spektrum von Standorten für der Vergleich der Blütenbesucher in ganz Japan). </li><li> Überprüfen Sie die Positionen der ausgewählten Kandidaten Populationen und die Abstände von relevanten Ansatzpunkte, wie Forschungseinrichtungen und Unterkünfte, wenn langfristige Forschung notwendig ist. </li><li> schätzen etwa jede Populationsgröße durch die Anzahl der Pflanzenindividuen in einer Flächeneinheit zu zählen. Wählen Sie große Populationen für manipulierten Experiments viele Pflanzenindividuen mit. </li><li> Pre-Beobachtung von Blumen Besucher <ol><li> Entscheiden Sie, welche Zielpersonen in jedem Bereich wird während des gleichen Zeitintervall beobachtet werden, abhängig von den Bevölkerungsdichten. Wählen Sie 5-10 frisch geöffneten Blüten oder Knospen als Ziel Blumen brechen und abgebaut diejenigen abzulehnen, die bereits geöffnet haben. </li><li> Starten Sie die visuelle Beobachtung für einen Zeitraum von einem ganzen Tag, denn die Blumen durch verschiedene Bestäuber in unterschiedlichen Zeitbereichen 31,32 besucht werden. </li><li> Auf den Aufzeichnungsblättern, notieren Sie die Artname von Blumen Besucher und die Zeit jeder Heimsuchung pro Stunde pro Blume. </li><li> genau beobachten, ob Blumen Besucher die Antheren und / oder Stigmata berühren; wenn sie es tun, notieren Sie die Besucher als Bestäuber. Wenn die Blumen Besucher nur die Blumen besuchen und nicht die Fortpflanzungsorgane zu berühren, sie als Besucher aufzeichnen. </li><li> Mit einem Insektennetz oder handgefertigte Saugvorrichtung, die Blumen Besucher erfassen zu identifizieren undbewahre sie als Proben (Abbildung 1f). Töten die eingeschlossenen Besucher schnell mit Ethylacetat oder Fingerdruck auf den Brustkorb, und bewahren sie in einer weichen Tasche oder in einem Kunststoffrohr oder Fall mit 100% Ethanol. </li><li> Nach der Beobachtung, Ermittlung der spezifischen Namen von Proben unter Verwendung von morphologischen Merkmalen oder, im Falle von Schwierigkeiten bei der Identifizierung, fordern Sie die Hilfe von Experten für die einzelnen taxonomischen Gruppe. </li></ol></li></ol></li><li> Beobachtung auf dem Gebiet <ol><li> Wählen Forschungsstandorte auf der Grundlage ihrer Zugänglichkeit, der Einwohnerzahl und die Anzahl der Blumen Besucher. Wählen Sie Zeitperioden , die eine repräsentative Stichprobe von Blumen Besucher in der Blütezeit umfassen und bestimmen Beobachtungsperioden auf Basis von Forschungszielen (zB für die Forschung auf Visitation Frequenzschwankungen , die durch Blumen Besucher sollten lange Zeiträume festgelegt werden). </li><li> Bereiten Sie die entsprechende Aufnahmegeräte wie digitale Videokameras (zB für Nachtaufnahme, Videokameras mit einer Infrarot - Funktion sollte) verwendet werden. </li><li> Wählen Sie die Ziel Blumen in der gleichen Weise wie bei 1.1.4. </li><li> Befestigen Sie die Videokameras auf Aluminiumstative. Stellen Sie die Kameras mit Stativen vor den Zielpersonen, etwa 50 cm entfernt. </li><li> Prüfen und die Lichtmenge zu ändern und den Fokus der Materialien auf den Bildschirmanzeigen der Kameras vor filmen. </li><li> Starten Sie die visuelle Beobachtung und Videoaufnahmen zur gleichen Zeit für die entsprechenden Zeitzonen geschätzt durch die vorge Beobachtungen (im vorliegenden Fall, Beobachtungsperiode für mehr als sechs Stunden im Durchschnitt von ca. 5.00 Uhr bis 13.00 Uhr ). </li><li> Identifizieren Sie die Arten Namen der Besucher und Bestäuber, und ihre Namen aufzuzeichnen und die Zeiten ihrer Besuche auf den Aufzeichnungsblättern. </li><li> Erfassen und identifizieren die Besucher und Bestäuber in der gleichen Weise wie in 1.1.4.5. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.2.1 bis 1.2.7 für jede observation Zeitraum. Stellen Sie die Beobachtungszeiten auf der Grundlage der Forschungsziele und Pre-Beobachtungsdaten. </li></ol></li><li> Datenanalysen Nach Beobachtung <ol><li> Identifizieren der Arten Namen der aufgenommenen Proben nach pollinator Beobachtung in der gleichen Weise wie in 1.1.4.6. </li><li> Schauen Sie sich die Videoclips und beachten Sie die Artnamen und deren Besuchszeiten in der gleichen Weise wie für die visuelle Beobachtung. </li><li> Berechnen Sie die Besuchsfrequenzen pro Blume pro Stunde jedes Blumen Besucher aus der visuellen Beobachtung und Videoaufnahme-Daten. Vergleichen Sie diese Frequenzen statistisch zwischen den Standorten und Jahren jedes Besuchers geeigneten statistischen Methoden auf Basis von grundlegenden Statistiken und mit geeigneter Software, wie zum Beispiel R, SPSS und / oder SAS - 33-35 ( zum Beispiel ein Zwei-Wege - Varianzanalyse (ANOVA ) mit Tukey ehrlich signifikanten Unterschied (HSD) Test in R-Software). </li></ol></li></ol> 2. Absackung und Cage Experimente<ol><li> Die Vorbereitungen für die Absackung und Cage Experimente <ol><li> Für die Absackung Experimente, bereiten Beutel , die kleine Maschenweiten (~ 0,5-1 mm) und nutzen sie vollständig zu verhindern Blume Visitation (zB Vliesstofftaschen wurden in 2011 für die Absackung Experimente verwendet und 2012) haben. </li><li> Für den Käfigexperimenten, Draht oder Kunststoffgitter Platten mit einem Durchmesser herzustellen, die das Ziel kleiner Besucher passieren lässt, schließt aber die größeren und diese Maschenplatten verbinden, einen Käfig zu bilden. Stellen Sie sicher, dass es keine Lücken größer als die Maschenweite sind. Anpassen der Größe und Form der Käfige auf der Basis der Zielpflanzenspezies und einzelne Zahlen. </li></ol></li><li> Absackung Experimente <ol><li> Wählen Sie 30 Individuen pro Behandlung, die keine Schäden durch Pflanzenfresser oder an einer schweren Umwelt haben. Für die Behandlung, eine einzelne Blume von jeder einzelnen Anlage wählen oder einzelne Blumen auf einer einzigen Anlage verwenden. </li><li> Tasche ter Blumen auf dem Gebiet gezielt nach ihnen mit Klebeband Beschriftung (Seriennummer und Alphabet; Abbildung 1 g). Achten Sie darauf, nicht die Antheren oder die Stigmata in den Taschen zu berühren die Möglichkeit der Selbstbestäubung zu vermeiden. </li><li> Sorgfältig fixieren Taschen zu den Blumen eine weiche Schnur oder einem Draht (Abbildung 1d) verwendet wird . </li><li> aufrecht einzelne Blüten mit Stützen mit weichen Schnur oder einem Draht zur Unterstützung der Personen, gegen Kippen oder Zusammenbruch unter dem Gewicht der Beutel oder den Wind, wie nötig vorsichtig eingestellt. Twist oder wickeln eine Schnur oder einem Draht sanft um den Stiel einer Zielperson, um nicht Schaden zu schaffen. </li><li> Behandlungen in den Absacken Experimente <ol><li> Für die &quot;Control&quot; Behandlung, befestigen Sie die Etiketten an den Ziel Blumen und keine Behandlung durchzuführen. Lassen Sie Blumen Besucher frei zu besuchen. </li><li> Für die &quot;Auskreuzung&quot; Behandlung, decken Sie die Knospen, bis sie blühen, und dann die Antheren der abgefüllten Blumen zu entfernen. Setzen Sie etwas pollen Körner von mehreren Personen auf der Stigmata. </li><li> Für die &quot;Selbstung&quot; Behandlung, decken Sie die Knospen, bis die Blüten öffnen, und setzen Pollen aus den gleichen Blumen auf ihre Stigmata. Decken Sie diese behandelt Blumen wieder. </li><li> Für die &quot;Auto-Selbst&quot; Behandlung, decken Sie die Knospen mit Taschen, bis zum Ende der Blütezeit. </li><li> Für die &quot;Breaking Knospe&quot; Behandlung, identifizieren die zu brechen Knospen , die besucht wurden , und den Eingang oder den Ausgang von kleinen Bienen (1b, c) zu beobachten. Entfernen Sie die Antheren der Bruchknospen auf der gleichen Blume nach dem Besuch von kleinen Bienen wiederholt Pollenablagerungen zu verhindern, und Beutel diese Knospen schnell weitere Heimsuchungen zu verhindern. </li><li> Für die &quot;Blüte&quot; Behandlung, Tasche die Knospen bis zur Eröffnung der Bühne Visitationen mit dem Brechknospenstadium zu vermeiden. Danach entfernen Sie die Taschen und ermöglichen den Besuchern, Nektar und Pollen zu sammeln. </li><li> Für die &quot;Bud&quot; Behandlung,die Antheren aus ungeöffneten Knospen entfernen und sie künstlich Auskreuzung. Bag diese Knospen schnell Blume Heimsuchungen zu verhindern. </li></ol></li></ol></li><li> Cage Experimente <ol><li> Decken Sie die Zielpflanze Personen mit vorbereiteten Käfige. Stellen Sie die Positionen von caged Blumen von Hand Kontakt und Pollenablagerungen zwischen verschiedenen Stigmata (Abbildung 1e) zu verhindern. </li><li> Für den &quot;Käfig&quot; Behandlung, wählen Sie die Personen mit ungeöffneten Knospen und setzen Etiketten auf sie für die Identifizierung von ausgewählten Blumen. Cage die Individuen mit markierten Knospen , die Einflüsse aus der Zeit vor der Errichtung von Käfigen (dh Blumen Insekten ungeöffnete Knospen besuchen können, und nur die Effekte von Insekten , die nach der Platzierung von Käfigen besuchen kann nicht abgeschätzt werden) abzulehnen. </li><li> Bringen Sie die Käfige fest am Boden mit Eisenstangen Eintritt von Besuchern zwischen dem Kabinenboden und dem Boden zu verhindern. </li></ol></li><li> Datenanalysen After der Absackung und Cage Experimente <ol><li> Sammeln Sie alle der markierten Blumen am Ende der Blütezeit (Abbildung 1 g) durch Schneiden und sie von den mütterlichen Individuen zu trennen. Bewahren Sie jede markierte Probe separat ihre Kontamination zu verhindern. </li><li> Überprüfen Sie, ob das Vorhandensein oder Fehlen von Obst auf jedem Satz markiert flower.Record die Samen Zahlen der jeweiligen Frucht bei Einstellung Früchte. </li><li> Berechnen Sie das Verhältnis von Frucht Zahlen pro Blume (Obst-Set-Verhältnis, definiert als die Anzahl der Früchte durch die Anzahl der Blumen geteilt) und der Samenzahl pro reifen Früchte (Samen-Satz-Verhältnis, definiert als die Anzahl von Samen dividiert durch die Anzahl von Ovula) alle aufgenommenen Zahlen. </li><li> Statistisch gesehen vergleichen die Frucht- und Samensatz Verhältnisse zwischen den Behandlungen geeigneten Methoden und Software, wie zum Beispiel jene , die in 1.3.3 (zB one-way ANOVA mit Tukey HSD oder Fisher-Test in R - Software 33) verwendet wird . </li><li> Untersuchungen der Materialien, die die Ergebnisse der Experimente mit Absacken <ol><li> Um zu testen, die Notwendigkeit von Tier Bestäuber, vergleichen die Ergebnisse statistisch zwischen &quot;Control&quot; und &quot;Auto-Selbst&quot; Behandlungen. </li><li> Um den Grad der Pollen Begrenzung abschätzen zu können, vergleichen Sie die &quot;Control&quot; und &quot;Auskreuzung&quot; Behandlungen. </li><li> Um zu testen, Selbst Kompatibilität, vergleichen Sie die &quot;Auskreuzung&quot; und &quot;Selbstung&quot; Behandlungen. </li></ol></li><li> Bewertungen der Einflüsse des Brechens Knospe Bestäubung <ol><li> Vergleichen Sie die &quot;Control&quot; und &quot;Bud&quot; Behandlungen, um zu bestimmen, ob die Stigmata der Bruch Knospen reproduktiv reif sind und ob der Wert der &quot;Control&quot; Behandlung kann für die Steuerung mit dem Brechknospenstadium verwendet werden. </li><li> Vergleichen Sie die &quot;Auto-Selbst&quot; und &quot;Breaking Knospe&quot; Behandlungen, um zu bestimmen, ob der Reproduktionserfolg von Blumen bestäubt mit kleinen Bienen am Bruch-BUD Stadium ist statistisch höher als die von Pflanzen Durchführung autogamy (dh zu testen , die Existenz zu brechen Knospe Bestäubung). Danach, zu vergleichen, diese beiden Behandlungen mit dem &quot;Control&quot;, um die Bestäubung Effizienz des Brechens Knospe Bestäubung zu schätzen. </li><li> Vergleichen Sie die &quot;Breaking Knospe&quot;, &quot;Cage&quot; und &quot;Blüte&quot; Behandlungen die Fortpflanzungs Einflüsse brechen Knospe Bestäubung zu schätzen. </li></ol></li></ol></li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Blumen-Beobachtungen und Absackung Experimente wurden in dieser Studie verwendet, um die Besuchsfrequenzen zu offenbaren und die weiblichen Fortpflanzungserfolg der Pflanzen sind. In Dafni (1992) 38, war die Videoband - Verfahren effektiv , weil sie den Zeitpunkt und die Dauer der Besucher für die Analyse aufzeichnen konnte , und Beobachter Bias verhindern. Jedoch zu der Zeit, benötigt dieses Verfahren eine teure Ausrüstung und die Beobachtungszeiten wurden durch die Batterielebensdauer begrenzt. Vor kurze...

Plant-Bestäuber-Interaktionen sind hervorragende Beispiele für das Studium der Evolutionsbiologie und Ökologie. Die mutualistic Beziehungen zwischen Blumen und Bestäuber sind gedacht , um die Diversifizierung der 1,2 angiosperm gefördert zu haben als Ergebnis der natürlichen Selektion, obwohl andere biotische und abiotische Faktoren auch Einfluss 3,4,5 ausgeübt haben. Es wird auch vermutet , dass Blumen Züge verändert haben zu den wirksamsten Bestäuber anzupassen und mehr Früchte und Samen bis 6 herzustellen. Diese Überzeugungen wurden zwar große Studien auf der Basis verschiedener Indizes wie Bestäubung Wirksamkeit konstruiert, die verschiedene Interpretationen 7 einzubeziehen. Blühende Pflanzen , die Bestäubung Systeme verallgemeinert werden durch verschiedene Arten von Bestäuber 8 besucht. Hierbei wurde eine Blume Besucher als eine Tierart definiert, die eine Blumen Belohnung zu erhalten besucht und Bestäuber wurden als Blumen Besucher definiert, die bestäuben.Einige dieser Besucher tragen Artgenossen Pollenkörner auf die Stigmata der besuchten Blüten und kann als Bestäuber klassifiziert werden. Andere Besucher können auch einige innerartliche Pollen haben; sie könnten weniger Bestäubung führen aufgrund Verhaltens- oder morphologische Fehlpaarungen zwischen den Bestäuber und die Blumen. Diese vergleichbare Unterschiede in der Beitrag zur Pflanzenreproduktion könnten unterschiedliche Grade der Selektionsdruck auf floralen Züge 9 erzeugen und könnte die adaptive Divergenz von Blütenpflanzen verursachen. Daher wird , obwohl die Zusammensetzung der Bestäuber Gemeinschaft und die relative Artenreichtum sind 10 wichtig, die genaue Bewertung der jeweiligen Wirksamkeit des Besuchers ist auch entscheidend für die adaptive und / oder evolutionäre Prozesse der Pflanzen zu bestimmen. In dieser Studie wurden 11 quantitative Schätzungen der Bestäuber Effizienzen, definiert als die Frucht- und Samenproduktion pro Visitation Frequenz bestimmt. Die Spezifikationer Jahren und Häufigkeit der einzelnen Blumen-Besucher wurden beobachtet, und reproduktive Auswirkungen auf den besuchten Blumen wurden geschätzt. Die Aufnahme von floralen Besuche durch Beobachtungen am Menschen ist eine klassische Methode bei der Bestäubung der Ökologie. Jedoch erlegt dieses Verfahren eine große Belastung für die Beobachter, die erforderlich sind, vor den Pflanzen zu bleiben und eine sorgfältige, langfristige Messungen. Vor kurzem haben die Technologien von Filmen und Aufnahme schnell entwickelt, und Low-Cost - Digital - Videokameras haben die Einführung der Videoaufzeichnung auf Bestäuber Beobachtungen 12,13 aktiviert. Diese Methoden können die Sammlung von Basisinformationen über Blumen Besucher erleichtern und helfen könnte, ein Verständnis für die Bestäubung Ökologie einer Zielpflanzenarten zu entwickeln. Jedoch sind die Besuchsfrequenzen der Bestäuber nicht notwendigerweise korreliert , um ihre Wirksamkeit Bestäubung 7,14, und es ist wichtig , die qualitative Effekte jedes pollinator zu bewertenauf Blume Fitness. Bestäubung Wirksamkeit wurde durch die Anzahl der Pollenkörner auf der Stigmata 15,16, Pollenschlauchwachstum 17,18 und Obst und / oder Samenproduktion 19,20 geschätzt. Absacken Experimente führten Besucher exklusive Taschen und Koffer, sind die typischen Methoden zur Prüfung von Selbst Kompatibilität, autogamy 21,22, und das Vorhandensein von apomixes 23. Zusätzlich wurde die Bewertung der Bestäubung Wirksamkeit für eine bestimmte Bestäuber im Besucher assemblage häufig in Umgebungen durchgeführt , in denen andere Blumen Besucher beschränkt sind (dh ein Drahtkäfig, Netz oder eine Tasche mit einer Maschen klein genug größer Bestäuber auszuschließen, ist Satz auf Blütenpflanzen). Zum Beispiel, Absacken Experimente mit kleinen Mesh - Taschen wurden durchgeführt , die Bestäubung Fähigkeit von Ameisen oder Thripse 24,25 zu offenbaren. Darüber hinaus haben einen Drahtkäfig oder Netto-Experimente Vogel Ausschluss unter Verwendung der effektiven Bestäuber der Taxa Aloe gezeigt26-28. Die Ziele dieser Studie waren: 1) die Methoden in einem früheren Papier einzuführen und 2) diese Methoden für die allgemeine Verwendung in anderen Studien zu Blumen Besucher, deren Besuch Frequenzen, und ihre Auswirkungen auf die Pflanzen Fitness Lycoris sanguinea var zu verbessern.. sanguinea ist eine der Arten der Gattung Lycoris enthalten, die im Großen und ganzen in ganz Japan verteilt und eng in Korea 29 und hat trichterförmig rötlich-orange Blüten (Abbildung 1a). Eine frühere Studie ergab , dass L. sanguinea var. sanguinea wurde durch mehrere Insektenarten besucht, darunter eine nicht identifizierte kleine Bienenarten und den größeren Arten Amegilla florea 29. Allerdings wurden nicht identifiziert die Visitation Frequenzen und Bestäubung Wirksamkeit dieser Besucher. Bestäuber Beobachtungen zur Identifizierung von Blumen Besucher wurden zum ersten Mal durchgeführt. Visitation durch kleine Bienen wurde OBSErved auf Blumen , die noch nicht vollständig geöffnet hatte (Bruch Knospen; 1b, c). Kleine Bienen zog eilig um die undehisced Antheren in den Bruch Knospen und gesammelte Pollen ihre Mandibeln verwenden. Die Hypothese war, dass die kleinen Bienen Bestäuber mit dem Brechknospenstadium sein könnte, weil die Lücken zwischen den Antheren und der Stigmata in den Blüten kleiner waren als die Körperlänge der Bienen. Daher wurden Absacken Experimente durchgeführt , bei dem Brechknospenstadium die Bestäubung Fähigkeit von kleinen Bienen zu testen und zusätzlich die Fortpflanzungsstrategien von L. zu untersuchen sanguinea var. sanguinea. Diese Knospen wurden nach den kleinen Bienen besucht verpackt, die eine Abschätzung der Bestäubung Fähigkeit der Bienen erlaubt. Die Personen wurden mit ungeöffneten Knospen in Käfigen gehalten. Ein Käfig engmaschigen verwendet wurde, durch die nur kleine Bienen passieren könnte, eine Schätzung der Bestäubung Effizienz von kleinen Bienen während des gesamten flowe erlaubtRingstadium.

<table><tbody><tr><td>recording sheet</td><td>any</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>insect net</td><td>any</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>pooter</td><td>any</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>ethyl acetate</td><td>any</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>100% Ethanol</td><td>any</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>plastic tube</td><td>any</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>plastic case</td><td>any</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>soft bag</td><td>any</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>digital video camera(s)</td><td>any</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>tripod(s)</td><td>any</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>bags</td><td>any</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>wire or plastic mesh boards</td><td>any</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>iron wires</td><td>any</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>labeling tape</td><td>any</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>stick supporters</td><td>any</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>soft strings or wire</td><td>any</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>pincette(s)</td><td>any</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

field experiments of pollination ecology: the case of lycoris sanguinea var. sanguinea

Plant-pollinator interactions have been studied for approximately one hundred years. During that time, many field methods have been developed to clarify the pollination effectiveness of each pollinator for visited flowers. Pollinator observations have been one of the most common methods to identify pollinators, and bagging and cage experiments have been conducted to show the effectiveness of specific pollinators. In a previous study of Lycoris sanguinea var. sanguinea, its effective pollinators, the visitation frequencies of each floral visitor, and its reproductive strategies were not identified. This study reports the observation that small bees visited flowers that were partially opened (breaking buds). To the best of our knowledge, this phenomenon has not been reported previously. Further, this study investigates the hypothesis that small bees can pollinate at that flowering stage. This study demonstrates the basic methods of field experiments in pollination ecology using L. sanguinea var. sanguinea. Pollinator observations and digital video showed the visitation frequencies of each floral visitor. Bagging and cage experiments revealed that these flowers could be pollinated fully and that breaking-bud pollination could be important for the pollination of this plant species. The advantages and disadvantages of each method are discussed, and recent developments, including laboratory experiments, are described.

Fünf Populationen wurden für Bestäuber Beobachtungen ausgewählt. In der Pre-Beobachtungsphase, Visitationen verschiedener Insektenarten zu öffnen Blumen und kleine Bienen zu brechen Knospen wurden bestätigt. Floral Besucher Beobachtungen zeigten , dass die meisten der Besucher auf allen fünf Prüfzentren Individuen der kleinen Bienenarten Lasioglossum japonicum waren. Die Gesamtbesuchsrekord zeigte , dass die Visitation Verhältnisse dieser Art an drei Standorten ...

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Field Experiments of Pollination Ecology: The Case of Lycoris sanguinea var. sanguinea

Um die Bestäuber Wirksamkeit eines bestimmten Pflanzenarten, mehrere Methoden der Feldversuche zeigen, wurden entwickelt. Diese Studie zeigt die grundlegenden Methoden der Feldversuche zur Bestäubung Ökologie mit der Fallstudie von Lycoris sanguinea var. Sanguinea und den Roman Bestäubung Mechanismus, brechen Knospe Bestäubung.

Feldexperimente von Bestäubungsökologie: Der Fall<em&gt; Lycoris sanguinea</em&gt; Var.<em&gt; sanguinea</em

Plant-pollinator interactions have been studied for approximately one hundred years. During that time, many field methods have been developed to clarify ...

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Field Experiments of Pollination Ecology: The Case of Lycoris sanguinea var. sanguinea

11.4K Aufrufe.  Chiba University.  Um die Bestäuber Wirksamkeit eines bestimmten Pflanzenarten, mehrere Methoden der Feldversuche zeigen, wurden entwickelt. Diese Studie zeigt die grundlegenden Methoden der Feldversuche zur Bestäubung Ökologie mit der Fallstudie von Lycoris sanguinea var. Sanguinea und den Roman Bestäubung Mechanismus, brechen Knospe Bestäubung. 

Serie: Field Experiments of Pollination Ecology: The Case of Lycoris sanguinea var. sanguinea

Methods for Performing Crosses in Setaria viridis, a New Model System for the Grasses

Setaria viridis is an emerging model system for C4 grasses. It is closely related to the bioenergy feed stock switchgrass and the grain crop foxtail millet. Recently, the 510 Mb genome of foxtail millet, S. italica, has been sequenced 1,2 and a 25x coverage genome sequence of the weedy relative S. viridis is in progress. S. viridis has a number of characteristics that make it a potentially excellent model genetic system including a rapid generation time, small stature, simple growth requirements, prolific seed production 3 and developed systems for both transient and stable transformation 4. However, the genetics of S. viridis is largely unexplored, in part, due to the lack of detailed methods for performing crosses. To date, no standard protocol has been adopted that will permit rapid production of seeds from controlled crosses.
The protocol presented here is optimized for performing genetic crosses in S. viridis, accession A10.1. We have employed a simple heat treatment with warm water for emasculation after pruning the panicle to retain 20-30 florets and labeling of flowers to eliminate seeds resulting from newly developed flowers after emasculation. After testing a series of heat treatments at permissive temperatures and varying the duration of dipping, we have established an optimum temperature and time range of 48 &deg;C for 3-6 min. By using this method, a minimum of 15 crosses can be performed by a single worker per day and an average of 3-5 outcross progeny per panicle can be recovered. Therefore, an average of 45-75 outcross progeny can be produced by one person in a single day. Broad implementation of this technique will facilitate the development of recombinant inbred line populations of S. viridis X S. viridis or S. viridis X S. italica, mapping mutations through bulk segregant analysis and creating higher order mutants for genetic analysis.

Methods for Performing Crosses in Setaria viridis, a New Model System for the Grasses

We have developed a methodology for performing crosses in Setaria viridis (S. viridis). The method involves pruning the panicle prior to a hot water treatment to kill viable pollen. Crosses are performed following a well-controlled growth regime and typically result in the recovery of 1 to 7 cross-pollinated seed/s per panicle.

Verfahren für Kreuze in<em&gt; Setaria viridis</em&gt;, Ein New Model System für die Gräser

Setaria viridis is an emerging model system for C4 grasses. It is closely related to the bioenergy feed stock switchgrass and the grain crop foxtail ...

Forschung

Umwelt

Administering and Detecting Protein Marks on Arthropods for Dispersal Research

Monitoring arthropod movement is often required to better understand associated population dynamics, dispersal patterns, host plant preferences, and other ecological interactions. Arthropods are usually tracked in nature by tagging them with a unique mark and then re-collecting them over time and space to determine their dispersal capabilities. In addition to actual physical tags, such as colored dust or paint, various types of proteins have proven very effective for marking arthropods for ecological research. Proteins can be administered internally and/or externally. The proteins can then be detected on recaptured arthropods with a protein-specific enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Here we describe protocols for externally and internally tagging arthropods with protein. Two simple experimental examples are demonstrated: (1) an internal protein mark introduced to an insect by providing a protein-enriched diet and (2) an external protein mark topically applied to an insect using a medical nebulizer. We then relate a step-by-step guide of the sandwich and indirect ELISA methods used to detect protein marks on the insects. In this demonstration, various aspects of the acquisition and detection of protein markers on arthropods for mark-release-recapture, mark-capture, and self-mark-capture types of research are discussed, along with the various ways that the immunomarking procedure has been adapted to suit a wide variety of research objectives.

Proteins are often used to mark arthropods for dispersal research. Methods for administering internal and external protein marks on arthropods are demonstrated. Protein mark detection techniques, either through indirect or sandwich enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs), are also illustrated.

Verwaltung und Nachweis von Protein-Kennzeichen auf Arthropoden für Dispersal Forschung

Monitoring arthropod movement is often required to better understand associated population dynamics, dispersal patterns, host plant preferences, and other ...

Choice and No-Choice Assays for Testing the Resistance of A. thaliana to Chewing Insects

Larvae of the small white cabbage butterfly are a pest in agricultural settings. This caterpillar species feeds from plants in the cabbage family, which include many crops such as cabbage, broccoli, Brussel sprouts etc. Rearing of the insects takes place on cabbage plants in the greenhouse. At least two cages are needed for the rearing of Pieris rapae. One for the larvae and the other to contain the adults, the butterflies. In order to investigate the role of plant hormones and toxic plant chemicals in resistance to this insect pest, we demonstrate two experiments. First, determination of the role of jasmonic acid (JA - a plant hormone often indicated in resistance to insects) in resistance to the chewing insect Pieris rapae. Caterpillar growth can be compared on wild-type and mutant plants impaired in production of JA. This experiment is considered "No Choice", because larvae are forced to subsist on a single plant which synthesizes or is deficient in JA. Second, we demonstrate an experiment that investigates the role of glucosinolates, which are used as oviposition (egg-laying) signals. Here, we use WT and mutant Arabidopsis impaired in glucosinolate production in a "Choice" experiment in which female butterflies are allowed to choose to lay their eggs on plants of either genotype. This video demonstrates the experimental setup for both assays as well as representative results.

Plant resistance to chewing insect herbivores can be tested in several ways. Here, we demonstrate how to set-up a choice and a no-choice experiment with the model plant Arabidopsis thaliana to identify resistance against the pest species Pieris rapae.

Auswahl und No-Choice Tests zur Prüfung der Beständigkeit von A. thaliana zu Fraßinsekten

Larvae of the small white cabbage butterfly are a pest in agricultural settings. This caterpillar species feeds from plants in the cabbage family, which ...

Biologie

In Vitro Rearing of Solitary Bees: A Tool for Assessing Larval Risk Factors

Although solitary bees provide crucial pollination services for wild and managed crops, this species-rich group has been largely overlooked in pesticide regulation studies. The risk of exposure to fungicide residues is likely to be especially high if the spray occurs on, or near host plants while the bees are collecting pollen to provision their nests. For species of Osmia that consume pollen from a select group of plants (oligolecty), the inability to use pollen from non-host plants can increase their risk factor for fungicide-related toxicity. This manuscript describes protocols used to successfully rear oligolectic mason bees, Osmia ribifloris sensu lato, from egg to prepupal stage within cell culture plates under standardized laboratory conditions. The in vitro-reared bees are subsequently used to investigate the effects of fungicide exposure and pollen source on bee fitness. Based on a 2 &#215; 2 fully crossed factorial design, the experiment examines the main and interactive effects of fungicide exposure and pollen source on larval fitness, quantified by prepupal biomass, larval developmental time, and survivorship. A major advantage of this technique is that using in vitro-reared bees reduces natural background variability and allows the simultaneous manipulation of multiple experimental parameters. The described protocol presents a versatile tool for hypotheses testing involving the suite of factors affecting bee health. For conservation efforts to be met with significant, lasting success, such insights into the complex interplay of physiological and environmental factors driving bee declines will prove to be critical.

In Vitro Rearing of Solitary Bees: A Tool for Assessing Larval Risk Factors

Fungicide sprays on flowering plants may expose solitary bees to high concentrations of pollen-borne fungicide residues. Using laboratory-based experiments involving in vitro-reared bee larvae, this study investigates the interactive effects of consuming fungicide-treated pollen derived from host and non-host plants.

In-vitro- Aufzucht von Solitärbienen: ein Werkzeug für die Beurteilung der Larven Risikofaktoren

Although solitary bees provide crucial pollination services for wild and managed crops, this species-rich group has been largely overlooked in pesticide ...

Comparative Karyotype Analysis of Lycoris aurea Herb Populations Using Fluorochrome Banding and 45S and 5S rDNA-FISH

To understand karyotype variation in eight populations, detailed karyotypes were meticulously established using chromosomal measurements, fluorescence bands, and rDNA FISH signals. The number of 45S rDNA sites varies from one to five pairs per population, with the most common number per karyotype being four pairs. The 45S rDNA locus is predominantly located in the short arms and terminal regions of chromosomes, while the 5S rDNA locus is found mainly in the short arm and the terminal or proximal regions. Populations HBWF, HNXN, HBBD, and HNZX showed a similar distribution of 45S rDNA sites, as did GXTL, HBFC, and SCLS, indicating a close relationship between populations with similar 45S rDNA site distributions. The karyotypes of all studied populations are symmetrical, comprising stable and metastable centromeres or exclusively stable centromeres. Scatter plots of MCA and CVCL effectively distinguish their karyotypic structures. The analysis includes six quantitative parameters (x, 2n, TCL, MCA, CVCL, CVCI). Additionally, the results indicate that PCoA based on these six parameters is a robust method for determining biological karyotype relationships among the eight populations. The chromosome number in Lycoris populations is x = 6-8. Based on the current study and literature, genomic differentiation of these populations is discussed in terms of genome size, heterochromatin, 45S and 5S rDNA sites, and karyotype asymmetry.

This protocol investigates the heterochromatin distribution in eight populations of Lycoris aurea (L&#8242;Her) Herb, using combined PI and DAPI chromosome staining, fluorescence in situ hybridization (FISH) with 18S-5.8-26S rRNA gene regions (45S rDNA regions), and 5S ribosomal DNA probes.

To understand karyotype variation in eight populations, detailed karyotypes were meticulously established using chromosomal measurements, fluorescence ...

Genetik

Evaluating the Effect of Pesticides on the Larvae of the Solitary Bees

Current ecological risk assessments of pesticides on pollinators have primarily considered only laboratory conditions. For the larvae of solitary bees, ingestion of provisions contaminated with pesticides may increase the mortality rate of the larvae, decrease the collection rate and the population of adult solitary bees in the next year from a demographic perspective. But there are limited studies on the effects of pesticides on the larvae of solitary bees. Therefore, understanding how pesticides influence the larvae of solitary bees should be considered an integral part of pesticide ecological risk assessment. This study presents a method to expose the larvae of solitary bee, Osmia excavata, to lethal or sublethal doses of pesticide, tracking larval weight gain, developmental duration, eclosion ability, and food consumption efficiency conversion of ingested food. To demonstrate the effectiveness of this method, the larvae of O. excavata were fed with provisions containing acute lethal and sublethal doses of chlorpyrifos. Then, the above indexes of the treated larvae were investigated. This technique helps to predict and mitigate the risk of pesticides to pollinators.

The present protocol explains a method to feed pesticide-contaminated provisions to the larvae of the solitary bees, Osmia excavata. The procedure examines the ecotoxicity of the pesticide to the larvae of the solitary bees.

Bewertung der Wirkung von Pestiziden auf die Larven der Solitärbienen

Current ecological risk assessments of pesticides on pollinators have primarily considered only laboratory conditions. For the larvae of solitary bees, ...

Biochemie

Establishing Pollination Requirements in Japanese Plum by Phenological Monitoring, Hand Pollinations, Fluorescence Microscopy and Molecular Genotyping

The Japanese plum cultivars commonly grown are interspecific hybrids derived from crosses between the original Prunus salicina with other Prunus species. Most hybrids exhibit gametophytic self-incompatibility, which is controlled by a single and highly polymorphic S-locus that contains multiple alleles. Most cultivated hybrids are self-incompatible and need pollen from a compatible donor to fertilize their flowers. Establishing pollination requirements in Japanese plum is becoming increasingly important due to the high number of new cultivars with unknown pollination requirements. In this work, a methodology for the determination of pollination requirements in Japanese plum-type hybrids is described. Self-(in)compatibility is determined by hand-pollinations in both the field and in the laboratory, followed by monitoring pollen tube elongation with fluorescence microscopy, and also monitoring fruit maturation in the field. Selection of pollinizer cultivars is assessed by combining the identification of S-genotypes by PCR analysis with the monitoring of flowering time in the field. Knowing the pollination requirements of cultivars facilitates the selection of cultivars for the design of new orchards and allows the early detection of productivity problems related with pollination deficiency in established orchards.

A methodology for the determination of pollination requirements in Japanese plum-type hybrids is described, which combines field- and laboratory-pollinations and observations of pollen tubes under the fluorescence microscopy with the identification of S-genotypes by PCR and the monitoring of flowering for the selection of pollinizers.

Ermittlung der Bestäubungsanforderungen in japanischen Pflaumen durch phänologische Überwachung, Handbestäubung, Fluoreszenzmikroskopie und molekulare Genotypisierung

The Japanese plum cultivars commonly grown are interspecific hybrids derived from crosses between the original Prunus salicina with other Prunus species. ...

Entwicklungsbiologie

Deploying Community Scientists to Conduct Nondestructive Genetic Sampling of Rare Butterfly Populations

Global insect declines continue to accelerate. Effective genetic sampling is critically needed to advance the understanding of many taxa and address existing knowledge gaps. This protocol represents a demonstrated method for nondestructively sampling rare butterflies for population genetic structure or DNA barcoding analyses. It uses the chorion of hatched butterfly ovae to yield sufficiently high quantity and quality DNA for successful gene sequencing to confirm species identity and quantify genetic variation. It may be particularly useful when other tissue sampling techniques are impractical or unavailable. While developed for a lepidopteran, it nonetheless could easily be adapted for use with other insect species. It was specifically designed with ease of use as a goal to help maximize broad implementation by individuals of varying experience and skill levels, such as community scientists, conservation practitioners, and students, and for use over large geographic areas to facilitate broad population sampling. The data generated can help inform taxonomic and listing decisions, conservation and management actions, and enhance basic ecological research.

Here, we present a straightforward protocol for noninvasive genetic sampling of butterfly populations based on the field collection of residual egg debris. It can be used to confirm species identity and quantify genetic variation. This protocol can be easily adapted to broader groups for community science involvement.

Einsatz von Community-Wissenschaftlern zur Durchführung zerstörungsfreier genetischer Probenahmen seltener Schmetterlingspopulationen

Global insect declines continue to accelerate. Effective genetic sampling is critically needed to advance the understanding of many taxa and address ...

Determination of Self-(In)compatibility and Inter-(In)compatibility Relationships in Citrus Using Manual Pollination, Microscopy, and S-Genotype Analyses

Citrus uses S-RNase-based self-incompatibility to reject self-pollen and, therefore, requires nearby pollinizer trees for successful pollination and fertilization. However, identifying suitable varieties to serve as pollinizers is a time-consuming process. To solve this problem, we have developed a rapid method for identifying pollination-compatible citrus cultivars that utilizes agarose gel electrophoresis and aniline blue staining. Pollen compatibility is determined based on the identification of S genotypes by extracting total DNA and performing PCR-based genotyping assays with specific primers. Additionally, styles are collected 3-4 days after manual pollination, and aniline blue staining is performed. Finally, the growth status of the pollen tubes is observed with a fluorescence microscope. Pollen compatibility and incompatibility can be established by observing whether the pollen tube growth is normal or suppressed, respectively. Due to its simplicity and cost-effectiveness, this method is an effective tool for determining the pollen compatibility and incompatibility of different citrus varieties to establish incompatibility groups and incompatibility relationships between different cultivars. This method provides information essential for the successful selection of suitable pollinizer trees and, thus, facilitates the establishment of new orchards and the selection of appropriate parents for breeding programs.

Determination of Self-Incompatibility and Inter-Incompatibility Relationships in Citrus Using Manual Pollination, Microscopy, and S-Genotype Analyses

This protocol provides a rapid method for determining pollen compatibility and incompatibility in citrus cultivars.

Bestimmung von Selbst(in)kompatibilitäts- und Inter(in)kompatibilitätsbeziehungen bei Zitrusfrüchten mittels manueller Bestäubung, Mikroskopie und S-Genotyp-Analysen

Citrus uses S-RNase-based self-incompatibility to reject self-pollen and, therefore, requires nearby pollinizer trees for successful pollination and ...

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Künstliche Aufzucht und Schwermetalltoleranz bei Kohl-Weißschmetterlingen

Rearing the Cabbage White Butterfly (Pieris rapae) in Controlled Conditions: A Case Study with Heavy Metal Tolerance

The cabbage white butterfly (Pieris rapae) is an important system for applied pest control research and basic research in behavioral and nutritional ecology. Cabbage whites can be easily reared in controlled conditions on an artificial diet, making them a model organism of the butterfly world. In this paper, a manipulation of heavy metal exposure is used to illustrate basic methods for rearing this species. The general protocol illustrates how butterflies can be caught in the field, induced to lay eggs in greenhouse cages, and transferred as larvae to artificial diets. The methods show how butterflies can be marked, measured, and studied for a variety of research questions. The representative results give an idea of how artificial diets that vary in components can be used to assess butterfly performance relative to a control diet. More specifically, butterflies were most tolerant to nickel and least tolerant to copper, with a tolerance of zinc somewhere in the middle. Possible explanations for these results are discussed, including nickel hyper-accumulation in some mustard host plants and recent evidence in insects that copper may be more toxic than previously appreciated. Finally, the discussion first reviews variations to the protocol and directions for troubleshooting these methods, before considering how future research might further optimize the artificial diet used in this study. Overall, by providing a detailed video overview of the rearing and measurement of cabbage whites on artificial diets, this protocol provides a resource for using this system across a wide range of studies.

Autor im Rampenlicht: Untersuchung der Toleranz von Kohlschmetterlingen gegenüber städtischen Schadstoffen 

This paper presents a detailed protocol for rearing the cabbage white butterfly in controlled lab conditions with an artificial diet, which allows precise manipulations of early-life nutrition and toxin exposure. The representative results show how heavy metal toxicity can be assayed with this protocol.

Aufzucht des Kohlweißlings (Pieris rapae) unter kontrollierten Bedingungen: Eine Fallstudie mit Schwermetalltoleranz

The cabbage white butterfly (Pieris rapae) is an important system for applied pest control research and basic research in behavioral and nutritional ...

Feldexperimente von Bestäubungsökologie: Der Fall

Zusammenfassung

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Verfahren für Kreuze in