The authors thank the three anonymous reviewers for their helpful comments on the manuscript. This work was partly supported by Grant-in-Aid for JSPS Fellows (26.11613).

NOTA: Este artigo é baseado em nosso trabalho anterior 30. Algumas partes são reimpressas com permissão da Sociedade Botânica do Japão e Springer Japão. 1. Observação de flores Visitantes <ol><li> Seleção dos Campos de observação <ol><li> Pesquisar as áreas onde os materiais vegetais são distribuídos, e selecionar os locais de estudo candidato usando recursos confiáveis, tais como livros ilustrados, revistas acadêmicas, etc. Ajuste o número de locais de estudo para atender os objetivos da pesquisa (por exemplo, uma grande variedade de locais para a comparação dos visitantes florais em todo o Japão). </li><li> Confira os locais das populações candidatos selecionados e as distâncias de pontos de partida relevantes, tais como institutos de pesquisa e acomodações, se for necessária investigação a longo prazo. </li><li> Estimar grosseiramente cada tamanho da população por contagem do número de indivíduos de plantas numa área de unidade. Escolha grandes populações para a experiência manipuladas usando muitos indivíduos de plantas. </li><li> Pré-observação dos visitantes florais <ol><li> Decidir que têm como alvo indivíduos em cada área será observado durante o mesmo intervalo de tempo, dependendo das densidades populacionais. Escolha 5-10 flores recém-abertas ou quebrando botões como flores-alvo, e rejeitar aqueles degradadas que já abriram. </li><li> Comece a observação visual para o período de um dia inteiro, porque as flores pode ser visitado por vários polinizadores em tempo diferentes gamas 31,32. </li><li> Nas folhas de registo, gravar o nome da espécie dos visitantes florais eo tempo de cada visita por hora por flor. </li><li> Observar atentamente se os visitantes florais tocar as anteras e / ou estigmas; se o fizerem, gravar os visitantes como polinizadores. Se os visitantes florais só visitar as flores e não toque os órgãos reprodutivos, gravá-los como visitantes. </li><li> Usando uma rede de insetos ou aspirador feitos à mão, capturar os visitantes florais para identificar epreservá-los como espécimes (Figura 1F). Mate os visitantes presas rapidamente com acetato de etilo ou a pressão dos dedos no tórax, e preservá-los em um saco macio ou em um tubo de plástico ou caso com 100% de etanol. </li><li> Após a observação, identificar os nomes específicos de amostras utilizando características morfológicas ou, em caso de dificuldades na identificação, solicitar a ajuda de especialistas para cada grupo taxonômico. </li></ol></li></ol></li><li> Observação no Campo <ol><li> Escolha sites de pesquisa com base na sua acessibilidade, o tamanho da população e número de visitantes florais. Escolha períodos de tempo que incluem uma amostra representativa dos visitantes florais na época de floração, e determinar os períodos de observação com base em objectivos de investigação (por exemplo, para a pesquisa sobre flutuações visitação frequência de visitantes florais, longos períodos de tempo deve ser definido). </li><li> Prepare o equipamento de gravação adequado, tais como câmeras de vídeo digitais (por exemplo, para a gravação noite, câmeras de vídeo com uma função de infravermelho devem ser usados). </li><li> Seleccionar as flores alvo da mesma maneira como para 1.1.4. </li><li> Fixar as câmeras de vídeo para tripés de alumínio. Defina as câmeras com tripés na frente dos indivíduos visados, aproximadamente 50 cm de distância. </li><li> Verificar e modificar a quantidade de luz eo foco dos materiais a tela mostra das câmeras antes de filmar. </li><li> Comece a observação visual e filmagens de vídeo ao mesmo tempo para os fusos horários apropriados estimados pelo pré-observações (no caso em apreço, com períodos de observação por mais de seis horas, em média, de aproximadamente 5:00-13:00 pm ). </li><li> Identificar os nomes das espécies dos visitantes e polinizadores, e gravar os seus nomes e os tempos de suas visitas nas folhas de registo. </li><li> Capturar e identificar os visitantes e polinizadores da mesma maneira como em 1.1.4.5. </li><li> Repita os passos 1.2.1 a 1.2.7 para cada observatioperíodo n. Defina os períodos de observação com base nos objetivos da pesquisa e os dados pré-observação. </li></ol></li><li> Análise de Dados Depois de Observação <ol><li> Identificar os nomes de espécies de espécimes capturados após a observação de polinizadores, da mesma forma como em 1.1.4.6. </li><li> Verifique os clipes de vídeo e anote os nomes de espécies e seus tempos visita da mesma forma como para a observação visual. </li><li> Calcular as frequências de visitação por flor por hora de cada visitante floral a partir dos dados de observação e gravação de vídeo visuais. Compare estas freqüências estatisticamente entre os locais e anos de cada visitante utilizando métodos estatísticos adequados com base em estatísticas fundamentais e usando o software adequado, tais como R, SPSS, e / ou SAS 33-35 (por exemplo, uma análise de duas vias de variância (ANOVA ) com o teste de Tukey honesto diferença significativa (HSD) em software R). </li></ol></li></ol> 2. Ensacamento e Cage Experimentos<ol><li> Os preparativos para o ensacamento e Experiências gaiola <ol><li> Para os experimentos de ensacamento, preparar sacos que têm tamanhos de malha pequenas (~ 0,5-1 mm) e usá-los para evitar completamente flor visitação (por exemplo, não-tecidos sacos de tecido foram utilizados para os experimentos de ensacamento em 2011 e 2012). </li><li> Para os experimentos de gaiola, prepare fio ou malha de plástico placas com um diâmetro que permite aos visitantes o alvo mais pequenos para passar através mas exclui os maiores, e conectar-se estas placas de malha para formar uma gaiola. Assegure-se que não existem lacunas maiores do que o diâmetro da malha. Ajustar o tamanho e a forma de gaiolas com base nas espécies de plantas alvo e números individuais. </li></ol></li><li> Experimentos de ensacamento <ol><li> Selecione 30 indivíduos por tratamento que não têm danos causados ​​por herbívoros ou de um ambiente severo. Para o tratamento, escolher uma única flor de cada planta individual ou usar flores individuais em uma única planta. </li><li> saco tele alvo flores no campo após rotulando-os com fita adesiva (número de série e do alfabeto; Figura 1 g). Tenha cuidado para não tocar as anteras ou os estigmas dentro dos sacos para evitar a possibilidade de auto-polinização. </li><li> Cuidadosamente corrigir sacos para as flores usando uma corda suave ou fio (Figura 1d). </li><li> definir com cuidado flores individuais na posição vertical com suportes usando a corda suave ou fio para apoiar os indivíduos contra inclinação ou o colapso sob o peso dos sacos ou o vento, se necessário. Torcer ou enrolar um fio ou arame suavemente em torno da haste de uma pessoa alvo, de modo a não criar danos. </li><li> Tratamentos em experimentos de ensacamento <ol><li> Para o tratamento &quot;Control&quot;, anexar os rótulos para as flores alvo e realizar nenhum tratamento. Permitir que os visitantes florais de visitar livremente. </li><li> Para o tratamento &quot;de cruzamento&quot;, cobrem os seus botões até que eles flor, e em seguida, remover as anteras das flores ensacadas. Ponha um pouco de Pollen grãos de vários indivíduos sobre os estigmas. </li><li> Para o tratamento &quot;Selfing&quot;, cobrem os seus botões até que as flores abertas, e colocar pólen das mesmas flores em sua estigmas. Cobrir estas flores tratados novamente. </li><li> Para o tratamento &quot;Auto-auto&quot;, cobrir os botões com os sacos até o final do período de floração. </li><li> Para o tratamento &quot;bud Partir&quot;, identificar os botões de quebra que foram visitados e observar a entrada ou saída de pequenas abelhas (Figuras 1b, c). Retirar as anteras dos botões quebrando para evitar deposições de pólen repetida na mesma flor depois de visitação por pequenas abelhas, e saco estes botões rapidamente para evitar mais visitas. </li><li> Para o tratamento &quot;floração&quot;, saco dos botões até a etapa de abertura para evitar visitações na fase de quebra-bud. Depois disso, retire os sacos e permitir que os visitantes para coletar néctar e pólen. </li><li> Para o tratamento &quot;Bud&quot;,remover as anteras de botões fechados e outcross-los artificialmente. Saco estes botões rapidamente para evitar visitas de flores. </li></ol></li></ol></li><li> Experimentos gaiola <ol><li> Cobrir os indivíduos planta alvo com gaiolas preparadas. Ajustar as posições de flores enjaulados à mão para evitar deposições de contato e de pólen entre estigmas diferente (Figura 1e). </li><li> Para o tratamento &quot;Cage&quot;, selecionar os indivíduos com botões fechados e colocar rótulos sobre eles para a identificação de flores selecionadas. Gaiola os indivíduos com botões marcados para rejeitar as influências desde antes da criação de gaiolas (ou seja, insectos florais não pode visitar botões fechados, e apenas os efeitos de insetos que visitam após a colocação de gaiolas pode ser estimado). </li><li> Prenda as gaiolas firmemente no chão usando postes de ferro para impedir a entrada de visitantes entre a base gaiola e no chão. </li></ol></li><li> Análise de Dados After o ensacamento e Experiências gaiola <ol><li> Recolha todas as flores marcados no final do período de floração (Figura 1 g) por corte e separando-os dos indivíduos maternos. Preservar cada amostra marcada separadamente para evitar a sua contaminação. </li><li> Verificar a presença ou ausência de frutificação em cada rotulados flower.Record os números de sementes de cada fruta em caso de configuração de frutas. </li><li> Calcular a proporção de número de frutos por flor (proporção definida de frutos, definida como o número de frutas, dividido pelo número de flores) e do número de sementes por fruto maduro (razão de semente-conjunto, definido como o número de sementes dividido pelo número de óvulos) usando todos os números gravados. </li><li> Estatisticamente comparar os rácios de fruto e semente-estabelecidas entre os tratamentos, utilizando métodos adequados e software, tais como os enumerados no 1.3.3 (por exemplo, one-way ANOVA com HSD de Tukey ou teste exato de Fisher no software R 33). </li><li> As investigações sobre os materiais, utilizando os resultados das experiências de ensacamento <ol><li> Para testar a necessidade de animais polinizadores, estatisticamente comparar os resultados entre &quot;Control&quot; e &quot;Auto-auto&quot; tratamentos. </li><li> Para estimar o grau de limitação de pólen, compare o &quot;Control&quot; e &quot;tratamentos de fecundação cruzada&quot;. </li><li> Para testar a auto-compatibilidade, compare o &quot;Outcrossing&quot; e tratamentos &quot;autofecundação&quot;. </li></ol></li><li> As avaliações das influências do quebra-bud polinização <ol><li> Compare o &quot;controle&quot; e tratamentos &quot;botão&quot; para determinar se os estigmas das gemas quebrando são reprodutivamente maduros e se o valor do tratamento &quot;Control&quot; pode ser usado para o controle na fase de quebra-bud. </li><li> Compare o &quot;Auto-auto&quot; e tratamentos &quot;Quebrando Bud&quot; para determinar se o sucesso reprodutivo de flores polinizadas com pequenas abelhas na quebrafase -bud é estatisticamente maior do que o das plantas que executam autogamia (isto é, para testar a existência de polinização quebrar broto-). Depois disso, comparar esses dois tratamentos com o &quot;Control&quot; para estimar as eficiências de polinização de polinização quebra-bud. </li><li> Compare o &quot;Breaking bud&quot;, &quot;Gaiola&quot;, e &quot;&quot; tratamentos de floração para estimar as influências reprodutivas de polinização quebra-bud. </li></ol></li></ol></li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

observações de flores e experimentos ensacamento foram empregados neste estudo para revelar as frequências de visitação e o sucesso reprodutivo feminino de plantas, respectivamente. Em Dafni (1992) 38, o método videotape foi eficaz porque poderia gravar o momento ea duração de visitantes para análise e evitar viés do observador. No entanto, no momento, este método necessário equipamento caro, e os tempos de observação foram limitados pela vida útil da bateria. Recentemente, o custo do equipamen...

interações planta-polinizador são exemplos para o estudo da biologia evolutiva e ecologia. As relações mutualistas entre flores e polinizadores são pensados para ter promovido a diversificação das angiospermas 1,2 como resultado da seleção natural, embora outros fatores bióticos e abióticos também exerceram influência 3,4,5. Pensa-se também que os traços florais foram alterados para se adaptar aos polinizadores mais eficazes e para produzir mais frutos e sementes 6. Estas crenças foram construídos embora grandes estudos com base em diferentes índices, como a eficácia da polinização, que envolvem várias interpretações 7. Plantas com flores que têm generalizadas sistemas de polinização são visitados por vários tipos de polinizadores 8. Aqui, um visitante flor foi definida como uma espécie animal que visitaram para obter uma recompensa floral e polinizadores foram definidos como visitantes florais que polinizam.Alguns desses visitantes transportar grãos de pólen da mesma espécie para os estigmas das flores visitadas e podem ser classificadas como polinizadores. Outros visitantes também podem ter algum pólen intra-específica; eles podem conduzir a menos de polinização devido a desajustes comportamentais ou morfológicas entre os polinizadores e as flores. Estas diferenças comparáveis na contribuição para a reprodução da planta poderia produzir diferentes graus de pressão seletiva sobre características florais 9 e pode causar a divergência adaptativa das plantas com flores. Portanto, embora a composição da comunidade de polinizadores ea abundância das espécies relativa são importantes 10, a avaliação precisa da eficácia de cada visitante também é fundamental para determinar a adaptação e / ou processos evolutivos das plantas. Neste estudo, as estimativas quantitativas da eficiência dos polinizadores, definida como a produção de frutas e sementes por freqüência de visitas, foram determinados 11. a especificaçãoForam observadas ies e frequência de cada visitante floral, e foram estimados os efeitos reprodutivos nas flores visitadas. A gravação de visitas florais através de observações humanos é um método clássico em ecologia da polinização. No entanto, este método aplica uma grande carga sobre os observadores, que são obrigados a permanecer em frente das plantas e para tomar medições cuidadosas, a longo prazo. Recentemente, as tecnologias de filmagem e gravação têm se desenvolvido rapidamente, e câmeras de vídeo digital de baixo custo permitiram a introdução de gravação de vídeo para observações polinizadores 12,13. Estes métodos podem facilitar a recolha de informações básicas sobre os visitantes florais e poderia ajudar a desenvolver uma compreensão da ecologia da polinização de uma espécie de planta alvo. No entanto, as frequências de visita dos polinizadores não estão necessariamente correlacionados com a sua eficácia polinização 7,14, e é importante para avaliar os efeitos qualitativos de cada polinizadorsobre a aptidão flor. Efetividade da polinização foi estimado através do número de grãos de pólen sobre os estigmas 15,16, 17,18 crescimento do tubo polínico e frutas e / ou produção de sementes 19,20. Ensacamento experimentos, conduzidos utilizando sacos de visitante exclusivo, são os métodos típicos para testar auto-compatibilidade, autogamia 21,22, ea presença de apomixia 23. Além disso, a avaliação da eficácia da polinização por um determinado polinizador na assemblage visitante tem sido frequentemente realizado em ambientes onde outros visitantes florais foram limitados (ou seja, uma gaiola de arame, rede, ou um saco com uma malha pequena o suficiente para excluir polinizadores maiores, que é set em plantas com flores). Por exemplo, experiências de ensacamento com pequenos sacos de malha foram conduzidos para revelar a capacidade polinização das formigas ou tripes 24,25. Além disso, as experiências de exclusão pássaro usando uma gaiola de arame ou rede têm mostrado os polinizadores efetivos da taxa Aloe26-28. Os objetivos deste estudo foram: 1) para introduzir os métodos utilizados em trabalho anterior e 2) para melhorar estes métodos para o uso geral em outros estudos sobre os visitantes florais, as suas frequências de visita, e seus efeitos sobre a aptidão da planta Lycoris sanguinea var.. sanguinea é uma das espécies incluídas no gênero Lycoris, que é distribuído amplamente em todo o Japão e por pouco na Coreia 29 e tem em forma de funil laranja-avermelhado flores (Figura 1a). Um estudo anterior revelou que L. sanguinea var. sanguinea foi visitada por várias espécies de insetos, incluindo um não identificadas espécies de abelhas pequenas e as espécies maiores Amegilla florea 29. No entanto, não foram identificados a frequências de visitação e polinização eficácia destes visitantes. observações de polinizadores para a identificação de visitantes florais foram realizadas em primeiro lugar. Visitação por pequenas abelhas foi OBSErved em flores que não tinha ainda completamente abertos (quebrar gomos; Figuras 1b, c). Pequenas abelhas mudou rapidamente em torno das anteras undehisced nos botões da quebra e recolhido pólen usando suas mandíbulas. A hipótese foi de que as abelhas pequenas poderia ser polinizadores na fase de quebra-bud porque os intervalos entre as anteras e o estigma nas flores foram menores do que o comprimento do corpo das abelhas. Portanto, as experiências foram conduzidas de ensacamento para testar a capacidade de polinização das abelhas pequenas na fase de quebra-gema, e, adicionalmente, para examinar as estratégias de reprodução de L. sanguinea var. sanguinea. Estes botões foram ensacados após as pequenas abelhas visitados, o que permitiu uma estimativa da capacidade de polinização das abelhas. Os indivíduos foram enjaulado com botões fechados. Uma pequena gaiola de malha foi usada, através do qual apenas pequenas abelhas poderia passar, permitindo uma estimativa da eficiência de polinização de abelhas pequenas ao longo de todo o floestágio anel.

<table><tbody><tr><td>recording sheet</td><td>any</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>insect net</td><td>any</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>pooter</td><td>any</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>ethyl acetate</td><td>any</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>100% Ethanol</td><td>any</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>plastic tube</td><td>any</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>plastic case</td><td>any</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>soft bag</td><td>any</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>digital video camera(s)</td><td>any</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>tripod(s)</td><td>any</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>bags</td><td>any</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>wire or plastic mesh boards</td><td>any</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>iron wires</td><td>any</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>labeling tape</td><td>any</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>stick supporters</td><td>any</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>soft strings or wire</td><td>any</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>pincette(s)</td><td>any</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

field experiments of pollination ecology: the case of lycoris sanguinea var. sanguinea

Plant-pollinator interactions have been studied for approximately one hundred years. During that time, many field methods have been developed to clarify the pollination effectiveness of each pollinator for visited flowers. Pollinator observations have been one of the most common methods to identify pollinators, and bagging and cage experiments have been conducted to show the effectiveness of specific pollinators. In a previous study of Lycoris sanguinea var. sanguinea, its effective pollinators, the visitation frequencies of each floral visitor, and its reproductive strategies were not identified. This study reports the observation that small bees visited flowers that were partially opened (breaking buds). To the best of our knowledge, this phenomenon has not been reported previously. Further, this study investigates the hypothesis that small bees can pollinate at that flowering stage. This study demonstrates the basic methods of field experiments in pollination ecology using L. sanguinea var. sanguinea. Pollinator observations and digital video showed the visitation frequencies of each floral visitor. Bagging and cage experiments revealed that these flowers could be pollinated fully and that breaking-bud pollination could be important for the pollination of this plant species. The advantages and disadvantages of each method are discussed, and recent developments, including laboratory experiments, are described.

Cinco populações foram selecionados para observações polinizadores. Na fase de pré-observação, visitas de várias espécies de insetos a flores de abertura e pequenas abelhas ao gomos quebrando foram confirmados. Observações florais visitante revelou que a maioria dos visitantes para todos os cinco locais de estudo eram indivíduos de pequenas espécies de abelhas japonicum Lasioglossum. O registo total de visita mostrou que os rácios de visita desta espécie foram mai...

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Field Experiments of Pollination Ecology: The Case of Lycoris sanguinea var. sanguinea

Para revelar a eficácia polinizador de uma determinada espécie de planta, foram desenvolvidos vários métodos de experimentos de campo. Este estudo demonstra os métodos básicos de experimentos de campo para a ecologia da polinização usando o estudo de caso de Lycoris sanguinea var. Sanguinea e do romance mecanismo de polinização, quebrando-bud polinização.

Experimentos de campo de Ecologia da polinização: o caso da<em&gt; Sanguinea de Lycoris</em&gt; Var.<em&gt; sanguinea</em

Plant-pollinator interactions have been studied for approximately one hundred years. During that time, many field methods have been developed to clarify ...

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Field Experiments of Pollination Ecology: The Case of Lycoris sanguinea var. sanguinea

11.4K visualizações.  Chiba University.  Para revelar a eficácia polinizador de uma determinada espécie de planta, foram desenvolvidos vários métodos de experimentos de campo. Este estudo demonstra os métodos básicos de experimentos de campo para a ecologia da polinização usando o estudo de caso de Lycoris sanguinea var. Sanguinea e do romance mecanismo de polinização, quebrando-bud polinização. 

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Methods for Performing Crosses in Setaria viridis, a New Model System for the Grasses

Setaria viridis is an emerging model system for C4 grasses. It is closely related to the bioenergy feed stock switchgrass and the grain crop foxtail millet. Recently, the 510 Mb genome of foxtail millet, S. italica, has been sequenced 1,2 and a 25x coverage genome sequence of the weedy relative S. viridis is in progress. S. viridis has a number of characteristics that make it a potentially excellent model genetic system including a rapid generation time, small stature, simple growth requirements, prolific seed production 3 and developed systems for both transient and stable transformation 4. However, the genetics of S. viridis is largely unexplored, in part, due to the lack of detailed methods for performing crosses. To date, no standard protocol has been adopted that will permit rapid production of seeds from controlled crosses.
The protocol presented here is optimized for performing genetic crosses in S. viridis, accession A10.1. We have employed a simple heat treatment with warm water for emasculation after pruning the panicle to retain 20-30 florets and labeling of flowers to eliminate seeds resulting from newly developed flowers after emasculation. After testing a series of heat treatments at permissive temperatures and varying the duration of dipping, we have established an optimum temperature and time range of 48 &deg;C for 3-6 min. By using this method, a minimum of 15 crosses can be performed by a single worker per day and an average of 3-5 outcross progeny per panicle can be recovered. Therefore, an average of 45-75 outcross progeny can be produced by one person in a single day. Broad implementation of this technique will facilitate the development of recombinant inbred line populations of S. viridis X S. viridis or S. viridis X S. italica, mapping mutations through bulk segregant analysis and creating higher order mutants for genetic analysis.

Methods for Performing Crosses in Setaria viridis, a New Model System for the Grasses

We have developed a methodology for performing crosses in Setaria viridis (S. viridis). The method involves pruning the panicle prior to a hot water treatment to kill viable pollen. Crosses are performed following a well-controlled growth regime and typically result in the recovery of 1 to 7 cross-pollinated seed/s per panicle.

Métodos para a realização Cruzes em<em&gt; Setaria viridis</em&gt;, Um novo sistema de modelo para as gramíneas

Setaria viridis is an emerging model system for C4 grasses. It is closely related to the bioenergy feed stock switchgrass and the grain crop foxtail ...

Ambiente

Administering and Detecting Protein Marks on Arthropods for Dispersal Research

Monitoring arthropod movement is often required to better understand associated population dynamics, dispersal patterns, host plant preferences, and other ecological interactions. Arthropods are usually tracked in nature by tagging them with a unique mark and then re-collecting them over time and space to determine their dispersal capabilities. In addition to actual physical tags, such as colored dust or paint, various types of proteins have proven very effective for marking arthropods for ecological research. Proteins can be administered internally and/or externally. The proteins can then be detected on recaptured arthropods with a protein-specific enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Here we describe protocols for externally and internally tagging arthropods with protein. Two simple experimental examples are demonstrated: (1) an internal protein mark introduced to an insect by providing a protein-enriched diet and (2) an external protein mark topically applied to an insect using a medical nebulizer. We then relate a step-by-step guide of the sandwich and indirect ELISA methods used to detect protein marks on the insects. In this demonstration, various aspects of the acquisition and detection of protein markers on arthropods for mark-release-recapture, mark-capture, and self-mark-capture types of research are discussed, along with the various ways that the immunomarking procedure has been adapted to suit a wide variety of research objectives.

Proteins are often used to mark arthropods for dispersal research. Methods for administering internal and external protein marks on arthropods are demonstrated. Protein mark detection techniques, either through indirect or sandwich enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs), are also illustrated.

Administrando e Detecção de Marcas de proteína em artrópodes para a dispersão de Pesquisa

Monitoring arthropod movement is often required to better understand associated population dynamics, dispersal patterns, host plant preferences, and other ...

Choice and No-Choice Assays for Testing the Resistance of A. thaliana to Chewing Insects

Larvae of the small white cabbage butterfly are a pest in agricultural settings. This caterpillar species feeds from plants in the cabbage family, which include many crops such as cabbage, broccoli, Brussel sprouts etc. Rearing of the insects takes place on cabbage plants in the greenhouse. At least two cages are needed for the rearing of Pieris rapae. One for the larvae and the other to contain the adults, the butterflies. In order to investigate the role of plant hormones and toxic plant chemicals in resistance to this insect pest, we demonstrate two experiments. First, determination of the role of jasmonic acid (JA - a plant hormone often indicated in resistance to insects) in resistance to the chewing insect Pieris rapae. Caterpillar growth can be compared on wild-type and mutant plants impaired in production of JA. This experiment is considered "No Choice", because larvae are forced to subsist on a single plant which synthesizes or is deficient in JA. Second, we demonstrate an experiment that investigates the role of glucosinolates, which are used as oviposition (egg-laying) signals. Here, we use WT and mutant Arabidopsis impaired in glucosinolate production in a "Choice" experiment in which female butterflies are allowed to choose to lay their eggs on plants of either genotype. This video demonstrates the experimental setup for both assays as well as representative results.

Plant resistance to chewing insect herbivores can be tested in several ways. Here, we demonstrate how to set-up a choice and a no-choice experiment with the model plant Arabidopsis thaliana to identify resistance against the pest species Pieris rapae.

Escolha e No-Choice ensaios para testar a resistência de A. thaliana para Insetos Chewing

Larvae of the small white cabbage butterfly are a pest in agricultural settings. This caterpillar species feeds from plants in the cabbage family, which ...

Biologia

In Vitro Rearing of Solitary Bees: A Tool for Assessing Larval Risk Factors

Although solitary bees provide crucial pollination services for wild and managed crops, this species-rich group has been largely overlooked in pesticide regulation studies. The risk of exposure to fungicide residues is likely to be especially high if the spray occurs on, or near host plants while the bees are collecting pollen to provision their nests. For species of Osmia that consume pollen from a select group of plants (oligolecty), the inability to use pollen from non-host plants can increase their risk factor for fungicide-related toxicity. This manuscript describes protocols used to successfully rear oligolectic mason bees, Osmia ribifloris sensu lato, from egg to prepupal stage within cell culture plates under standardized laboratory conditions. The in vitro-reared bees are subsequently used to investigate the effects of fungicide exposure and pollen source on bee fitness. Based on a 2 &#215; 2 fully crossed factorial design, the experiment examines the main and interactive effects of fungicide exposure and pollen source on larval fitness, quantified by prepupal biomass, larval developmental time, and survivorship. A major advantage of this technique is that using in vitro-reared bees reduces natural background variability and allows the simultaneous manipulation of multiple experimental parameters. The described protocol presents a versatile tool for hypotheses testing involving the suite of factors affecting bee health. For conservation efforts to be met with significant, lasting success, such insights into the complex interplay of physiological and environmental factors driving bee declines will prove to be critical.

In Vitro Rearing of Solitary Bees: A Tool for Assessing Larval Risk Factors

Fungicide sprays on flowering plants may expose solitary bees to high concentrations of pollen-borne fungicide residues. Using laboratory-based experiments involving in vitro-reared bee larvae, this study investigates the interactive effects of consuming fungicide-treated pollen derived from host and non-host plants.

In Vitro Criação de abelhas solitárias: uma ferramenta para avaliar os fatores de risco Larval

Although solitary bees provide crucial pollination services for wild and managed crops, this species-rich group has been largely overlooked in pesticide ...

Comparative Karyotype Analysis of Lycoris aurea Herb Populations Using Fluorochrome Banding and 45S and 5S rDNA-FISH

To understand karyotype variation in eight populations, detailed karyotypes were meticulously established using chromosomal measurements, fluorescence bands, and rDNA FISH signals. The number of 45S rDNA sites varies from one to five pairs per population, with the most common number per karyotype being four pairs. The 45S rDNA locus is predominantly located in the short arms and terminal regions of chromosomes, while the 5S rDNA locus is found mainly in the short arm and the terminal or proximal regions. Populations HBWF, HNXN, HBBD, and HNZX showed a similar distribution of 45S rDNA sites, as did GXTL, HBFC, and SCLS, indicating a close relationship between populations with similar 45S rDNA site distributions. The karyotypes of all studied populations are symmetrical, comprising stable and metastable centromeres or exclusively stable centromeres. Scatter plots of MCA and CVCL effectively distinguish their karyotypic structures. The analysis includes six quantitative parameters (x, 2n, TCL, MCA, CVCL, CVCI). Additionally, the results indicate that PCoA based on these six parameters is a robust method for determining biological karyotype relationships among the eight populations. The chromosome number in Lycoris populations is x = 6-8. Based on the current study and literature, genomic differentiation of these populations is discussed in terms of genome size, heterochromatin, 45S and 5S rDNA sites, and karyotype asymmetry.

This protocol investigates the heterochromatin distribution in eight populations of Lycoris aurea (L&#8242;Her) Herb, using combined PI and DAPI chromosome staining, fluorescence in situ hybridization (FISH) with 18S-5.8-26S rRNA gene regions (45S rDNA regions), and 5S ribosomal DNA probes.

To understand karyotype variation in eight populations, detailed karyotypes were meticulously established using chromosomal measurements, fluorescence ...

Genética

Evaluating the Effect of Pesticides on the Larvae of the Solitary Bees

Current ecological risk assessments of pesticides on pollinators have primarily considered only laboratory conditions. For the larvae of solitary bees, ingestion of provisions contaminated with pesticides may increase the mortality rate of the larvae, decrease the collection rate and the population of adult solitary bees in the next year from a demographic perspective. But there are limited studies on the effects of pesticides on the larvae of solitary bees. Therefore, understanding how pesticides influence the larvae of solitary bees should be considered an integral part of pesticide ecological risk assessment. This study presents a method to expose the larvae of solitary bee, Osmia excavata, to lethal or sublethal doses of pesticide, tracking larval weight gain, developmental duration, eclosion ability, and food consumption efficiency conversion of ingested food. To demonstrate the effectiveness of this method, the larvae of O. excavata were fed with provisions containing acute lethal and sublethal doses of chlorpyrifos. Then, the above indexes of the treated larvae were investigated. This technique helps to predict and mitigate the risk of pesticides to pollinators.

The present protocol explains a method to feed pesticide-contaminated provisions to the larvae of the solitary bees, Osmia excavata. The procedure examines the ecotoxicity of the pesticide to the larvae of the solitary bees.

Avaliando o efeito dos pesticidas nas larvas das abelhas solitárias

Current ecological risk assessments of pesticides on pollinators have primarily considered only laboratory conditions. For the larvae of solitary bees, ...

Bioquímica

Establishing Pollination Requirements in Japanese Plum by Phenological Monitoring, Hand Pollinations, Fluorescence Microscopy and Molecular Genotyping

The Japanese plum cultivars commonly grown are interspecific hybrids derived from crosses between the original Prunus salicina with other Prunus species. Most hybrids exhibit gametophytic self-incompatibility, which is controlled by a single and highly polymorphic S-locus that contains multiple alleles. Most cultivated hybrids are self-incompatible and need pollen from a compatible donor to fertilize their flowers. Establishing pollination requirements in Japanese plum is becoming increasingly important due to the high number of new cultivars with unknown pollination requirements. In this work, a methodology for the determination of pollination requirements in Japanese plum-type hybrids is described. Self-(in)compatibility is determined by hand-pollinations in both the field and in the laboratory, followed by monitoring pollen tube elongation with fluorescence microscopy, and also monitoring fruit maturation in the field. Selection of pollinizer cultivars is assessed by combining the identification of S-genotypes by PCR analysis with the monitoring of flowering time in the field. Knowing the pollination requirements of cultivars facilitates the selection of cultivars for the design of new orchards and allows the early detection of productivity problems related with pollination deficiency in established orchards.

A methodology for the determination of pollination requirements in Japanese plum-type hybrids is described, which combines field- and laboratory-pollinations and observations of pollen tubes under the fluorescence microscopy with the identification of S-genotypes by PCR and the monitoring of flowering for the selection of pollinizers.

Estabelecendo requisitos de polinização em ameixa japonesa por monitoramento fenológico, polinizações manuais, Microscopia de Fluorescência e Genotipagem Molecular

The Japanese plum cultivars commonly grown are interspecific hybrids derived from crosses between the original Prunus salicina with other Prunus species. ...

Biologia do Desenvolvimento

Deploying Community Scientists to Conduct Nondestructive Genetic Sampling of Rare Butterfly Populations

Global insect declines continue to accelerate. Effective genetic sampling is critically needed to advance the understanding of many taxa and address existing knowledge gaps. This protocol represents a demonstrated method for nondestructively sampling rare butterflies for population genetic structure or DNA barcoding analyses. It uses the chorion of hatched butterfly ovae to yield sufficiently high quantity and quality DNA for successful gene sequencing to confirm species identity and quantify genetic variation. It may be particularly useful when other tissue sampling techniques are impractical or unavailable. While developed for a lepidopteran, it nonetheless could easily be adapted for use with other insect species. It was specifically designed with ease of use as a goal to help maximize broad implementation by individuals of varying experience and skill levels, such as community scientists, conservation practitioners, and students, and for use over large geographic areas to facilitate broad population sampling. The data generated can help inform taxonomic and listing decisions, conservation and management actions, and enhance basic ecological research.

Here, we present a straightforward protocol for noninvasive genetic sampling of butterfly populations based on the field collection of residual egg debris. It can be used to confirm species identity and quantify genetic variation. This protocol can be easily adapted to broader groups for community science involvement.

Destacamento de Cientistas Comunitários para Realizar Amostragem Genética Não Destrutiva de Populações de Borboletas Raras

Global insect declines continue to accelerate. Effective genetic sampling is critically needed to advance the understanding of many taxa and address ...

Determination of Self-(In)compatibility and Inter-(In)compatibility Relationships in Citrus Using Manual Pollination, Microscopy, and S-Genotype Analyses

Citrus uses S-RNase-based self-incompatibility to reject self-pollen and, therefore, requires nearby pollinizer trees for successful pollination and fertilization. However, identifying suitable varieties to serve as pollinizers is a time-consuming process. To solve this problem, we have developed a rapid method for identifying pollination-compatible citrus cultivars that utilizes agarose gel electrophoresis and aniline blue staining. Pollen compatibility is determined based on the identification of S genotypes by extracting total DNA and performing PCR-based genotyping assays with specific primers. Additionally, styles are collected 3-4 days after manual pollination, and aniline blue staining is performed. Finally, the growth status of the pollen tubes is observed with a fluorescence microscope. Pollen compatibility and incompatibility can be established by observing whether the pollen tube growth is normal or suppressed, respectively. Due to its simplicity and cost-effectiveness, this method is an effective tool for determining the pollen compatibility and incompatibility of different citrus varieties to establish incompatibility groups and incompatibility relationships between different cultivars. This method provides information essential for the successful selection of suitable pollinizer trees and, thus, facilitates the establishment of new orchards and the selection of appropriate parents for breeding programs.

Determination of Self-Incompatibility and Inter-Incompatibility Relationships in Citrus Using Manual Pollination, Microscopy, and S-Genotype Analyses

This protocol provides a rapid method for determining pollen compatibility and incompatibility in citrus cultivars.

Determinação das relações de auto-(in)compatibilidade e (in)compatibilidade em citros utilizando polinização manual, microscopia e análises de genótipo S

Citrus uses S-RNase-based self-incompatibility to reject self-pollen and, therefore, requires nearby pollinizer trees for successful pollination and ...

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Criação artificial e tolerância a metais pesados em borboletas brancas de repolho

Rearing the Cabbage White Butterfly (Pieris rapae) in Controlled Conditions: A Case Study with Heavy Metal Tolerance

The cabbage white butterfly (Pieris rapae) is an important system for applied pest control research and basic research in behavioral and nutritional ecology. Cabbage whites can be easily reared in controlled conditions on an artificial diet, making them a model organism of the butterfly world. In this paper, a manipulation of heavy metal exposure is used to illustrate basic methods for rearing this species. The general protocol illustrates how butterflies can be caught in the field, induced to lay eggs in greenhouse cages, and transferred as larvae to artificial diets. The methods show how butterflies can be marked, measured, and studied for a variety of research questions. The representative results give an idea of how artificial diets that vary in components can be used to assess butterfly performance relative to a control diet. More specifically, butterflies were most tolerant to nickel and least tolerant to copper, with a tolerance of zinc somewhere in the middle. Possible explanations for these results are discussed, including nickel hyper-accumulation in some mustard host plants and recent evidence in insects that copper may be more toxic than previously appreciated. Finally, the discussion first reviews variations to the protocol and directions for troubleshooting these methods, before considering how future research might further optimize the artificial diet used in this study. Overall, by providing a detailed video overview of the rearing and measurement of cabbage whites on artificial diets, this protocol provides a resource for using this system across a wide range of studies.

Autor em destaque: Investigando a tolerância das borboletas do repolho aos poluentes urbanos 

This paper presents a detailed protocol for rearing the cabbage white butterfly in controlled lab conditions with an artificial diet, which allows precise manipulations of early-life nutrition and toxin exposure. The representative results show how heavy metal toxicity can be assayed with this protocol.

Criação da Borboleta Branca de Repolho (Pieris rapae) em Condições Controladas: Um Estudo de Caso com Tolerância a Metais Pesados

The cabbage white butterfly (Pieris rapae) is an important system for applied pest control research and basic research in behavioral and nutritional ...

Experimentos de campo de Ecologia da polinização: o caso da

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Métodos para a realização Cruzes em