Die Finanzierung wurde von USDA CRIS 5347-22620-021-00D Verfügung gestellt und zum Teil von der Landwirtschaft und Nahrungsmittelforschung Initiative Competitive Grants-Nr. 2011-67009-30141 vom USDA National Institute of Food and Agriculture. Wir sind dankbar für die technische Unterstützung der Johanna Nassif. Wir danken auch Paul Baker, David Horton, Diego Nieto und Frances Sivakoff für die Bereitstellung einiger der in 3 verwendeten Bilder.

1. Interne Mark, Retention und Nachweisverfahren <ol><li> Interner Markierungsverfahren <ol><li> Sammeln von Insekten von Interesse (n ≈ 100 Personen) von einer Laborkolonie auf einer künstlichen Ernährung oder aus dem Bereich aufgezogen und teilen sich in zwei saubere Aufzuchtbehältern. </li><li> Legen Sie einen regelmäßigen 20 ml Diät-Paket (nicht markierten negativen Kontrollbehandlung) in einem der Behälter. Ergänzen eine zweite 20 ml künstliche Ernährung Paket mit 1,0 ml einer 1,0 mg / ml Huhn IgG / IgY Lösung, mischen Sie gründlich, und legen Sie sie in den anderen Behälter. Hinweis: Wenn das Insekt von Interesse nicht über eine künstliche Ernährung kann die Markierung auf oder in irgendeiner Diät sind sie in der Regel auf (zB, grüne Bohnen, Motteneier, Wasser, Zucker, Honig) anhalt platziert werden. </li><li> Lassen Sie die Insekten, um ihre Fraßaktivität 24 Stunden lang fortgesetzt. </li></ol></li><li> Interne Zeichen Retentionsverfahren <ol><li> Entfernen Sie die Diät-Pakete von jedem Behälter und liefern die Insekten with weiteren Nahrungsquelle, um sie über die Dauer des Experiments (zB grünen Bohnen) stützen. </li><li> Sammeln eine Kohorte (n = 20) von Insekten täglich (oder in jedem gewünschten Zeitintervall) von jeder Behandlung und gefrier sofort bei -20 ° C. </li></ol></li><li> Sandwich-ELISA-Verfahren <ol><li> Zugabe von 50 &amp; mgr; l von Kaninchen-Anti-Huhn-IgY primären Antikörper, verdünnt 1: 500 in Tris-gepufferter Salzlösung (TBS) in jede Vertiefung einer sauberen ELISA Mikrotiterplatten und Inkubieren für mindestens 1 h bei RT (Anmerkung: Die Mikrotiterplatten können inkubiert werden O / N bei 4 ° C). </li><li> Entsorgen Sie die Antikörper von der Platte und blockieren jede Vertiefung mit 300 ul einer 1,0% fettfreie Trockenmilch-Lösung für 30 min. </li><li> Während des Wartens auf den vorherigen Inkubationsschritte, legen froren Insekten einzeln in 1,6 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit 1,0 ml TBS. </li><li> Mahlen jedes Insekt mit einem sauberen Stößel, bis sie gründlich homogenisiert und fügen Sie eine 100 ul jeder Probe auf eine individuelle Vertiefung der ELISAPlatte. Man lässt die Proben bei Raumtemperatur für 1 h inkubiert. </li><li> 100 l negativ (nur TBS) und positive (Eiweiß in TBS) Kontrollen in die Vertiefungen in der ersten Spalte jeder ELISA-Platte. Fügen Sie außerdem 100 ul negativen Insekten Kontrollen (nicht markierten Insekten) an die 8 Vertiefungen in der letzten Spalte jeder Platte (Abbildung 1). Lassen Sie die Kontrollproben bei RT für 1 h inkubiert. Beachten Sie, dass die Vorlage in der 1 vorgesehen ist die Vorlage, die wir für unsere standardisierten Tests. Die Plazierung der Proben in den Wells ist im Ermessen des Forschers. </li><li> Waschen Sie jede Vertiefung dreimal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) -tween und fügen Sie dann 50 ul Kaninchen-anti-Huhn IgG / IgY konjugiert mit Meerrettich-Peroxidase, 1: 10.000 in 1% Milchlösung und Inkubation für 1 h bei RT. </li><li> Dreimal mit PBS-Tween waschen jede Vertiefung geben und fügen Sie 50 ul Tetramethylbenzidin (TMB) Substrat in jede Vertiefung. </li><li> Nach 10 Minuten, lesen Sie die Vertiefungenmit einem Mikroplatten-Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 650 nm eingestellt. </li></ol></li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53693/53693fig1.jpg" /> Abbildung 1 eine schematische Darstellung der standardisierten auch Bezeichnungen für ein typisches 96 verwendet ELISA Mikroplatten. Jede Platte enthält 7 Brunnen Tris-gepufferte Kochsalzlösung negative Kontrollen gewidmet (TBS), ein gut zu einer positiven Proteinsteuerung (Pos Ctrl) gewidmet, 80 Einzelbecken zur erobert Insekten (Probe 1 ... 80) und 8 Vertiefungen, um nicht markierte (negativ) Insekten Kontrollen gewidmet (Neg Ctrl 1 ... 8). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53693/53693fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 2. Externe Mark, Retention und Nachweisverfahren <ol><li> Äußere Kennzeichnung Verfahren <ol><li> Sammeln von Insekten von Interesse (n ≈ 100Einzelpersonen) aus einem Labor-Kolonie oder vom Feld und Ort in zwei 1,0 l Kunststoffbehälter mit einem Loch mit einem Durchmesser von 2,5 cm ausgestanzt aus der Seite eines jeden Containers. </li><li> Sprühen die Insekten in den ersten Behälter mit 1,0 ml dH 2 O (negative Kontrollbehandlung) unter Verwendung einer medizinischen Zerstäuber. Sprühen die Insekten in den zweiten Behälter mit 1,0 ml einer 5,0% igen Lösung von Hühnereiweiß Verwendung eines medizinischen Zerstäuber. </li><li> Befestigen Sie den Schlauch des Verneblers zu einem Standard-Labor Luftauslass und dann die Öffnung des Zerstäubers in die 2,5 cm Loch des Behälters einzufügen. Schalten Sie dann den Luftaustritt nach und nach, bis der Vernebler erzeugt einen Dampf. </li><li> Weiter Spritzen (Kennzeichnung), bis das Eiweiß-Lösung abgegeben worden ist (ca. 2-5 min). </li><li> Entfernen Sie den Vernebler und legen Sie einen Korken in das Loch des Kunststoffbehälters. Lassen Sie die Insekten bei RT stehen, bis die Lösung vollständig getrocknet ist. </li></ol></li><li> Externe Marke Retentionsverfahren<ol><li> Platzieren Sie jede Behandlung der trockenen Insekten in einem separaten sauberen Aufzuchtbehälter, um weitere Exposition zur Marke zu vermeiden. </li><li> Nahrung und Wasser hinzufügen, um die saubere Behälter, um die Insekten über die Dauer der Studie erhalten. </li><li> Sammeln Sie eine Kohorte (n = 20) von Insekten aus jeder Behandlungs täglich und frieren sofort bei -20 ° C. </li></ol></li><li> Indirekte ELISA-Verfahren <ol><li> Legen Sie die gefrorenen Insekten einzeln in 1,6 ml Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie 1,0 ml TBS. </li><li> Weichen Sie die Proben für 1 Stunde auf einem Orbitalschüttler Satz bei 120 UpM. </li><li> Fügen Sie negative und positive Kontrollen, wie in Schritt 1.3.5 beschrieben. </li><li> Nach dem Einweichen, Pipette 100 ul Aliquot von jeder Probe in eine der mit 80 bezeichnet Probenvertiefungen auf einem neuen 96-Napf-ELISA-Platte, wie in Figur 1 gezeigt lässt die Proben für 1 Stunde bei RT inkubiert. (Anmerkung: Die Mikroplatten kann auch inkubiert O / N bei 4 ° C). </li><li> Dreimal mit Waschen Sie die VertiefungenPBS-Tween gewaschen und dann werden 300 ul phosphatgepufferter Kochsalzlösung, die 1% Rinderserumalbumin (PBS-BSA) in jede Vertiefung. </li><li> Nach 30 min bei RT waschen zweimal mit PBS-Tween. </li><li> In 50 ul Kaninchen-Anti-Eieralbumin primäre Antikörper verdünnt 1: 8000 in PBS-BSA-Silwet (0,05%) in jede Vertiefung und Inkubation für 1 h bei RT. </li><li> Dreimal mit PBS-Tween waschen jeder Vertiefung gegeben und dann werden 50 &amp; mgr; l Ziege-Anti-Kaninchen-IgG, das mit Meerrettichperoxidase konjugiert ist, verdünnt 1: 1 h bei RT 2.000 in PBS-BSA-Silwet (0,05%). </li><li> Dreimal mit PBS-Tween waschen jede Vertiefung geben und fügen Sie 50 ul TMB Substrat in jede Vertiefung. </li><li> Nach 10 Minuten, lesen Sie die Vertiefungen mit einem Mikroplatten-Spektrophotometer bei einer Wellenlänge von 650 nm eingestellt. </li></ol></li></ol> 3. Datenanalyse <ol><li> Berechnen Sie die mittlere Absorptionswert der 8 negative Kontrolle Insekten auf jeden ELISA-Platte und dann die Berechnung der Standardabweichung auf Basis der gepoolten negativen Kontrollen herm all den ELISA-Platten einer gegebenen Studie 12. </li><li> In sechs Mal die gepoolte Standardabweichung zu dem für jeden ELISA-Platte, um einen ELISA positiven Schwellenwert zu erhalten, erhalten Mittelwert. Jede Insekten Probe ergab einen Absorptionswert gleich oder größer als dieser Wert wird als positiv für die Gegenwart des Proteins Zeichen sein. </li></ol>

Die Erwähnung von Handelsnamen oder Handelsprodukte in dieser Publikation ist ausschließlich für den Zweck der Bereitstellung von spezifischen Informationen und stellen keine Empfehlung oder Billigung durch das US Department of Agriculture. USDA ist eine Chancengleichheit Anbieter und Arbeitgeber.

Die Arthropoden Protein immunomarking Verfahren wurde erstmals vor einem Jahrhundert 9 beschrieben, fast ein Viertel. Seitdem hat sich das Verfahren so angepasst, dass die Verbreitungsmuster von einer Vielzahl von Arthropoden mit intern und extern verabreicht IgG / IgYs studieren. Diese Proteine ​​wurden standhaft Marker für die große Vielzahl von bisher getesteten Insektenarten erwiesen. Wie oben erwähnt, ist die Haupteinschränkung für die Verwendung von IgG / IgYs ist jedoch, dass sie sehr teuer si...

Verfolgen der Bewegung von tierischen Schädlingen, natürliche Feinde (Parasitoide und Raubtiere) und Bestäuber in der Natur ist für ein besseres Verständnis, wie man wesentliche Ökosystemdienstleistungen zu verbessern. Die Schlüsselkomponente für die meisten Arten von Ausbreitungs Forschung ist eine zuverlässige Methode, um die Arthropoden (en) von Interesse zu markieren. Eine Vielzahl von Materialien (zB Lacke, Farben, farbig Stäube, Tags, seltenen Elementen, Proteine) verwendet worden, um Arthropoden markieren, ihre Populationsdynamik, Ausbreitung Fähigkeiten zu beurteilen, Fütterung Verhalten und anderen ökologischen Interaktionen 1,2. Die Zweckmäßigkeit einer Markierung für eine gegebene Ausbreitungs Forschung verwendet werden abhängig von der Art der Untersuchung, die durchgeführt werden. Es gibt drei große Kategorisierungen für die Kennzeichnung von Arthropoden: (1) Mark-Release-Wiederfang (MRR), (2) Mark-Erfassung, und (3) Eigenmarke-Capture. Für Mark-Release-Rückeroberung der Forschung, der Ermittler kennzeichnet typischerweise die Arthropoden kollektiv in der Laboratory und gibt sie an einer zentralen Stelle im Feld. Die Arthropoden werden dann auf verschiedenen räumlichen und zeitlichen Abständen unter Verwendung verschiedener Erfassungsgeräte (zB Sweep net, Vakuum, klebrigen Falle) 3,4,5 zurückerobert. Die zurückerobert Proben werden dann untersucht, für die spezifische Markierung von nativen Personen veröffentlicht zu unterscheiden. Für Mark-Capture-Forschung, gilt der Untersucher in der Regel die Markierung direkt im Feld mit Spritzgeräten (zB Rückenspritze, boom und Düsenspritze). Die besten Marker für die Mark-Capture-Forschung sind kostengünstig und einfach an den Arthropoden Lebensraum aufgebracht. Für Eigenmarke-Capture-Forschung, gilt der Untersucher in der Regel Noten zu einem Arthropoden Köder 6,7 oder Nesteingang 8. Im Gegenzug, die Arthropoden kennzeichnet sich intern durch verschlingt die markierte Köder oder extern durch &quot;Bürsten&quot; gegen die Marke, wie es das Nest verlässt. Wie oben erwähnt, sind viele Arten von Markierungen uns gewesened, um eine Vielzahl von Arthropoden-Arten zu taggen. Aber nur sehr wenige sind nützlich für alle drei dieser Zerstreuung Forschungskategorien. Die Entwicklung des Proteins immunomarking Verfahren war ein großer Durchbruch zur Markierung Insekten. Immunomarking stellt ein Protein Etikett auf Arthropoden entweder intern oder extern, was wiederum, wird von einem Anti-Protein-spezifischen Enzym-linked Immunosorbent Assay (ELISA) nachgewiesen. Die erste derartige Protein-Marker verwendet wurden Kaninchen-Immunglobulin (IgG) und Huhn IgG / IgY 9,10. Sie erwiesen sich als sehr wirksam Markierungen für MRR und Selbst-Mark-Capture-Forschung (siehe Diskussion) sein. Leider sind die IgG / IgY Proteine ​​kostspielig und daher nicht praktisch für die Mark-Capture-Forschung und die meisten Arten von Eigenmarke-Capture-Forschung. Anschließend wurden der zweiten Generation Proteinnachweis ELISAs für Proteine ​​in Hühner Eiweiß (Albumin), Kuhmilch (Casein) und Soja-Milch (Trypsin-Inhibitor-Protein) enthalten entwickelt. Jeder Test ist sehr empfindlich, spezifisch und am meistenwichtiger ist, verwendet Proteinen, die viel weniger teuer als die IgG / IgY-Proteine ​​sind 11. Diese Proteine ​​wurden effektiv für MRR, Mark-Capture-und Selbst-Mark-Capture-Forschung (siehe Diskussion) bewährt. In diesem Artikel beschreiben wir, und zeigen, wie die Proteinmarkierung Labor Retention Studien durchzuführen. Solche Studien sind die erste Phase der Forschung für jede Art von Feldausbreitung Studie erforderlich. Genauer gesagt, ist es entscheidend, dass die Ermittler wissen, wie lange die Marke wird über die gezielten Arthropodenarten vor dem Einschiffen auf Feldausbreitungsstudien beibehalten werden. Hier beschreiben wir, und zeigen, wie man nach innen und außen zu markieren Insekten für MRR, Mark-Capture-und Selbst-Mark-Aufnahmeart Feldstudien. Wir haben uns dann zeigen, wie man die Anwesenheit der Markierungen mit indirekter und Sandwich ELISAs zu erkennen.

<table><tbody><tr><td>Food storage container (for insect rearing)</td><td>Rubbermaid/Tupperware</td><td>Various sizes</td><td>Various manufacturers &amp;amp; vendors. Mesh fabric is glued in a window</td></tr><tr><td>Small volume nebulizer (Micro Mist)</td><td>Teleflex-Hudson RCI</td><td>1881</td><td>Available online and in medical supply shops. Other brands will work as well.</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes, 1.6 ml w/cap</td><td>Continental Lab Products</td><td>4445.X</td><td>Any similar type will work. We prefer brands that have easy to open lids.</td></tr><tr><td>Styrofoam storage box for microcentrifuge tubes (5x20 grid)</td><td>RPI Corp.</td><td>145746</td><td>This design is nice because it doesn&#039;t crowd the tubes.</td></tr><tr><td>Dispenser, repeater</td><td>Eppendorf</td><td>4982000322</td><td>Anything similar will help speed up the dispensing.</td></tr><tr><td>Pestles, plastic disposable tissue grinders, 1.5 ml</td><td>Kimble Chase</td><td>749521-1500</td><td>Available with various vendors. Pestles can be cleaned and autoclaved for reuse.</td></tr><tr><td>BD Falcon ELISA plates, 96-well (flat bottom)</td><td>BD</td><td>351172</td><td></td></tr><tr><td>Ovation pipette, manual (20-200 &amp;micro;l)</td><td>VistaLab</td><td>1057-0200 or 1070-0200</td><td>Any similar type will work. This model is ergonomic.</td></tr><tr><td>Reservoirs, sterile reagent</td><td>VistaLab</td><td>4054-1000</td><td>Anything similar will work.</td></tr><tr><td>Electronic pipette, 8-channel (50-1,200 &amp;micro;l) (Biohit eLine)</td><td>Sartorius</td><td>730391</td><td>If you had to pick one electronic model, this size is most useful.</td></tr><tr><td>Electronic pipette, 8-channel (10-300 &amp;micro;l) (Biohit eLine)</td><td>Sartorius</td><td>730361</td><td>Anything similar will work.</td></tr><tr><td>Manifold, multiwell plate washer (8-position, straight)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z369802&amp;nbsp;</td><td>Anything similar will work for manual plate washing.</td></tr><tr><td>Microplate reader with absorbance detection</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax 250</td><td>Anything similar will work.</td></tr><tr><td>Chicken IgG/IgY</td><td>United States Biological</td><td>I1903-15R</td><td>Also available from other sources</td></tr><tr><td>Egg whites</td><td>Grocery store</td><td>&amp;ldquo;All Whites&amp;rdquo;, &amp;ldquo;Egg Beaters&amp;rdquo;, &lt;em&gt;etc.&lt;/em&gt;</td><td>Mix 5 ml with 95 ml dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O for 5% solution</td></tr><tr><td>Tris (Trizma Base)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>2.42 g/L to make TBS</td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>29.22 g/L to make TBS and 8.0&amp;nbsp;g&amp;#8288;/&amp;#8288;L for PBS</td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876</td><td>1.14 g/L for PBS</td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>0.2 g/L for PBS</td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>0.2 g/L for PBS</td></tr><tr><td>Tween 20, EIA grade</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>Add 0.5 ml per L to PBS after salts are dissolved.</td></tr><tr><td>PBS with 1% BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3688</td><td>Mix 1 packet in 1 L dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule) antibody produced in rabbit (1:500)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6409</td><td>Mix 100 &amp;micro;l in 50 ml TBS</td></tr><tr><td>Dry Milk, Powdered or Fresh Milk (1%)</td><td>Grocery store</td><td></td><td>Mix 10 g with 1 L dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O for 1% solution</td></tr><tr><td>Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule)-Peroxidase antibody produced in rabbit (1:10,000)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9046</td><td>Mix 100 &amp;micro;l in 1 L of 1% milk</td></tr><tr><td>Anti-Chicken Egg Albumin antibody produced in rabbit (1:8,000)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6534</td><td>Dilute 125 &amp;micro;l in 1 L PBS-BSA</td></tr><tr><td>Goat Anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate (1:2,000)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6154</td><td>Dilute 0.5 ml in 1 L PBS-BSA, then add 1.3&amp;nbsp;ml Silwet</td></tr><tr><td>Vac-In-Stuff (Silwet L-77) silicon-polyether copolymer</td><td>Lehle Seeds</td><td>VIS-01</td><td>Add as last ingredient</td></tr><tr><td>TMB Microwell One Component Peroxidase Substrate</td><td>SurModics</td><td>TMBW-1000-01</td><td></td></tr></tbody></table>

administering and detecting protein marks on arthropods for dispersal research

Überwachung Arthropoden Bewegung ist oft erforderlich, um damit verbundenen Bevölkerungsdynamik, Verbreitungsmuster, Wirtspflanze Vorlieben, und andere ökologische Wechselwirkungen besser zu verstehen. Arthropoden sind in der Regel in der Natur durch Markieren sie mit einer einzigartigen Signatur verfolgt und dann neu zu sammeln sie über Zeit und Raum, um ihre Ausbreitung Fähigkeiten zu bestimmen. Neben der tatsächlichen physikalischen Tags, wie farbige Staub oder Farbe wurden verschiedene Arten von Proteinen sehr wirksam für die Kennzeichnung von Arthropoden für ökologische Forschung bewährt. Proteine ​​können intern und / oder extern verabreicht werden. Die Proteine ​​können dann wieder eingefangen Arthropoden mit einem Protein-spezifischen Enzym-linked Immunosorbent Assay (ELISA) nachgewiesen werden. Hier beschreiben wir Protokolle für außen und innen Tagging Arthropoden mit Protein. Zwei einfache experimentellen Beispiele werden gezeigt: (1), um ein Insekt durch die Bereitstellung eines Protein-angereicherte Ernährung und (2) eine externe Protein Zeichen topisch a eingeführt eine interne Proteinzeichenum ein Insekt mit einem medizinischen Vernebler ngewandte. Wir beziehen dann eine Schritt-für-Schritt-Anleitung des Sandwich und indirekt verwendet werden, um Proteinmarkierungen auf den Insekten erkennen ELISA-Verfahren. In dieser Demonstration werden verschiedene Aspekte der Akquisition und den Nachweis von Protein-Marker auf Arthropoden für Mark-Release-Wiederfang, Mark-Capture-und Selbst-Mark-Capture-Arten der Forschung diskutiert, zusammen mit den verschiedenen Möglichkeiten, die immunomarking Verfahren wurde angepasst ist, eine Vielzahl von Forschungszielen entsprechen.

Interne Kennzeichnung: Die Ergebnisse der internen Zeichen Retentionstest sind in 2A gezeigt. Die berechnete ELISA kritischen Schwellenwert war 0,054. Insgesamt (alle vier Probendaten kombiniert), die ohne Protein behandelten Insekten ergab konstant niedrig ELISA-Werte (x = 0,038 ± 0,002, n = 80). Umgekehrt werden alle Insekten gefüttert das Protein angereicherte Ernährung lieferte...

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Administering and Detecting Protein Marks on Arthropods for Dispersal Research

Proteins are often used to mark arthropods for dispersal research. Methods for administering internal and external protein marks on arthropods are demonstrated. Protein mark detection techniques, either through indirect or sandwich enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs), are also illustrated.

Verwaltung und Nachweis von Protein-Kennzeichen auf Arthropoden für Dispersal Forschung

Monitoring arthropod movement is often required to better understand associated population dynamics, dispersal patterns, host plant preferences, and other ...

administering-detecting-protein-marks-on-arthropods-for-dispersal

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Environment

7.3K Aufrufe.  Arid-Land Agricultural Research Center. Proteins are often used to mark arthropods for dispersal research. Methods for administering internal and external protein marks on arthropods are demonstrated. Protein mark detection techniques, either through indirect or sandwich enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs), are also illustrated. 

Serie: Administering and Detecting Protein Marks on Arthropods for Dispersal Research

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes. The majority of them belong to the superfamily of G protein-coupled receptors (GPCRs). We have focused on characterizing arthropod kinin receptors from the tick and mosquito. Arthropod kinins are multifunctional neuropeptides with myotropic, diuretic, and neurotransmitter function. Here, a method for systematic analyses of structure-activity relationships of insect kinins on two heterologous kinin receptor-expressing systems is described. We provide important information relevant to the development of biostable kinin analogs with the potential to disrupt the diuretic, myotropic, and/or digestive processes in ticks and mosquitoes.
The kinin receptors from the southern cattle tick, Boophilus microplus (Canestrini), and the mosquito Aedes aegypti (Linnaeus), were stably expressed in the mammalian cell line CHO-K1. Functional analyses of these receptors were completed using a calcium bioluminescence plate assay that measures intracellular bioluminescence to determine cytoplasmic calcium levels upon peptide application to these recombinant cells. This method takes advantage of the aequorin protein, a photoprotein isolated from luminescent jellyfish. We transiently transfected the aequorin plasmid (mtAEQ/pcDNA1) in cell lines that stably expressed the kinin receptors. These cells were then treated with the cofactor coelenterazine, which complexes with intracellular aequorin. This bond breaks in the presence of calcium, emitting luminescence levels indicative of the calcium concentration. As the kinin receptor signals through the release of intracellular calcium, the intensity of the signal is related to the potency of the peptide.
This protocol is a synthesis of several previously described protocols with modifications; it presents step-by-step instructions for the stable expression of GPCRs in a mammalian cell line through functional plate assays (Staubly et al., 2002 and Stables et al., 1997). Using this methodology, we were able to establish stable cell lines expressing the mosquito and the tick kinin receptors, compare the potency of three mosquito kinins, identify critical amino acid positions for the ligand-receptor interaction, and perform semi-throughput screening of a peptide library. Because insect kinins are susceptible to fast enzymatic degradation by endogenous peptidases, they are severely limited in use as tools for pest control or endocrinological studies. Therefore, we also tested kinin analogs containing amino isobutyric acid (Aib) to enhance their potency and biostability. This peptidase-resistant analog represents an important lead in the development of biostable insect kinin analogs and may aid in the development of neuropeptide-based arthropod control strategies.

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

This protocol provides instructions for clonal-cell line selection and a calcium bioluminescence assay to analyze the structure-activity relationships of synthesized arthropod neuropeptides on their cognate GPCRs. This assay can be used for receptor deorphanization and structure-activity relationship studies for synthetic analog design and peptide/drug-lead discovery.

Ein Calcium Biolumineszenzassay für die funktionelle Analyse von Mosquito ( Aedes aegypti) Und Tick ( Rhipicephalus microplus) G-Protein gekoppelten Rezeptoren

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

Forschung

Immunologie und Infektion

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells named wing imaginal discs formed during embryonic development. In the larval stages the imaginal discs grow, increasing its number of cells and forming monolayered epithelial&#160;structures. Inside the pupal case, the imaginal discs bud out and fold into bilayers along a line that becomes the future margin of the wing. During this process, the longitudinal primodia veins originate vein cells on the prospective dorsal and ventral surfaces of the wing. During the pupal stage the stripes of vein cells of each surface communicate in order to generate tight tubes; at the same time, the cross-veins begin their formation.
With the help of appropriate molecular markers, it is possible to identify the major elements composing the wing during its development. For this reason, the ability to accurately detect transcripts or proteins in this structure is critical for studying their abundance and localization related to the development process of the wing.
The procedure described here focuses on manipulating pupal wings, providing detailed instructions on how to dissect the wing during the pupal stage. The dissection of pupal tissue is more difficult to perform than their counterparts in third instar larvae. This is why this approach was developed, to obtain rapid and efficient high quality samples. Details of how to immunostain and mount these wing samples, to allow the visualization of proteins or cell components, are provided in the protocol. With little expertise it is possible to collect 8-10 high quality pupal wings in a short amount of time.

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

The ability to accurately detect transcripts or proteins in Drosophila tissues is critical for studying their abundance and localization related to the development process. Here is the description of a straightforward procedure to dissect pupal wings. These wings can be used as samples in several techniques (immunohistochemistry, PCR assay, etc.).

Eine schnelle und effiziente Methode, um Pupal Flügel von Drosophila geeignet für Immunodetections oder PCR-Assays sezieren

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells ...

Entwicklungsbiologie

A Method for Quantifying Foliage-Dwelling Arthropods

Terrestrial arthropods play an important role in our environment. Quantifying arthropods in a way that allows for a precise index or estimates of density requires a method with high detection probability and a known sampling area. While most described methods provide a qualitative or semi-quantitative estimate adequate for describing species presence, richness, and diversity, few provide an adequately consistent detection probability and known or consistent sampling areas to provide an index or estimate with adequate precision to detect differences in abundance across environmental, spatial, or temporal variables. We describe how to quantify leaf-dwelling arthropods by sealing the leaves and end of branches in a bag, clipping and freezing the bagged material, and rinsing the previously frozen material in water to separate arthropods from the substrate and quantify them. As we demonstrate, this method can be used at a landscape scale to quantify leaf-dwelling arthropods with adequate precision to test for and describe how spatial, temporal, environmental, and ecological variables influence arthropod richness and abundance. This method allowed us to detect differences in density, richness, and diversity of leaf-dwelling arthropods among 5 genera of trees commonly found in southeastern deciduous forests.

We describe how to quantify leaf dwelling arthropods by sealing the leaves and end of branches in a bag, clipping and freezing the bagged material, and rinsing the previously frozen material in water to separate arthropods from the substrate for quantification.

Eine Methode zur Quantifizierung von Laub-Behausungs-Arthropoden

Terrestrial arthropods play an important role in our environment. Quantifying arthropods in a way that allows for a precise index or estimates of density ...

Umwelt

Vertical T-maze Choice Assay for Arthropod Response to Odorants

Given the economic importance of insects and arachnids as pests of agricultural crops, urban environments or as vectors of plant and human diseases, various technologies are being developed as control tools. A subset of these tools focuses on modifying the behavior of arthropods by attraction or repulsion. Therefore, arthropods are often the focus of behavioral investigations. Various tools have been developed to measure arthropod behavior, including wind tunnels, flight mills, servospheres, and various types of olfactometers. The purpose of these tools is to measure insect or arachnid response to visual or more often olfactory cues. The vertical T-maze oflactometer described here measures choices performed by insects in response to attractants or repellents. It is a high throughput assay device that takes advantage of the positive phototaxis (attraction to light) and negative geotaxis (tendency to walk or fly upward) exhibited by many arthropods. The olfactometer consists of a 30 cm glass tube that is divided in half with a Teflon strip forming a T-maze. Each half serves as an arm of the olfactometer enabling the test subjects to make a choice between two potential odor fields in assays involving attractants. In assays involving repellents, lack of normal response to known attractants can also be measured as a third variable.

A vertical, T-maze olfactometer is described for assaying the behavioral response of arthropods. The olfactometer allows the experimenter to measure choices performed by test subjects when subjected to two potential odor fields. Both attraction to and repulsion from odorants can be measured with this device.

Vertical T-Labyrinth Wahl Assay für Gliederfüßer Response to Geruchsstoffe

Given the economic importance of insects and arachnids as pests of agricultural crops, urban environments or as vectors of plant and human diseases, ...

Neurowissenschaften

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster. In a light-tight box illuminated by red light that is invisible to fruit flies, a camera linked to custom data acquisition software monitors the position of six flies simultaneously. Each fly is confined to walk in individual arenas containing a food odor at the center. The testing arenas rest on a porous floor that functions to prevent odor accumulation. Latency to locate the odor source, a metric that reflects olfactory sensitivity under different physiological states, is determined by software analysis. Here, we discuss the critical mechanics of running this behavioral paradigm and cover specific issues regarding fly loading, odor contamination, assay temperature, data quality, and statistical analysis.

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster.

Ein Single-fly-Assay für Sammelverhalten in<em&gt; Drosophila</em

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video ...

SwarmSight: Real-time Tracking of Insect Antenna Movements and Proboscis Extension Reflex Using a Common Preparation and Conventional Hardware

Many scientifically and agriculturally important insects use antennae to detect the presence of volatile chemical compounds and extend their proboscis during feeding. The ability to rapidly obtain high-resolution measurements of natural antenna and proboscis movements and assess how they change in response to chemical, developmental, and genetic manipulations can aid the understanding of insect behavior. By extending our previous work on assessing aggregate insect swarm or animal group movements from natural and laboratory videos using the video analysis software SwarmSight, we developed a novel, free, and open-source software module, SwarmSight Appendage Tracking (SwarmSight.org) for frame-by-frame tracking of insect antenna and proboscis positions from conventional web camera videos using conventional computers. The software processes frames about 120 times faster than humans, performs at better than human accuracy, and, using 30 frames per second (fps) videos, can capture antennal dynamics up to 15 Hz. The software was used to track the antennal response of honey bees to two odors and found significant mean antennal retractions away from the odor source about 1 s after odor presentation. We observed antenna position density heat map cluster formation and cluster and mean angle dependence on odor concentration.

This protocol describes steps for using the novel software, SwarmSight, for frame-by-frame tracking of insect antenna and proboscis positions from conventional web camera videos using conventional computers. The free, open-source software processes frames about 120 times faster than humans and performs at better than human accuracy.

SwarmSight: Echtzeit-Tracking von Insekten Antenne Bewegungen und Rüssel Erweiterung Reflex mit einem gemeinsamen Vorbereitung und konventioneller Hardware

Many scientifically and agriculturally important insects use antennae to detect the presence of volatile chemical compounds and extend their proboscis ...

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host plant.1,2 When a host plant is an important agronomic commodity feeding damage by insect pests can inflict serious economic losses to growers. Accordingly, kairomones can be used as attractants to lure or confuse these insects and, thus, offer an environmentally friendly alternative to pesticides for insect control.3 Unfortunately, plants can emit a vast number volatiles with varying compositions and ratios of emissions dependent upon the phenology of the commodity or the time of day. This makes identification of biologically active components or blends of volatile components an arduous process. To help identify the bioactive components of host plant volatile emissions we employ the laboratory-based screening bioassay electroantennography (EAG). EAG is an effective tool to evaluate and record electrophysiologically the olfactory responses of an insect via their antennal receptors. The EAG screening process can help reduce the number of volatiles tested to identify promising bioactive components. However, EAG bioassays only provide information about activation of receptors. It does not provide information about the type of insect behavior the compound elicits; which could be as an attractant, repellent or other type of behavioral response. Volatiles eliciting a significant response by EAG, relative to an appropriate positive control, are typically taken on to further testing of behavioral responses of the insect pest. The experimental design presented will detail the methodology employed to screen almond-based host plant volatiles4,5 by measurement of the electrophysiological antennal responses of an adult insect pest navel orangeworm (Amyelois transitella) to single components and simple blends of components via EAG bioassay. The method utilizes two excised antennae placed across a "fork" electrode holder. The protocol demonstrated here presents a rapid, high-throughput standardized method for screening volatiles. Each volatile is at a set, constant amount as to standardize the stimulus level and thus allow antennal responses to be indicative of the relative chemoreceptivity. The negative control helps eliminate the electrophysiological response to both residual solvent and mechanical force of the puff. The positive control (in this instance acetophenone) is a single compound that has elicited a consistent response from male and female navel orangeworm (NOW) moth. An additional semiochemical standard that provides consistent response and is used for bioassay studies with the male NOW moth is (Z,Z)-11,13-hexdecadienal, an aldehyde component from the female-produced sex pheromone.6-8

A method to rapidly screen host plant volatiles by measurement of the electrophysiological response of adult navel orangeworm (Amyelois transitella) antennae to single components and blends via electroantennographic analysis is demonstrated.

Elektroantennographischer Bioassay als Screening-Instrument für Wirtspflanzen Volatile

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

Biologie

The Ingestion of Fluorescent, Magnetic Nanoparticles for Determining Fluid-uptake Abilities in Insects

Fluid-feeding insects ingest a variety of liquids, which are present in the environment as pools, films, or confined to small pores. Studies of liquid acquisition require assessing mouthpart structure and function relationships; however, fluid uptake mechanisms are historically inferred from observations of structural architecture, sometimes unaccompanied with experimental evidence. Here, we report a novel method for assessing fluid-uptake abilities with butterflies (Lepidoptera) and flies (Diptera) using small amounts of liquids. Insects are fed with a 20% sucrose solution mixed with fluorescent, magnetic nanoparticles from filter papers of specific pore sizes. The crop (internal structure used for storing fluids) is removed from the insect and placed on a confocal microscope. A magnet is waved by the crop to determine the presence of nanoparticles, which indicate if the insects are able to ingest fluids. This methodology is used to reveal a widespread feeding mechanism (capillary action and liquid bridge formation) that is potentially shared among Lepidoptera and Diptera when feeding from porous surfaces. In addition, this method can be used for studies of feeding mechanisms among a variety of fluid-feeding insects, including those important in disease transmission and biomimetics, and potentially other studies that involve nano- or micro-sized conduits where liquid transport requires verification.

Fluid-feeding insects have the ability to acquire minute quantities of liquids from porous surfaces. This protocol describes a method to directly determine the ability for insects to ingest liquids from porous surfaces using feeding solutions with fluorescent, magnetic nanoparticles.

Die Einnahme von Leuchtstofflampen, magnetische Nanopartikel für die Bestimmung der Fluid-Aufnahme Fähigkeiten bei Insekten

Fluid-feeding insects ingest a variety of liquids, which are present in the environment as pools, films, or confined to small pores. Studies of liquid ...

Sammeln von Hämolymphe von kleinen Gliederfüßern

A Precise and Quantifiable Method for Collecting Hemolymph from Small Arthropods

Arthropods are known to transmit a variety of viruses of medical and agricultural importance through their hemolymph, which is essential for virus transmission. Hemolymph collection is the basic technology for studying virus-vector interactions. Here, we describe a novel and simple method for the quantitative collection of hemolymph from small arthropods using Laodelphax striatellus (the small brown planthopper, SBPH) as a research model, as this arthropod is the main vector of rice stripe virus (RSV). In this protocol, the process begins by gently pinching off one leg of the frozen arthropod with fine-tipped tweezers and pressing the hemolymph out of the wound. Then, a simple micropipette consisting of a capillary and a pipette bulb is used to collect the transudative hemolymph from the wound according to the principle of capillary forces. Finally, the collected hemolymph can be dissolved into a specific buffer for further study. This new method for collecting hemolymph from small arthropods is a useful and efficient tool for further research on arboviruses and vector-virus interactions.

Autor im Rampenlicht: Eine präzise und quantifizierbare Methode zur Gewinnung von Hämolymphe von kleinen Gliederfüßern  

We describe a method to collect quantifiable hemolymph efficiently from small arthropods for subsequent analysis.

Verwaltung und Nachweis von Protein-Kennzeichen auf Arthropoden für Dispersal Forschung

Zusammenfassung

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