Diese Technik kann den S-Genotyp effizient identifizieren und die Selbstinkompatibilität von Zitrusfrüchten genau identifizieren, wodurch die notwendigen Informationen für die Auswahl geeigneter Bestäuberbäume bereitgestellt werden. Dies ist eine zeiteffiziente, einfache und zuverlässige Technik, um die geeigneten Elternbäume in Zuchtprogrammen auszuwählen. Diese Technik ist einfach und leicht durchzuführen und das Experimentieren zum ersten Mal erfordert Geduld und Sorgfalt.
Die Identifizierung des S-Genotyps und das S-spezifische Primerdesign erfordern mehr Aufmerksamkeit und Sorgfalt. Das Verfahren wird von Yu Hu, einem Master-Doktoranden aus meinem Labor, demonstriert. Beginnen Sie mit dem Sammeln von Pollen, indem Sie die Blüten der Majia pomelo, Citrus maxima, ins Labor bringen.
Sammeln Sie die Staubbeutel mit einer Pinzette und legen Sie sie in eine Petrischale mit Filterpapier. Trocknen Sie die Pollenkörner, indem Sie die Petrischale mit den Staubbeuteln für 24 Stunden in einen 28 Grad Celsius heißen Ofen stellen. Bewahren Sie die Pollen nach dem Trocknen in einem luftdichten Micro Centron-Zip-Lock-Beutel mit farbwechselndem Kieselgel auf.
Verschließen Sie den Beutel und beschriften Sie den Beutel mit dem Namen der Pollensorte und dem Datum der Lagerung. Gießen Sie 300 Mikroliter des flüssigen Mediums in die Kappe eines Zwei-Milliliter-Zentrifugenröhrchens und streuen Sie den Pollen mit Hilfe einer Bestäubungsbürste gleichmäßig ein. Legen Sie den Pollen in eine befeuchtete Blackbox und inkubieren Sie ihn 12 Stunden lang bei 28 Grad Celsius.
Schneiden Sie nach der Inkubation die oberste Ein-Millimeter-Spitze von einer 1.000-Mikroliter-Pipettenspitze ab und saugen Sie den Pollen mit einer kleinen Menge Kulturlösung ab. Platzieren Sie den Pollen in der Mitte des Objektträgers und decken Sie ihn mit einem Deckglas ab. Wenn Sie fertig sind, beobachten Sie die Probe mit einem inversen Mikroskop mit einem 10-fachen Objektiv.
Führen Sie drei unabhängige Replikate durch, wobei für jedes Replikat ungefähr die gleiche Pollendichte verwendet wird. Verwenden Sie für die Bestäubung eine Bestäubungsbürste, um eine ausreichende Menge lebensfähiger Pollen auf der Oberfläche der Narbe zu verteilen und darauf zu achten, dass der Stempel nicht beschädigt wird. Decken Sie die bestäubten Blüten mit einer Sulfat-Papiertüte ab und verhindern Sie die Bestäubung durch genotypisch unterschiedliche Pollen, indem Sie die Tüte mit einer Büroklammer verschließen.
Schreiben Sie den Namen der Art sowie die Anzahl und den Zeitpunkt der Bestäubung auf das Etikett. Hängen Sie das Etikett an die Zweige in der Nähe der bestäubten Blüten. Entfernen Sie die Bestäubungsbeutel etwa drei bis vier Tage nach der Bestäubung und sammeln Sie die bestäubten Blüten in Zip-Lock-Beuteln.
Entfernen Sie sofort die Blütenblätter, Gefäße und Eierstöcke von den Blüten und tauchen Sie die Narbe, die zum Stil verschmolzen ist, in ein Zentrifugenröhrchen mit einer frisch zubereiteten Fixierlösung. Die Narbe inkubieren und über Nacht bei vier Grad Celsius in der Fixierlösung stylen. Entsorgen Sie am nächsten Tag die Fixierlösung, bevor Sie die Narbe waschen, und stylen Sie sie zwei- bis dreimal in 95%igem Ethanol.
Fügen Sie dann 70%ige Ethanollösung zum Stil hinzu und stellen Sie sicher, dass die Probe vollständig in die Lösung eingetaucht ist. Die Styles können zu diesem Zeitpunkt ein bis zwei Monate bei vier Grad Celsius gelagert werden. Für die Anilinblaufärbung waschen Sie die in 70%igem Ethanol gelagerten Stilproben drei- bis viermal mit destilliertem Wasser.
Tauchen Sie es in eine viermolare Natronlauge und versiegeln Sie es, bevor Sie es 60 Minuten lang in einem Wasserbad bei 65 Grad Celsius inkubieren. Während dieses Schritts ändert sich die Farbe des Stils von gelb-weiß zu orange-rot. Als nächstes tränken Sie die Stile in destilliertem Wasser.
Entsorgen Sie nach 30 Minuten das destillierte Wasser und waschen Sie die Stile drei- bis viermal mit destilliertem Wasser oder bis die Farbe des Stils gelb wird. Fügen Sie dann das Anilinblau hinzu, bis die Probe eingetaucht ist, und inkubieren Sie es 12 Stunden lang im Dunkeln. Beobachten Sie das Wachstum der Pollenschläuche unter dem Fluoreszenzmikroskop.
Legen Sie die Folie auf einen flachen Tisch. Teilen Sie den Stil entlang der Längsachse mit einem Skalpell in zwei Hälften. Legen Sie eine Hälfte des Stils auf einen Glasobjektträger und geben Sie zwei bis drei Tropfen Polyethylenglykol auf die Oberfläche des Objektträgers.
Decken Sie es dann mit einem Deckglas ab. Wenn Sie fertig sind, legen Sie den Objektträger auf den Mikroskoptisch über der Blende und visualisieren Sie ihn mit einem 10-fachen Objektiv. Verwenden Sie den DAPI-Filter und beobachten Sie das Wachstum der Pollenschläuche.
Beobachten Sie fünf Stile für jede Art der Bestäubung. Die Pollenlebensfähigkeit von Citrus maxima und die Keimraten wurden mittels Fluoreszenzmikroskopie quantifiziert. Der kompatible Pollen keimte erfolgreich auf der Oberfläche der Narbe und produzierte einen normalen Pollenschlauch, der wuchs und schließlich zur Befruchtung im Eierstock führte.
Im Gegensatz dazu wuchsen inkompatible Pollenschläuche durch etwa 2/3 des Stils und hörten dann auf zu wachsen. Die Agarose-Gelelektrophorese detektierte das DNA-Produkt, das mit den S-Locus-spezifischen Primern amplifiziert wurde. Es zeigte sich die Amplifikation des DNA-Produkts zwischen 500 und 1.000 Basenpaaren.
Der entsprechende S-Genotyp wurde identifiziert. Mit dieser Methode wurden 21 S-Haplotypen in verschiedenen Zitrusarten identifiziert. Der Bestäubungsschritt ist entscheidend.
Nur die erfolgreiche Bestäubung kann die spätere Beobachtung der Pollenschläuche gewährleisten. Die Technik wurde verwendet, um die Merkmale der Selbstinkompatibilität zu analysieren und die weiblichen Determinanten der Selbstinkompatibilität zu erforschen und zu identifizieren. Diese Methode ist wichtig für die Selbstinkompatibilitätsforschung und Zuchtprogramme.
Es kann auch die Landwirte bei der Auswahl von Bestäuberbäumen für ihre Obstgärten unterstützen.
