This study was supported by the Velux Stiftung (A.K.M.), NIH grant EY024207 (A.K.M.) and the Austrian Science Fund (FWF) project J3686 (B.P.).

1. Herstellung von Liposomen und Proteoliposomen <ol><li> Liposome Formation <ol><li> Verwendung einer Glasspritze, fügen 1.435 ul POPC (25 mg / ml, in Chloroform) und 160 &amp; mgr; l POPG (25 mg / ml, in Chloroform) auf einen Rundkolben wurden 52,5 umol Lipide in einem Molverhältnis POPC zu erhalten: POPG = 9: 1. </li><li> Trocknen der Lipide für 30 min unter Verwendung eines Rotationsverdampfer bei einer Rotationsgeschwindigkeit von 145 rpm (kein Wasserbad wird für dieses Volumen an Lösungsmittel erforderlich), dann übertragen die Kolben auf einem Vakuum-Exsikkator für mindestens 3 Stunden oder über Nacht bei Raumtemperatur (RT). </li><li> Hydratisieren des getrockneten Lipidfilms mit 10 ml 50 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl (nachfolgend bezeichnet als A-Puffer) durch vorsichtiges den Kolben, bis eine homogene, trübe Suspension Ergebnisse wirbelnden; HINWEIS: Die Lipidkonzentration in diesem Stadium wird erwartet, 5,25 mM zu sein, da keine Verluste sollten bisher aufgetreten sind. </li><li> Beschallen die Suspension in einem Wasserbad für 10 min bei Raumtemperatur mit einer Frequenz of 40 kHz. Die Lösung aussehen wird etwas klarer. </li><li> Unter Verwendung eines Extruders, übergeben Sie die Suspension 10-mal durch eine Membran mit einer 400 nm Porengröße, gefolgt von einem zweiten Zyklus der Extrusion mit 4 Durchgängen durch eine Membran mit einer 200 nm Porengröße. HINWEIS: Der mittlere Durchmesser der resultierenden LUVs von ~ 175 nm. Falls erforderlich, können die Größe und die Homogenität der LUVs durch dynamische Lichtstreuung überprüft werden, entsprechend den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Quantifizierung der Phospholipid-Konzentration des LUV-Suspension, wie in Abschnitt 1.2) beschrieben. ANMERKUNG: Aufgrund der Verluste während der Extrusion, die Konzentration ist in der Regel etwa 3,6 mM. </li><li> Speichern der LUVs bei 4 ° C für ca. 2 Wochen, wenn nicht sofort verwendet wird. </li></ol></li><li> Phospholipid Quantifizierung ANMERKUNG: Um die Phospholipid-Konzentration der LUV Suspension zur Rekonstitution sowie die der Proteoliposomen verwendet bestimmen, die schließlich erzeugt werden, ein Aliquot der Probe Ändected Oxidation durch Perchlorsäure. Dieses Verfahren bricht Phospholipide unten anorganisches Phosphat freizugeben , die dann durch einen kolorimetrischen Test im Vergleich mit Standards 23 quantifiziert. <ol><li> Bereiten Sie eine 40 mM Stammlösung von Natriumphosphat (Na 2 HPO 4) in entionisiertem , destilliertem Wasser. </li><li> Verdünnen der Stammlösung mit entionisiertem, destilliertem Wasser zu erhalten, 4 mM und 0,4 mM Arbeitslösungen, die als Kalibrierungsstandards dienen. </li><li> Unter Verwendung der Arbeitslösungen vorzubereiten Standards in 13 x 100 mm Glasröhrchen 2 im Bereich von 0 bis 80 nmol Natriumphosphat in einem Endvolumen von 50 ul. </li><li> Nehmen Sie sich 10 ul jeder der LUV und Proteoliposoms Proben quantifiziert und mit 40 ul ddH 2 O in 13 x 100 mm 2 Glasröhrchen verdünnen. Hinweis: Da die Lipidkonzentration der LUVs und Proteo im Bereich von 2,5-5 uM, die 10 ul Probe 25-50 nmol Lipid Phosphor enthalten.</li><li> Hinzufügen 300 ul Perchlorsäure zu jedem der Standards und Proben und Wärme für 1 h bei 145 ° C in einem Heizblock. Setzen Marmor auf den Rohren Verdampfung zu verhindern. </li><li> Lassen Sie die Röhrchen auf Raumtemperatur abkühlen lassen und mit 1 ml ddH 2 O. </li><li> In 400 ul jeweils frisch zubereitet 12 g / l Ammoniummolybdat und 50 g / l Natriumascorbat und Wirbel zu mischen. </li><li> Hitze 10 min bei 100 ° C mit Murmeln oben auf die Rohre. Entfernen Sie die Schläuche aus dem Heizblock und lassen Sie sie auf Raumtemperatur abkühlen lassen. </li><li> Die Extinktion der Proben gegen den Rohling (Standardprobe, die 0 nmol Natriumphosphat) mit einem Spektrometer bei einer Wellenlänge von 797 nm. </li><li> Bestimmen Sie den Phosphatgehalt der Proben gegen die Kalibrierung Standardkurve. </li></ol></li><li> Rekonstitution von Opsin HINWEIS: Es ist notwendig, die optimale Quellung Bedingungen für die Rekonstitution zu bestimmen, da diese abhängig von der Art des Waschmittels sowieals Lipidzusammensetzung und der Konzentration der LUVs. Als LUVs auf Schwellung des Prozesses ihre Lichtstreuungseigenschaften verändern kann durch Messung der Absorption (Abbildung 2) als rezensiert von Rigaud und Levy 24 und Geertsma et al überwacht werden. 25. <ol><li> Pipette 800 ul LUVs (aus dem Abschnitt 1.1, wie Lipid Erholung nach der Extrusion 70%, die erwartete Konzentration von LUVs ist 3,6 mM Phospholipid) in ein 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Hinzufügen, 5,3 ul Puffer A und 34,7 &amp; mgr; l 10% (w / v) DDM in Puffer A gelöst </li><li> Inkubieren für 3 Stunden bei Raumtemperatur mit end-over-end Mischen. </li><li> Vorbereitung der Zwischenzeit die Polystyrol-Kügelchen: <ol><li> Verwenden Sie 400 mg Kügelchen pro Probe und wiegen sie in einem Becherglas aus. </li><li> Waschen Sie zweimal mit Methanol, dreimal mit Wasser und einmal mit Puffer A. Für jeden Waschschritt Einsatz 5 ml Flüssigkeit und rühre langsam für 10 min. HINWEIS: Es wird empfohlen, die Polystyrol herzustellenPerlen auf einmal für mehrere Proben, beispielsweise in 6 g Perlen wiegen und mit 75 ml Flüssigkeit zu waschen. Überschüssige Perlen können in einem Kühlschrank für mehrere Tage aufbewahrt werden. </li></ol></li><li> Während der letzten 30 Minuten der Vesikel Destabilisierung trocknen die NBD markierte Phospholipid in einem Schraubverschluss Glasrohr ( &quot;Rekonstitution Glasrohr &#39;): Pro Probe, 9,5 ul NBD-PC (1 mg / ml in Chloroform, wodurch man 0,4 Mol% der gesamten Phospholipiden) werden unter einem Stickstoffstrom in einem Glasröhrchen getrocknet und anschließend in 45 ul 0,1% (w / v) DDM in Puffer A gelöst </li><li> Nach 3 h Vesikel Destabilisierung fügen den gelösten-NBD-markiertes Phospholipid, das DDM-solubilisierten Protein und Puffer A , so dass das Endvolumen von 1 ml 0,36% (w / v), das heißt, 7 mM, DDM. <ol><li> Somit proteinfreien Liposomen (verwendet als Kontrollprobe) in 45 ul NBD-PC (gelöst in 0,1% DDM), 60 ul 0,1% DDM und 55 ul Puffer A zu erzeugen; für Proteo hinzufügen, für PrüfungB. 40 &amp; mgr; l Protein (aus einer typischen Stammlösung von ~ 110 ng / ul) in 0,1% DDM, 45 &amp; mgr; l von NBD-PC, (in 0,1% DDM) gelöst, 20 ul 0,1% DDM und 55 &amp; mgr; l Puffer A . Hinweis: Die Reihenfolge der Zugabe werden sollte, wie aufgelistet. </li></ol></li><li> Die Probe wird für eine zusätzliche Stunde Ende über Ende bei Raumtemperatur. </li><li> In 80 mg der hergestellten Polystyrol-Kügelchen und Inkubation der Probe mit end-over-end bei RT für 1 h gemischt werden. </li><li> Als nächstes fügen Sie eine zusätzliche 160 mg Polystyrol-Kügelchen und Inkubation mit End-over-end bei RT für weitere 2 Stunden gemischt wird. </li><li> Übertragen Sie die Probe (Abfahrt die verbrauchten Polystyrolkügelchen hinter) auf eine Glas Schraubverschluss Röhrchen mit 160 mg frisch Polystyrolkügelchen und über Nacht bei 4 ° C mischen. HINWEIS: Der einfachste Weg, um die Probe zu übertragen und zu vermeiden Ansaugen Perlen ist eine Pasteurpipette zu verwenden, die mit einem kleinen positiven Druck auf den Boden der Glasröhre gedrückt wird. Sobald die Spitze der Pipette ist fest an derBoden des Rohres, dann kann die Probe leicht, ohne von den Kügelchen Interferenz zurückgezogen werden. </li><li> Am nächsten Morgen, übertragen Sie die Probe auf ein Mikrozentrifugenröhrchen ohne Perlen und auf Eis in Vorbereitung auf die Scramblase Aktivitätstest Durchführung über. </li></ol></li></ol> 2. Scramblase Aktivitätstest HINWEIS: Die Fluoreszenzintensität der Liposomen oder Proteoliposomen mit Puffer A verdünnt wird über die Zeit nach der Zugabe von Dithionit in einem Fluoreszenz-Spektrometer überwacht. Um eine stabile Ausgangsintensität zu erhalten, wird die Fluoreszenz für mindestens 50 sec aufgezeichnet (oder bis ein stabiles Signal erreicht wird), bevor Dithionit zu einer konstant gerührten Probe zugegeben und anschließend wird dann für mindestens 500 s nach Zugabe von Dithionit. <ol><li> In 1.950 ul Puffer A zu einer Plastikküvette ein Mini Rührstab enthält. </li><li> In 50 ul der vorbereiteten proteo (Liposomen) und lassen Sie die Probe in der Fluoreszenz SPECTRO äquilibrierenMeter unter ständigem Rühren für mehrere Sekunden. </li><li> Inzwischen bereiten eine Lösung von 1 M Dithionit in 0,5 M ungepufferte Tris (zB für zwei Proben 20 mg Dithionit in ein Mikrozentrifugenröhrchen abwiegen und in 114 ul eiskaltem 0,5 M Tris direkt vor dem Gebrauch und auf Eis halten für die nächste auflösen Sample). HINWEIS: Die Dithionit-Lösung muss frisch zubereitet werden und sollte nicht mehr als 20 min nach der Herstellung verwendet werden; wenn viele Messungen vorgenommen werden, Aliquots von Dithionit können im Voraus werden abgewogen und unmittelbar vor der Verwendung gelöst. </li><li> Starten Sie die Fluoreszenzüberwachung (Anregung 470 nm, Emission 530 nm, Spaltbreite 0,5 nm). </li><li> In 40 ul der 1 M Dithionitlösung in die Küvette 50 Sekunden nach der Fluoreszenz Starten der Aufnahme (mit dem Septum im Deckel der Küvette Kammer, wenn möglich) und weiterhin die Fluoreszenz für eine weitere 400-600 sec aufzeichnen. </li><li> Analysieren Sie die Daten, wie in Kapitel 3 beschrieben. </li></ol> 3.Datenanalyse <ol><li> Kinetik der Scrambling <ol><li> Charakterisieren Sie die Fluoreszenzspur jedes durch die Scramblase Aktivitätstest erhaltenen Probe durch die anfängliche Fluoreszenz definiert, F i, vor der Zugabe von Dithionit und der Endpunkt Fluoreszenz, F, erreichte nach&gt; 400 sec. F i wird für jede Probe als Mittelwert der Fluoreszenz für den Zeitraum von 30 sec bestimmt vor der Zugabe von Dithionit. </li><li> Bestimmen die Endpunktdaten entsprechend dem Ausmaß des Fluoreszenzreduktion, R = 100 • F / F i. Wir verwenden die Begriffe R L für proteinfreien Liposomen und R P für Opsin enthaltenden Proteo. </li></ol></li><li> Bestimmung des Molekulargewichts des Funktionell Rekonstituiertes Scramblase <ol><li> Konvertieren der Fluoreszenzreduktionsdaten gemäß der folgenden Gleichung: p (≥1 scramblase) = (R P - R L) / (R max - R L) (Gleichung 1) HINWEISWobei R max die maximale Reduktion ist , die erhalten wird , wenn ausreichend Protein, rekonstituiert wird , dass alle Vesikel in der Probe mindestens eine funktionelle scramblase besitzen, und p ist die Wahrscheinlichkeit , dass ein bestimmter Vesikel in einer rekonstituierten Probe wird als &quot;Scramblase-aktiv&quot;, dh sie besitzt mindestens eine funktionelle scramblase. Der Wert für R L beträgt typischerweise 45% 3 , während R max ist typischerweise 82,5% 3, anstelle des erwarteten 100% (R max kann experimentell für Opsin Proteoliposomen mit einem PPR von&gt; 1 mg / mmol bestimmt werden). Als R max &lt;100% wird davon ausgegangen , dass eine Subpopulation von Vesikeln zur Rekonstitution refraktären ist. Für R max = 82,5%, der Anteil an Vesikeln , die Protein nicht annehmen kann ist 0.35. </li><li> Beschreiben Sie die Beziehung zwischen p (≥1 Scramblase) und PPR (mg Protein / mmol Phospholipid) durch Poisson-Statistik wie folgt: p (≥1 Scramblase) = 1 - e <sup&gt; -m = 1 - exp (-PPR / α) (Gleichung 2) ANMERKUNG: wo m = Anzahl der scramblases pro Vesikel und α = mono-exponentiellen Anpassung konstant in Einheiten von mg Protein / mmol Phospholipid. </li><li> Als ein Teil der Vesikel trägt nicht auch bei hohen PPR (siehe Diskussion) zu kriechen, ändern Sie die Gleichung: p (≥1 scramblase) = 1 - exp (-PPR * / α) (Gleichung 3) HINWEIS: Wenn PPR * = PPR / (1 ​​- f), wobei f die feuerfeste Population von Vesikeln oder in diesem Fall, PPR = * PPR / 0,65 (Gleichung 4). HINWEIS: Die Passform Konstante α wird durch den Einbau eines Graphen von p bestimmt (≥1 Scramblase) im Vergleich zu PPR * mit einem Mono-Exponentialfunktion. Wenn Opsin (Molekulargewicht 41,7 kDa) rekonstituiert funktionell in 175-nm-Durchmesser Vesikel (jedes Vesikel besitzt 280.000 Phospholipide 26) als ein Monomer, α = 0,187 mg mmol -1. Wenn Opsin dimerisiert vor 3 der Rekonstitution Scramblase aktive Vesikel zu erhalten, dann α= 0,37 mg mmol -1. Wenn PPR nicht PPR * für die Analyse verwendet werden würde, dann würden die entsprechenden α Werte 0,122 und 0,244 mg mmol -1 sein. Diese vorhergesagten Werte für α annehmen, dass alle Opsinmoleküle funktionell zuständig sind. Wenn nur ein Bruchteil der Moleküle befähigt ist, Lipide zu verwürfeln, dann werden die entsprechenden Werte von α größer sein. </li></ol></li></ol>

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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+purification,+and+functional+reconstitution+of+the+P4-ATPase+Atp8a2,+a+phosphatidylserine+flippase+in+photoreceptor+disc+membranes.">Localization purification, and functional reconstitution of the P4-ATPase Atp8a2, a phosphatidylserine flippase in photoreceptor disc membranes.</a> J. Biol. Chem. 284, 32670-32679 (2009).</li><li>Coleman, J. A., Quazi, F., Molday, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+P4-ATPases+and+ABC+transporters+and+their+role+in+phospholipid+transport.">Mammalian P4-ATPases and ABC transporters and their role in phospholipid transport.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1831, 555-574 (2013).</li><li>Romsicki, Y., Sharom, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+flippase+activity+of+the+reconstituted+P-glycoprotein+multidrug+transporter.">Phospholipid flippase activity of the reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter.</a> Biochemistry. 40, 6937-6947 (2001).</li><li>Zhou, X., Graham, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+phospholipid+translocase+activity+with+purified+Drs2p,+a+type-IV+P-type+ATPase+from+budding+yeast.">Reconstitution of phospholipid translocase activity with purified Drs2p, a type-IV P-type ATPase from budding yeast.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16586-16591 (2009).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Scramblase Aktivitätstest konnten wir ursprünglich das Opsin Phospholipid Scramblase zu bestimmen Aktivität 2 hat. Der Assay auch erlaubt uns Opsin der scramblase Aktivität zu charakterisieren , indem die Spezifität zu testen (verwendeten wir eine Vielzahl von NBD-markierten Reporter Lipiden wie NBD-Phosphatidylethanolamin, mit NBD an einer Acylkette markiert , wie für NBD-PC in Figur 1A gezeigt ist , oder auf die Kopfgruppen-, NBD-Sphingomyelin oder NBD- Phosphatidylserin 2),<...

Der Photorezeptor Rhodopsin, eine prototypische G - Protein-gekoppelten Rezeptor (beispielsweise in Bezug Bewertung 1) ist das erste Phospholipid scramblase werden identifiziert und biochemisch verifiziert 2,3. Scramblases sind Phospholipid - Transporter, die die eigen langsamen Geschwindigkeit von Transdoppel Phospholipid Bewegung physiologisch geeigneten Ebenen in einem bidirektionalen, ATP-unabhängige Weise 4-6 erhöhen. Beispiele für ihre Aktionen können im endoplasmatischen Retikulum und bakterielle Cytoplasmamembran zu finden, wo die konstitutive Scrambling für Membran - Homöostase und Wachstum notwendig ist, aber auch für eine Vielzahl von Glycosylierungswege 5. Reguliert Phospholipid Verwürfelung benötigt Phosphatidylserin (PS) auf der Oberfläche von apoptotischen Zellen zu belichten , wo es als ein &quot;eat-me&quot; -Signal für Makrophagen 7 und stellt eine prokoagulierende Oberfläche auf aktivierten Blutplättchen die Bildung von Proteinfaktor zu katalysierens für die Blutgerinnung benötigt. In Photorezeptorscheibenmembranen hat Scrambling Aktivität des Rhodopsin vorgeschlagen worden , das Phospholipid Ungleichgewicht zwischen den beiden Membran Blättchen der Bilayer entgegenzuwirken , die durch den ATP-abhängigen, unidirektionale Lipid erzeugt wird Flippase ABCA4 4,8,9 10-12. Trotz der physiologischen Bedeutung von scramblases, ihre Identität blieb schwer bis Rhodopsin als Scramblase in Photorezeptor Scheiben berichtet wurde 2, die Mitglieder des TMEM16 Proteinfamilie wurden als Ca 2+ identifiziert -abhängigen scramblases für PS - Exposition an der Plasmamembran benötigt (in Bezug prüft 13) und das bakterielle Protein FTSW wurde vorgeschlagen , wie ein Lipid II für Peptidoglycansynthese 14 erforderlich Scramblase. Diese Entdeckungen wurden basierend auf der Rekonstitution von gereinigten Proteinen in Liposomen und Demonstration scramblase Aktivität in den resultierenden Proteo die Methodik describ Verwendunghier ed. Andere potenzielle scramblases 15-21 - die MurJ und amj Proteine ​​in Peptidoglycan - Biosynthese beteiligt, WzxE und verwandte Proteine ​​verwickelt in Scrambling O-Antigen - Vorläufer, MPRF Protein benötigt aminoacylierten Phosphatidylglycerin über die bakterielle Cytoplasmamembran zu translozieren und Xkr8 Familienmitglieder , die vorgeschlagen wurden , PS auf der Oberfläche von apoptotischen Zellen zu belichten - bleiben biochemisch getestet werden. Dies unterstreicht die Bedeutung eines robusten Assays zu identifizieren und Scramblase Aktivität zu charakterisieren. Hier beschreiben wir die Rekonstitution von gereinigten Opsin, das Apoprotein des Photorezeptors Rhodopsin, in große unilamellare Vesikel (LUVs) und anschließende Analyse der scramblase Aktivität in den resultierenden Proteo eine fluoreszenzbasierten Assay. Es gibt mehrere gut beschriebenen Protokolle in der Literatur für die heterologe Expression und Reinigung von Opsin, deshalb werden wir nichtbeschreiben sie in diesem Protokoll; wir verwenden , um die in Goren beschriebenen Protokolle et al. 3 , die bei etwa 100 ng / &amp; mgr; l in 0,1% (w / v) Dodecylmaltosid (DDM) FLAG-markiertes, thermo Opsin ergibt. Die Rekonstitution wird durch die Behandlung LUVs mit ausreichend Waschmittel erreicht, so dass sie anschwellen, aber nicht lösen. Unter diesen Bedingungen wird ein Membranprotein - in Form von Protein-Mizellen Detergenz zugeführt - werden in die Liposomen zu integrieren und in die Liposomenmembran nach Entfernung des Detergens rekonstituiert geworden in Proteo führt. Zu rekonstituieren Opsin (als gereinigtes Protein erhalten in 0,1% (w / v) DDM) sind LUVs aus einem Gemisch aus POPC hergestellt (1-Palmitoyl-2-oleoyl- sn - glycero-3-phosphocholin) und POPG (1- Palmitoyl-2-Oleoyl - sn - glycero-3- [phospho-rac- (1-Glycerin)]) und mit DDM gesättigt vor dem Hinzufügen von Opsin und NBD-PC. Das Detergens wird dann durch Behandlung der Probe mit Polystyrolkügelchen entfernt. lass = &quot;jove_content&quot;&gt; Das Prinzip der Fluoreszenz basierenden Assay zugrundeliegende Aufgabe wird in 1B gezeigt. LUVs sind symmetrisch mit einer Spurenmenge von NBD-PC oder andere NBD-markierte fluoreszierende Phospholipid reporter (1A) rekonstituiert. Bei Zugabe von Dithionit, eine Membran-impermeablen Dianion, NBD-PC-Moleküle in dem äußeren Blatt der LUVs gerendert nichtfluoreszierenden als nitro-Gruppe von NBD ist mit einem nicht-fluoreszierenden Amino-Gruppe reduziert. Da weder NBD-PC-Moleküle noch Dithionit Lage sind, die Membran auf der Zeitskala des Versuchs (&lt;10 min) zu durchlaufen, ergibt dies 50% ige Reduktion des Fluoreszenzsignals. schnell nach außen kann jedoch, wenn die Liposomen mit einem scramblase, NBD-PC-Moleküle in der inneren Faltblatt rekonstituiert werden verwürfeln, wo sie reduziert sind. Daraus ergibt sich der Gesamtverlust der Fluoreszenz im idealen Fall (Abbildung 1C). es / ftp_upload / 54635 / 54635fig1.jpg &quot;/&gt; . Abbildung 1: Schematische Darstellung des Scramblase Aktivitätstest Der Test verwendet eine fluoreszierende NBD-markierten Reporter Lipid; NBD-PC angezeigt wird (A). Große unilamellare Vesikel sind mit einer Spurenmenge von NBD-PC rekonstituiert. Rekonstitution erzeugt symmetrischen Vesikeln mit NBD-PC gleichmäßig verteilt in den äußeren und inneren Blättchen. Dithionit (S 2 O 4 2-) reduziert chemisch die Nitrogruppe von NBD zu einem nicht-fluoreszierenden amino-Gruppe. Die Behandlung von proteinfreien Liposomen mit Dithionit (B, oben) bewirkt eine 50% ige Reduktion der Fluoreszenz , da nur die NBD-PC - Moleküle in der äußeren Leaflet reduziert: Dithionit negativ geladen ist und die Membran nicht überqueren können mit NBD-PC - Moleküle reagieren im inneren Blatt. Dithionit Behandlung von Opsin haltigen Proteo (B, unten), dh scramblase aktive Proteo, Ergebnisse in 100% Verlust der fluorescence als Opsin erleichtert die Bewegung von NBD-PC zwischen dem inneren und dem äußeren Faltblatt. (C) zeigt idealisierte Fluoreszenzspuren erhalten bei der Behandlung von proteinfreien Liposomen und Opsin haltigen Proteo mit Dithionit. Die Geschwindigkeit der Fluoreszenzverlust ist die gleiche in beiden Fällen das anzeigt, dass die chemische Reduktion von NBD von Dithionit ist geschwindigkeitsbestimmend, und das Verwürfeln bei einer Geschwindigkeit gleich oder größer ist als die Geschwindigkeit der chemischen Reaktion auftritt. Spuren von einem tatsächlichen Experiment sind in Abbildung 3 dargestellt. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54635/54635fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54635/54635fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Die Methoden , die wir beschreiben , können verwendet werden , um andere gereinigten Proteine ​​zu rekonstituieren und Assay sowie Mischungen von Membranproteinen erhalten werden , beispielsweise durch Mikrosomen mit Waschmittel 22 zu extrahieren.

<table><tbody><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycero-3-phosphocholine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457C</td><td>POPC</td></tr><tr><td>1-Palmitoyl-2-oleoyl-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840457C</td><td>POPG</td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl}-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycero-3-phosphocholine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810130C</td><td>NBD-PC</td></tr><tr><td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid</td><td>VWR Scientific</td><td>EM-5330</td><td>HEPES</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653-1KG</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Dodecyl-&amp;beta;-D-maltoside</td><td>Anatrace</td><td>D310 5 GM</td><td>DDM</td></tr><tr><td>Fluorimeter cuvettes</td><td>sigma</td><td>C0918-100EA</td><td>cuvettes</td></tr><tr><td>Spectrofluorometer</td><td>Photon Technology International, Inc.</td><td>fluorimeter</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydrosulfite technical grade, 85%</td><td>Sigma</td><td>157953-5G</td><td>dithionite</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 5 software</td><td></td><td></td><td>Prism</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>VWR</td><td>JTX171-3</td><td>Tris</td></tr><tr><td>LIPEX 10 ml extruder&amp;nbsp;</td><td>Northern Lipids, Inc.</td><td></td><td>Extruder</td></tr><tr><td>Whatman, Drain disc, PE, 25 mm</td><td>Sigma</td><td>28156-243</td><td>Disc support</td></tr><tr><td>Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes, 0.4 &amp;micro;m, 25 mm diameter</td><td>Sigma</td><td>WHA110607</td><td>400 nm membrane</td></tr><tr><td>Whatman Nucleopore Track-Etched Membranes, 0.2 &amp;micro;m, 25 mm diameter</td><td>Sigma</td><td>WHA110606</td><td>200 nm membrane</td></tr><tr><td>sodium phosphate</td><td>Sigma</td><td>S3264-500G</td><td></td></tr><tr><td>VWR Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass, 13 x 100 mm</td><td>VWR Scientific</td><td>47729-572</td><td>glass tubes</td></tr><tr><td>Perchloric acid</td><td>Sigma</td><td>30755-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Molybdate Tetrahydrate</td><td>Sigma</td><td>A-7302</td><td>ammonium molybdate</td></tr><tr><td>(+)-Sodium L-ascorbate</td><td>Sigma</td><td>A7631-25G</td><td>sodium ascorbate</td></tr><tr><td>Bio-Beads SM2 adsorbents</td><td>Bio Rad</td><td>1523920</td><td>polystyrene beads</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;2.0 ml Microtubes clear</td><td>VWR Scientific</td><td>10011-742</td><td>Reconstitution tubes</td></tr><tr><td>Reconstitution glass tube</td><td>VWR Scientific</td><td>53283-800</td><td>Reconstitution glass tubes</td></tr><tr><td>Zetasizer&amp;nbsp;</td><td>Malvern&amp;nbsp;</td><td></td><td>DLS</td></tr></tbody></table>

a fluorescence-based assay of phospholipid scramblase activity

Scramblases transloziert Phospholipiden durch die Membran-Doppelschicht in zwei Richtungen in einer ATP-unabhängige Art und Weise. Die erste scramblase werden identifiziert und biochemisch wurde Opsin prüft, das Apoprotein des Photorezeptors Rhodopsin. Rhodopsin ist ein G-Protein-gekoppelten Rezeptor in Stabphotorezeptor Scheibenmembranen der Retina lokalisiert, wo es für die Wahrnehmung von Licht verantwortlich ist. Rhodopsin der Scramblase Aktivität nicht auf seinem Liganden abhängt 11- cis - Retinal, das heißt, das Apoprotein Opsin ist auch aktiv als Scramblase. Obwohl die konstitutive und reguliert Scrambling Phospholipid eine wichtige Rolle in der Zellphysiologie zu spielen, nur wenige Phospholipid scramblases wurden bisher neben Opsin identifiziert. Hier beschreiben wir ein Fluoreszenz-basierten Assay von Scramblase Aktivität des Opsin. Opsin rekonstituiert in große unilamellare Liposomen aus Phosphatidylcholin, Phosphatidylglycerin und eine Spurenmenge an fluoreszierenden NBD-markierten PC (1-palmitoyl-2- {6- [7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino] hexanoyl} - sn - glycero-3-phosphocholin). Scramblase Aktivität wird durch Messen der Größe der auf dem NBD-PC-Moleküle in dem inneren Blatt des Vesikels befindet sind in der Lage die äußere Faltblatt zuzugreifen, wo ihre Fluoreszenz chemisch durch ein Reduktionsmittel eliminiert wird, die die Membran nicht passieren kann. Die Methoden, die wir haben eine allgemeine Anwendbarkeit beschreiben und kann verwendet werden, Scramblase Aktivitäten anderer Membranproteine ​​zu identifizieren und zu charakterisieren.

Wir beschreiben die Rekonstitution von Opsin in LUVs unter Verwendung eines fluoreszenzbasierten Assays seiner Scramblase Aktivität zu charakterisieren. Wir analysieren die Ergebnisse eine untere Grenze auf die Geschwindigkeit des Opsin-vermittelten Phospholipid zu platzieren Scrambling und die oligomere Zustand zu bestimmen, in dem Opsin funktionell in den Vesikeln rekonstituiert. Um eine optimale Rekonstituierung Bedingunge...

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A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

We describe a fluorescence-based assay to measure phospholipid scrambling in large unilamellar liposomes reconstituted with opsin.

Ein Fluoreszenz-basierte Assay von Phospholipid Scramblase Activity

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

a-fluorescence-based-assay-of-phospholipid-scramblase-activity

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

13.8K Aufrufe.  Weill Cornell Medical College. We describe a fluorescence-based assay to measure phospholipid scrambling in large unilamellar liposomes reconstituted with opsin. 

Serie: A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a determinant phosphoinositide of the plasma membrane (PM), and it is required to modulate ion channels, actin dynamics, exocytosis, endocytosis, intracellular signaling, and many other cellular processes. However, the spatial organization of PI(4,5)P2 in the PM is controversial, and its nanoscale distribution is poorly understood due to the technical limitations of research approaches. Here by utilizing single molecule localization microscopy and the Pleckstrin Homology (PH) domain based dual color fluorescent probes, we describe a novel method to visualize the nanoscale distribution of PI(4,5)P2 in the PM in fixed membrane sheets as well as live cells.

PI(4,5)P2 regulates various cellular functions, but its nanoscale organization in the cell plasma membrane is poorly understood. By labeling PI(4,5)P2 with a dual-color fluorescent probe fused to the Pleckstrin Homology domain, we describe a novel approach to study the PI(4,5)P2 spatial distribution in the plasma membrane at the nanometer scale.

Einzelmolekül-Super-Resolution Imaging von Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat in der Plasmamembran mit neuartigen Fluoreszenzsonden

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

Forschung

Biochemie

Defining Substrate Specificities for Lipase and Phospholipase Candidates

Microorganisms produce a wide spectrum of (phospho)lipases that are secreted in order to make external substrates available for the organism. Alternatively, other (phospho)lipases may be physically associated with the producing organism causing a turnover of intrinsic lipids and frequently giving rise to a remodeling of the cellular membranes. Although potential (phospho)lipases can be predicted with a number of algorithms when the gene/protein sequence is available, experimental proof of the enzyme activities, substrate specificities, and potential physiological functions has frequently not been obtained. This manuscript describes the optimization of assay conditions for prospective (phospho)lipases with unknown substrate specificities and how to employ these optimized conditions in the search for the natural substrate of a respective (phospho)lipase. Using artificial chromogenic substrates, such as p-nitrophenyl derivatives, may help to detect a minor enzymatic activity for a predicted (phospho)lipase under standard conditions. Having encountered such a minor enzymatic activity, the distinct parameters of an enzyme assay can be varied in order to obtain a more efficient hydrolysis of the artificial substrate. After having determined the conditions under which an enzyme works well, a variety of potential natural substrates should be assayed for their degradation, a process that can be followed employing distinct chromatographic methods. The definition of substrate specificities for new enzymes, often provides hypotheses for a potential physiological role of these enzymes, which then can be tested experimentally. Following these guidelines, we were able to identify a phospholipase C (SMc00171) that degrades phosphatidylcholine to phosphocholine and diacylglycerol, in a crucial step for the remodeling of membranes in the bacterium Sinorhizobium meliloti upon phosphorus-limiting conditions of growth. For two predicted patatin-like phospholipases (SMc00930 and SMc01003) of the same organism, we could redefine their substrate specificities and clarify that SMc01003 is a diacylglycerol lipase.

Many predicted (phospho)lipases are poorly characterized with regard to their substrate specificities and physiological functions. Here we provide a protocol to optimize enzyme activities, search for natural substrates, and propose physiological functions for these enzymes.

Definieren von Substratspezifität für Lipase und Phospholipase-Kandidaten

Microorganisms produce a wide spectrum of (phospho)lipases that are secreted in order to make external substrates available for the organism. ...

Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening

Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral membrane enzymes, resulting in triacylated proteins. The first step in the lipoprotein modification pathway involves the transfer of a diacylglyceryl group from phosphatidylglycerol onto the prolipoprotein, resulting in diacylglyceryl prolipoprotein. In the second step, the signal peptide of prolipoprotein is cleaved, forming an apolipoprotein, which in turn is modified by a third fatty acid derived from a phospholipid. This last step is catalyzed by apolipoprotein N-acyltransferase (Lnt). The lipoprotein modification pathway is essential in most &#947;-proteobacteria, making it a potential target for the development of novel antibacterial agents. Described here is a sensitive assay for Lnt that is compatible with high-throughput screening of small inhibitory molecules. The enzyme and substrates are membrane-embedded molecules; therefore, the development of an in vitro test is not straightforward. This includes the purification of the active enzyme in the presence of detergent, the availability of alkyne-phospholipids and diacylglyceryl peptide substrates, and the reaction conditions in mixed micelles. Furthermore, in order to use the activity test in a high-throughput screening (HTS) setup, direct readout of the reaction product is preferred over coupled enzymatic reactions. In this fluorometric enzyme assay, the alkyne-triacylated peptide product is rendered fluorescent through a click-chemistry reaction and detected in a multiwell plate format. This method is applicable to other acyltransferases that use fatty acid-containing substrates, including phospholipids and acyl-CoA.

Presented here is a sensitive fluorescence assay to monitor apolipoprotein N-acyltransferase activity using diacylglyceryl peptide and alkyne-phospholipids as substrates with click-chemistry.

Klickchemischer fluorometrischer Assay für Apolipoprotein-N-Acyltransferase von der Enzymcharakterisierung bis zum Hochdurchsatz-Screening

Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after merging (FRAM). FRAM adopts the same principles as the fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) technique, especially for measuring fluorescence recovery after bleaching a specific area, but FRAM uses a drop coalescence instead of photobleaching dye molecules to induce a chemical potential gradient of dye molecules. Our technique has several advantages over FRAP: it only requires a fluorescence microscope rather than a confocal microscope equipped with high power lasers; it is essentially free from the selection of fluorescence dyes; and it has far more freedom to define the measured diffusion area. Furthermore, FRAM potentially provides a route for studying the mixing or inter-diffusion of two different surfactants, when the monolayers at a surface of droplet and at a flat air/water interface are prepared with different species, independently.

We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.

Fluorescence Recovery nach der Zusammenführung ein Droplet, um die zweidimensionale Diffusion eines Phospholipidschicht Messen

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

Biotechnik

Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide

Cell-penetrating peptides (CPPs) are defined as carriers that are able to cross the plasma membrane and to transfer a cargo into cells. One of the main common features required for this activity resulted from the interactions of CPPs with the plasma membrane (lipids) and more particularly with components of the extracellular matrix of the membrane itself (heparan sulphate). Indeed, independent of the direct translocation or the endocytosis-dependent internalization, lipid bilayers are involved in the internalization process both at the level of the plasma membrane and at the level of intracellular traffic (endosomal vesicles). In this article, we present a detailed protocol describing the different steps of a large unilamellar vesicles (LUVs) formulation, purification, characterization, and application in fluorescence leakage assay in order to detect possible CPP-membrane destabilization/interaction and to address their role in the internalization mechanism. LUVs with a lipid composition reflecting the plasma membrane content are generated in order to encapsulate both a fluorescent dye and a quencher. The addition of peptides in the extravesicular medium and the induction of peptide-membrane interactions on the LUVs might thus induce in a dose-dependent manner a significant increase in fluorescence revealing a leakage. Examples are provided here with the recently developed tryptophan (W)- and arginine (R)-rich Amphipathic Peptides (WRAPs), which showed a rapid and efficient siRNA delivery in various cell lines. Finally, the nature of these interactions and the affinity for lipids are discussed to understand and to improve the membrane translocation and/or the endosomal escape.

The fluorescence leakage assay is a simple method that enables the investigation of peptide/membrane interactions in order to understand their involvement in several biological processes and especially the ability of cell-penetrating peptides to disturb phospholipids bilayers during a direct cellular translocation process.

Fluoreszenz-Leckage-Assay zur Untersuchung der Membrandestabilisierung durch zelldurchdringendes Peptid

Cell-penetrating peptides (CPPs) are defined as carriers that are able to cross the plasma membrane and to transfer a cargo into cells. One of the main ...

Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found to represent a novel lipid transfer protein (LTP) group in yeast and human cells. They transfer phosphatidylserine (PS) from the endoplasmic reticulum (ER) to the plasma membrane (PM) via PS/phosphatidylinositol 4-phosphate (PI(4)P) exchange cycles. This finding allows a better understanding of how PS, which is critical for signaling processes, is distributed throughout the cell and the investigation of the link between this process and phosphoinositide (PIP) metabolism. The development of new fluorescence-based protocols has been instrumental in the discovery and characterization of this new cellular mechanism in vitro at the molecular level. This paper describes the production and the use of two fluorescently labelled lipid sensors, NBD-C2Lact and NBD-PHFAPP, to measure the ability of a protein to extract PS or PI(4)P and to transfer these lipids between artificial membranes. First, the protocol describes how to produce, label, and obtain high-purity samples of these two constructs. Secondly, this paper explains how to use these sensors with a fluorescence microplate reader to determine whether a protein can extract PS or PI(4)P from liposomes, using Osh6p as a case study. Finally, this protocol shows how to accurately measure the kinetics of PS/PI(4)P exchange between liposomes of defined lipid composition and to determine lipid transfer rates by fluorescence resonance energy transfer (FRET) using a standard fluorometer.

Here, we describe protocols using fluorescent lipid sensors and liposomes to determine whether a protein extracts and transports phosphatidylserine or phosphatidylinositol 4-phosphate in vitro.

Fluoreszenzbasierte Messungen des Phosphatidylserin/Phosphatidylinositol-4-Phosphat-Austauschs zwischen Membranen

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found ...

Gramicidin-based Fluorescence Assay; for Determining Small Molecules Potential for Modifying Lipid Bilayer Properties

Many drugs and other small molecules used to modulate biological function are amphiphiles that adsorb at the bilayer/solution interface and thereby alter lipid bilayer properties. This is important because membrane proteins are energetically coupled to their host bilayer by hydrophobic interactions. Changes in bilayer properties thus alter membrane protein function, which provides an indirect way for amphiphiles to modulate protein function and a possible mechanism for "off-target" drug effects. We have previously developed an electrophysiological assay for detecting changes in lipid bilayer properties using linear gramicidin channels as probes 3,12. Gramicidin channels are mini-proteins formed by the transbilayer dimerization of two non-conducting subunits. They are sensitive to changes in their membrane environment, which makes them powerful probes for monitoring changes in lipid bilayer properties as sensed by bilayer spanning proteins. We now demonstrate a fluorescence assay for detecting changes in bilayer properties using the same channels as probes. The assay is based on measuring the time-course of fluorescence quenching from fluorophore-loaded large unilamellar vesicles due to the entry of a quencher through the gramicidin channels. We use the fluorescence indicator/quencher pair 8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonate (ANTS)/Tl+ that has been successfully used in other fluorescence quenching assays 5,13. Tl+ permeates the lipid bilayer slowly 8 but passes readily through conducting gramicidin channels 1,14. The method is scalable and suitable for both mechanistic studies and high-throughput screening of small molecules for bilayer-perturbing, and potential "off-target", effects. We find that results using this method are in good agreement with previous electrophysiological results 12.

We introduce a fast fluorescence-based assay that monitors the rate of fluorescence quenching as a measure of gramicidin channel activity. The gramicidin channels are used as molecular force transducers to monitor changes in lipid bilayer properties as sensed by bilayer spanning proteins.

Gramicidin-basierte Fluoreszenz-Assay; zur Bestimmung Small Molecules Potential für das Ändern von Lipid-Doppelschicht-Eigenschaften

Many drugs and other small molecules used to modulate biological function are amphiphiles that adsorb at the bilayer/solution interface and thereby alter ...

Biologie

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

Lipidvesikel-vermittelte Affinitätschromatographie unter Verwendung von Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): Eine neue Methode zur Protein-Lipid-Wechselwirkungen Analyze

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. During neurotransmitter or hormone release via exocytosis, the fusion pore can transiently open and close repeatedly, regulating cargo release kinetics. Pore dynamics also determine the mode of vesicle recycling; irreversible resealing results in transient, &#34;kiss-and-run&#34; fusion, whereas dilation leads to full fusion. To better understand what factors govern pore dynamics, we developed an assay to monitor membrane fusion using polarized total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy with single molecule sensitivity and ~15 msec time resolution in a biochemically well-defined in vitro system. Fusion of fluorescently labeled small unilamellar vesicles containing v-SNARE proteins (v-SUVs) with a planar bilayer bearing t-SNAREs, supported on a soft polymer cushion (t-SBL, t-supported bilayer), is monitored. The assay uses microfluidic flow channels that ensure minimal sample consumption while supplying a constant density of SUVs. Exploiting the rapid signal enhancement upon transfer of lipid labels from the SUV to the SBL during fusion, kinetics of lipid dye transfer is monitored. The sensitivity of TIRF microscopy allows tracking single fluorescent lipid labels, from which lipid diffusivity and SUV size can be deduced for every fusion event. Lipid dye release times can be much longer than expected for unimpeded passage through permanently open pores. Using a model that assumes retardation of lipid release is due to pore flickering, a pore &#34;openness&#34;, the fraction of time the pore remains open during fusion, can be estimated. A soluble marker can be encapsulated in the SUVs for simultaneous monitoring of lipid and soluble cargo release. Such measurements indicate some pores may reseal after losing a fraction of the soluble cargo.

Here, we present a protocol to detect single, SNARE-mediated fusion events between liposomes and supported bilayers in microfluidic channels using polarized TIRFM, with single molecule sensitivity and ~15 msec time resolution. Lipid and soluble cargo release can be detected simultaneously. Liposome size, lipid diffusivity, and fusion pore properties are measured.

SNARE-vermittelte Fusion von Einzelproteoliposomen mit Tethered Unterstützte Bilayers in einer Zelle Mikrofluidik-Flow-Überwacht durch polarisierte TIRF Mikroskopie

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. ...

Neurowissenschaften

pH Modulation Assay on Supported Lipid Bilayers to Detect Protein-Phosphoinositide Interactions

Source: Shengjuler, D., et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/55869">PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions.</a> J. Vis. Exp. (2017)
In this video, we demonstrate protein-phosphoinositide interactions in a microfluidic pattern using the pH modulation assay, using pH-sensitive fluorescent dye tagged to phosphatidylethanolamine lipid of a supported lipid bilayer, called a microfluidic platform. The modulations in pH after protein binding to phospholipid cause fluorescence quenching.