This study was supported by the Velux Stiftung (A.K.M.), NIH grant EY024207 (A.K.M.) and the Austrian Science Fund (FWF) project J3686 (B.P.).

1. Preparazione di liposomi e proteoliposomi <ol><li> Formazione liposomi <ol><li> Usando una siringa di vetro, aggiungere 1.435 microlitri POPC (25 mg / ml, in cloroformio) e 160 microlitri POPG (25 mg / ml, in cloroformio) in un pallone a fondo rotondo da ottenere 52,5 mmol lipidi in un rapporto molare di POPC: POPG = 9: 1. </li><li> Essiccare i lipidi per 30 minuti usando un evaporatore rotante ad una velocità di rotazione di 145 rpm (senza bagno d&#39;acqua è necessaria per questo volume di solvente), quindi trasferire il pallone in un essiccatore sotto vuoto per almeno 3 ore, o durante la notte, a temperatura ambiente (RT). </li><li> Idratare il film lipidico essiccato con 10 ml di 50 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl (di seguito indicato come tampone A) agitando delicatamente il pallone fino a omogenei, risultati sospensione torbida; NOTA: La concentrazione di lipidi in questa fase dovrebbe essere 5,25 mM come perdite dovrebbero sono verificate finora. </li><li> Sonicare la sospensione a bagnomaria per 10 minuti a temperatura ambiente con una frequenza of 40 kHz. La soluzione sarà un po &#39;più chiara. </li><li> Utilizzando un estrusore, passare la sospensione per 10 volte attraverso una membrana con dimensione dei pori di 400 nm, seguito da un secondo ciclo di estrusione con 4 passa attraverso una membrana con dimensione dei pori di 200 nm. NOTA: Il diametro medio delle luvs risultante è ~ 175 nm. Se necessario, le dimensioni e l&#39;omogeneità delle luvs possono essere controllati da Dynamic Light Scattering secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Quantificare la concentrazione di fosfolipidi della sospensione LUV come descritto nel paragrafo 1.2). NOTA: A causa delle perdite durante l&#39;estrusione, la concentrazione è di solito circa 3,6 mm. </li><li> Conservare i luvs a 4 ° C per circa 2 settimane, se non utilizzato immediatamente. </li></ol></li><li> Quantificazione fosfolipide NOTA: Per determinare la concentrazione di fosfolipidi della sospensione LUV usato per la ricostituzione, così come quella dei proteoliposomi che vengono eventualmente generati, una aliquota del campione è subjeCTED all&#39;ossidazione da acido perclorico. Questa procedura si rompe fosfolipidi per rilasciare fosfato inorganico che viene poi quantificato mediante un saggio colorimetrico in confronto con standard 23. <ol><li> Preparare una soluzione 40 mM magazzino di fosfato di sodio (Na 2 HPO 4) in acqua distillata deionizzata. </li><li> Diluire la soluzione madre con acqua distillata deionizzata per ottenere 4 mm e 0,4 mm di soluzioni che serviranno come standard di calibrazione di lavoro. </li><li> Utilizzando le soluzioni di lavoro, preparare standard in 13 provette x 100 mm 2 di vetro che vanno da 0 a 80 nmol fosfato di sodio in un volume finale di 50 pl. </li><li> Prendere 10 ml ciascuno dei campioni Luv e proteoliposome da quantificare e diluire con 40 ml di DDH 2 O in 13 tubi x 100 mm 2 di vetro. NOTA: Poiché la concentrazione di lipidi delle luvs e proteoliposomi è nell&#39;intervallo 2.5-5 mM, 10 microlitri del campione dovrebbe contenere 25-50 nmol lipidi fosforo.</li><li> Aggiungere 300 pl di acido perclorico a ciascuno degli standard e campioni e calore per 1 ora a 145 ° C su una piastra riscaldante. Mettere marmi sui tubi per evitare l&#39;evaporazione. </li><li> Lasciate che i tubi raffreddare a temperatura ambiente e aggiungere 1 ml di DDH 2 O. </li><li> Aggiungere 400 ml ciascuna di appena preparato 12 g / L molibdato di ammonio e 50 g / L di ascorbato di sodio e vortex per miscelare. </li><li> Calore per 10 min a 100 ° C con marmi sopra dei tubi. Rimuovere i tubi dal blocco di riscaldamento e lasciarli raffreddare a temperatura ambiente. </li><li> Misurare l&#39;assorbanza dei campioni contro il (campione standard contenente 0 nmol sodio fosfato) in bianco con uno spettrometro ad una lunghezza d&#39;onda di 797 nm. </li><li> Determinare il contenuto di fosfati di campioni contro la curva standard di calibrazione. </li></ol></li><li> Ricostituzione di opsin NOTA: È necessario determinare le condizioni ottimali per la ricostituzione gonfiore quanto questi dipendono dalla natura del detergente, nonchéla composizione lipidica e la concentrazione dei luvs. Come luvs cambiano le loro proprietà di scattering di luce sul gonfiore del processo possono essere monitorati misurando l&#39;assorbanza (figura 2), come recensito da Rigaud e Levy 24 e Geertsma et al. 25. <ol><li> Pipettare 800 ml di luvs (dal punto 1.1, come il recupero dei lipidi dopo l&#39;estrusione è del 70%, la concentrazione prevista di luvs è da 3.6 mm fosfolipidi) in una provetta per microcentrifuga da 2 ml. </li><li> Aggiungere 5,3 ml di tampone A e 34,7 ml di 10% (w / v) DDM disciolto in tampone A. </li><li> Incubare per 3 ore a temperatura ambiente con miscelazione end-over-end. </li><li> Nel frattempo preparare le perle di polistirene: <ol><li> Utilizzare 400 mg di perline per campione e pesare in un bicchiere di vetro. </li><li> Lavare due volte con metanolo, tre volte con acqua e una volta con tampone A. Per ogni utilizzo fase di lavaggio 5 ml di liquido e mescolare lentamente per 10 minuti. NOTA: Si consiglia di preparare il polistireneperline per diversi campioni alla volta, ad esempio, pesano in 6 g di perline e lavare con 75 ml di liquido. perline in eccesso possono essere conservate in frigorifero per diversi giorni. </li></ol></li><li> Durante gli ultimi 30 min di vescicole destabilizzazione asciugare il fosfolipide NBD marcato in un tubo di vetro con tappo a vite ( &#39;la ricostituzione tubo di vetro&#39;): Per esempio, 9,5 ml di NBD-PC (1 mg / ml in cloroformio, ottenendo 0,4 moli% dei fosfolipidi totali) sono a secco sotto flusso di azoto in un tubo di vetro e successivamente disciolto in 45 ml di 0,1% (w / v) DDM in tampone A. </li><li> Dopo 3 h di vescicole destabilizzazione aggiungere il fosfolipide sciolto-NBD-marcato, la proteina DDM-solubilizzato e tampone A tale che il volume finale di 1 ml contiene 0,36% (w / v), cioè, 7 mM, DDM. <ol><li> Così, per generare liposomi privi di proteine ​​(usato come campione di controllo) aggiungere 45 ml di NBD-PC (sciolti in 0,1% DDM), 60 ml di 0,1% DDM e 55 ml di tampone A; per proteoliposomi aggiungere, per l&#39;esamepio, 40 ml di proteine ​​(da una tipica soluzione stock di ~ 110 ng / ml) nel 0,1% DDM, 45 ml di NBD-PC (disciolti in 0,1% DDM), 20 ml di 0,1% DDM e 55 ml di tampone A . NOTA: L&#39;ordine delle aggiunte deve essere come indicato. </li></ol></li><li> Mescolare il campione per un fine hr supplementare rispetto all&#39;estremità a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 80 mg delle perle di polistirene preparato e incubare il campione con end-over-end miscelazione per 1 ora a RT. </li><li> Successivo aggiungere un ulteriore 160 mg di perle di polistirene e incubare con end-over-end miscelazione per ulteriori 2 ore a RT. </li><li> Trasferire il campione (lasciando le sferette di polistirene spesi dietro) in una provetta di vetro con tappo a vite contenenti 160 mg di perle di polistirene freschi e mescolare notte a 4 ° C. NOTA: Il modo più semplice per trasferire il campione ed evitare risucchiando perline è usare una pipetta Pasteur che viene spinto verso il fondo del tubo di vetro con una leggera pressione positiva. Una volta che la punta della pipetta è saldamente alfondo del tubo, il campione può essere estratto facilmente senza interferenze dalle perline. </li><li> La mattina seguente, trasferire il campione in una provetta da microcentrifuga senza riporto di perline e posto sul ghiaccio in preparazione per il saggio di attività scramblase. </li></ol></li></ol> 2. Scramblase Activity Assay NOTA: L&#39;intensità di fluorescenza di liposomi o proteoliposomi diluiti con tampone A è monitorata nel tempo dopo l&#39;aggiunta di ditionito in uno spettrometro a fluorescenza. Per ottenere un&#39;intensità partire stabile, la fluorescenza viene registrato per almeno 50 secondi (o fino a quando si ottiene un segnale stabile) prima di aggiungere ditionito ad un campione costantemente agitata e viene poi seguito per almeno 500 secondi dopo l&#39;aggiunta ditionito. <ol><li> Aggiungere 1.950 ml di tampone A ad una cuvetta di plastica contenente un mini stir-bar. </li><li> Aggiungere 50 ml di Proteo preparata (liposomi) e lasciare che il campione di equilibrare in Spectro a fluorescenzameter con agitazione costante per diversi secondi. </li><li> Nel frattempo preparare una soluzione di 1 M ditionito in 0,5 M buffer Tris (ad esempio, per due campioni pesare 20 mg di ditionito in una provetta per microcentrifuga e dissolvono in 114 microlitri ghiacciata 0,5 M Tris direttamente prima dell&#39;uso e mantenere in ghiaccio per il prossimo campione). NOTA: La soluzione ditionito deve essere preparata al momento e non deve essere utilizzato più di 20 minuti dopo la preparazione; se molte misurazioni devono essere effettuate, aliquote di ditionito possono essere pesati in anticipo e sciolti destra prima dell&#39;uso. </li><li> Avviare il monitoraggio a fluorescenza (eccitazione 470 nm, emissione di 530 nm, fessura di larghezza 0,5 nm). </li><li> Aggiungere 40 ml di soluzione di ditionito 1 M alla cuvetta 50 sec dopo aver iniziato la fluorescenza registrazione (utilizzare il setto nel coperchio della camera cuvetta se possibile) e continuare a registrare la fluorescenza per un ulteriore 400-600 sec. </li><li> Analizzare i dati come descritto nella sezione 3. </li></ol> 3.Analisi dei dati <ol><li> Cinetica di Scrambling <ol><li> Caratterizzare la traccia fluorescenza di ciascun campione ottenuto dal saggio di attività scramblase definendo fluorescenza iniziale, F i, prima di aggiungere ditionito, e la fluorescenza end-point, F, raggiunta dopo&gt; 400 sec. F i è determinato per ogni campione come il valore medio della fluorescenza per il periodo di 30 sec prima dell&#39;aggiunta ditionito. </li><li> Determinare i dati end-point corrispondente alla misura della riduzione di fluorescenza, R = 100 • F / F i. Usiamo i termini R L per liposomi senza proteine ​​e R P per proteoliposomi opsin contenenti. </li></ol></li><li> Determinare il peso molecolare del Funzionalmente ricostituito Scramblase <ol><li> Convertire i dati di riduzione di fluorescenza secondo la seguente equazione: p (≥1 scramblase) = (R P - R L) / (R max - R L) (Equazione 1) NOTA: Dove R max è la massima riduzione che si ottiene quando la proteina sufficiente ricostituito tale che tutti vescicole nel campione possiedono almeno un scramblase funzionali, e p è la probabilità che una particolare vescicole in un campione ricostituito viene &#39;scramblase-active&#39;, cioè, possiede almeno un scramblase funzionale. Il valore di R L è tipicamente 45% 3 mentre R max è tipicamente 82,5% 3, anziché il previsto 100% (R può essere determinata sperimentalmente per proteoliposomi opsin con PPR&gt; 1 mg / mmol max). Come R max &lt;100% si assume che una sotto-popolazione di vescicole refrattaria alla ricostituzione. Per R max = 82,5%, la frazione di vescicole che è in grado di accettare proteina è 0.35. </li><li> Descrivere la relazione tra p (≥1 scramblase) e PPR (mg di proteina / mmol fosfolipidi) dalle statistiche Poisson come segue: p (≥1 scramblase) = 1 - e <sup&gt; -m = 1 - exp (-PPR / α) (Equazione 2) NOTA: Dove m = numero di scramblases per vescicole e α = mono-esponenziale costante adattamento in unità di mg fosfolipidi proteine ​​/ mmol. </li><li> Come una frazione delle vescicole non contribuisce a scrambling anche ad alte PPR (vedi la discussione), modificare l&#39;equazione: p (≥1 scramblase) = 1 - exp (-PPR * / α) (Equazione 3) NOTA: Dove PPR * = PPR / (1- f), dove f è la popolazione refrattaria di vescicole o, in questo caso, PPR * = PPR / 0.65 (Equazione 4). NOTA: L&#39;adattamento α costante è determinata inserendo un grafico di p (≥1 scramblase) rispetto PPR * con funzione mono-esponenziale. Se opsina (peso molecolare 41,7 kDa) ricostituisce funzionalmente in vescicole 175-nm di diametro (ogni vescicola ha 280.000 fosfolipidi 26) come monomero, a = 0,187 mg mmol -1. Se opsina dimerizza prima della ricostituzione 3 per produrre vescicole scramblase-attivo, allora α= 0,37 mg mmol -1. Se PPR piuttosto che PPR * dovevano essere utilizzati per l&#39;analisi, quindi i corrispondenti valori alfa sarebbero 0,122 e 0,244 mg mmol -1. Questi valori previsti per α per scontato che tutte le molecole opsin sono funzionalmente competente. Se solo una frazione delle molecole è competente per rimescolare i lipidi, allora i corrispondenti valori di α sarà maggiore. </li></ol></li></ol>

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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+purification,+and+functional+reconstitution+of+the+P4-ATPase+Atp8a2,+a+phosphatidylserine+flippase+in+photoreceptor+disc+membranes.">Localization purification, and functional reconstitution of the P4-ATPase Atp8a2, a phosphatidylserine flippase in photoreceptor disc membranes.</a> J. Biol. Chem. 284, 32670-32679 (2009).</li><li>Coleman, J. A., Quazi, F., Molday, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+P4-ATPases+and+ABC+transporters+and+their+role+in+phospholipid+transport.">Mammalian P4-ATPases and ABC transporters and their role in phospholipid transport.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1831, 555-574 (2013).</li><li>Romsicki, Y., Sharom, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+flippase+activity+of+the+reconstituted+P-glycoprotein+multidrug+transporter.">Phospholipid flippase activity of the reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter.</a> Biochemistry. 40, 6937-6947 (2001).</li><li>Zhou, X., Graham, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+phospholipid+translocase+activity+with+purified+Drs2p,+a+type-IV+P-type+ATPase+from+budding+yeast.">Reconstitution of phospholipid translocase activity with purified Drs2p, a type-IV P-type ATPase from budding yeast.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16586-16591 (2009).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il saggio di attività scramblase ci ha permesso inizialmente di determinare che opsin ha fosfolipidi attività scramblase 2. Il test ha anche permesso di caratterizzare l&#39;attività scramblase di opsin testando specificità (abbiamo usato una varietà di lipidi giornalista NBD-etichettati come NBD-fosfatidiletanolamina, marcato con NBD su una catena acilica come mostrato ad NBD-PC in Figura 1A, o headgroup, NBD-sfingomielina o NBD- fosfatidilserina 2), l&#39;effetto di vescicol...

La rodopsina fotorecettore, un G protein-coupled receptor prototipo (recensito ad esempio in riferimento 1), è il primo scramblasi essere identificati e biochimicamente verificato 2,3. Scramblases sono trasportatori fosfolipidi che aumentano il tasso intrinsecamente lento movimento transbilayer fosfolipide a fisiologicamente livelli appropriati in un bidirezionale, modalità ATP-indipendenti 4-6. Esempi di loro azioni possono essere trovati nel reticolo endoplasmatico e batterica membrana citoplasmatica dove è necessaria scrambling costitutivo per l&#39;omeostasi di membrana e la crescita, così come per una varietà di percorsi di glicosilazione 5. Scrambling fosfolipide regolamentata è necessaria per esporre fosfatidilserina (PS) sulla superficie delle cellule apoptotiche dove agisce come un &quot;mangia-me&quot; -signal per macrofagi 7 e fornisce una superficie procoagulante sulle piastrine attivate per catalizzare la produzione di fattore proteicos necessaria per la coagulazione del sangue. In membrane disco fotorecettori, l&#39;attività scrambling di rodopsina è stato suggerito di contrastare lo squilibrio fosfolipidi tra i due volantini membrana del doppio strato che viene generato dalla ATP-dipendente, lipidi unidirezionale flippase ABCA4 4,8,9 10-12. Nonostante l&#39;importanza fisiologica di scramblases, la loro identità è rimasta inafferrabile fino rodopsina è stato segnalato come un scramblase nei dischi dei fotorecettori 2, i membri della famiglia di proteine ​​TMEM16 sono stati identificati come Ca 2+ scramblases -dipendenti necessari per l&#39;esposizione di PS a livello della membrana plasmatica (recensione in riferimento 13), e la proteina batterica FTSW stato proposto come scramblase richiesto un lipide II per la sintesi del peptidoglicano 14. Queste scoperte sono state basate sulla ricostituzione delle proteine ​​purificate in liposomi e dimostrazione di attività scramblase nelle proteoliposomi risultanti mediante la metodologia describcato qui. Altri potenziali scramblases 15-21 - Le proteine ​​MurJ e AMJ implicati nella biosintesi peptidoglicano, WzxE e proteine ​​correlate implicati in rimescolando precursori O-antigene, le proteine ​​MPRF bisogno di traslocare phosphatidylglycerol aminoacylated attraverso la membrana citoplasmatica batterica, e membri della famiglia Xkr8 che sono stati proposti esporre PS sulla superficie delle cellule apoptotiche - restano da testare biochimicamente. Questo mette in evidenza l&#39;importanza di un saggio robusto per identificare e caratterizzare l&#39;attività scramblase. Qui, descriviamo la ricostituzione di opsin purificata, la apoprotein della rodopsina fotorecettore, in grandi vescicole unilamellari (luvs), e la successiva analisi dell&#39;attività scramblase nelle proteoliposomi risultante utilizzando un saggio basato sulla fluorescenza. Ci sono diversi protocolli ben descritto in letteratura per l&#39;espressione eterologa e purificazione di opsin, quindi non ci saràdescriverlo in questo protocollo; usiamo i protocolli descritti nelle Goren et al. 3, che i rendimenti FLAG-tag, opsina termostabile a circa 100 ng / ml a 0,1% (w / v) dodecylmaltoside (DDM). Ricostituzione si ottiene trattando luvs con detersivo sufficiente in modo che si gonfiano, ma non si sciolgono. In queste condizioni, una proteina di membrana - fornita in forma di micelle proteina-detergente - integrerà nei liposomi e diventare ricostituito nella membrana del liposoma alla rimozione del detersivo, causando proteoliposomi. Per ricostituire opsin (ottenuto come proteina purificata nello 0,1% (w / v) DDM), luvs sono preparati da una miscela di POPC (1-palmitoil-2-oleoyl- sn -glycero-3-phosphocholine) e POPG (1- palmitoil-2-oleoyl- SN -glycero-3- [fosfo-rac- (1-glicerolo)]) e satura di DDM prima di aggiungere opsina e NBD-PC. Il detergente viene poi rimosso mediante trattamento del campione con perle di polistirene. lass = &quot;jove_content&quot;&gt; Il principio alla base del saggio basato sulla fluorescenza è mostrato nella Figura 1B. Luvs sono simmetricamente ricostituiti con una quantità traccia di NBD-PC o un altro giornalista di fosfolipidi fluorescente NBD marcato (Figura 1A). In aggiunta ditionito, un non fluorescente dianione membrana impermeant, molecole NBD-PC nel foglietto esterno delle luvs sono resi come nitro-gruppo di NBD è ridotta ad un ammino-gruppo non fluorescente. Poiché né molecole NBD-PC né ditionito sono in grado di attraversare la membrana sulla scala temporale dell&#39;esperimento (&lt;10 min), questo si traduce in una riduzione del 50% del segnale fluorescente. Tuttavia, se i liposomi sono ricostituiti con una scramblase, molecole NBD-PC nel foglietto interno possono rimescolare rapidamente all&#39;esterno dove vengono ridotti. Ciò comporta la perdita totale della fluorescenza nel caso ideale (Figura 1C). es / ftp_upload / 54635 / 54635fig1.jpg &quot;/&gt; . Figura 1: Rappresentazione schematica del saggio di attività scramblase Il saggio utilizza una fluorescenza NBD marcato reporter di lipidi; NBD-PC è mostrato (A). Le grandi vescicole unilamellari sono ricostituiti con una quantità traccia di NBD-PC. Ricostituzione produce vescicole simmetriche, con NBD-PC distribuito equamente negli opuscoli esterne ed interne. Ditionito (S 2 O 4 2-) riduce chimicamente il nitro-gruppo di NBD ad un ammino-gruppo non fluorescente. Trattamento di liposomi privi di proteine ​​con ditionito (B, top) causa una riduzione del 50% della fluorescenza poiché solo le molecole NBD-PC nel foglietto esterno vengono ridotti: ditionito è caricato negativamente e non possono attraversare la membrana per reagire con molecole NBD-PC nel foglietto interno. Trattamento dithionite di proteoliposomi opsin contenenti (B, in basso), vale a dire, proteoliposomi scramblase-attiva, si traduce in perdita di 100% di fluorescence come opsina facilita il movimento di NBD-PC tra l&#39;interno e il foglietto esterno. (C) mostra le tracce di fluorescenza idealizzate ottenuti sul trattamento liposomi senza proteine ​​e proteoliposomi opsin contenenti con ditionito. Il tasso di perdita di fluorescenza è la stessa in entrambi i casi che indicano che la riduzione chimica dei NBD da ditionito è limitante, e che scrambling avviene ad una velocità uguale o superiore alla velocità della reazione chimica. Tracce ottenuti da un esperimento reale sono mostrati in figura 3. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54635/54635fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> I metodi che descriviamo possono essere utilizzati per ricostituire e saggiare altre proteine ​​purificate, nonché miscele di proteine ​​di membrana ottenute, ad esempio, estraendo microsomi con detergente 22.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1148">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:683px;">1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td style="width:141px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:132px;">850457C</td>
			<td style="width:193px;">POPC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840457C</td>
			<td>POPG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1-palmitoyl-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl}-an-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810130C</td>
			<td>NBD-PC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>EM-5330</td>
			<td>HEPES</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653-1KG</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dodecyl-&#946;-d-maltoside&#160;</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310 5 GM</td>
			<td>DDM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorimeter cuvettes</td>
			<td>sigma</td>
			<td>C0918-100EA</td>
			<td>cuvettes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectrofluorometer</td>
			<td colspan="2">Photon Technology International, Inc.</td>
			<td>fluorimeter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium hydrosulfite technical grade, 85%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>157953-5G</td>
			<td>dithionite</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GraphPad Prism 5 software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prism</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris Base</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JTX171-3</td>
			<td>Tris</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LIPEX 10 mL extruder&#160;</td>
			<td>Northern Lipids, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Extruder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:683px;">Whatman, Drain disc, PE, 25 mm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:132px;">28156-243</td>
			<td>Disc support</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:683px;">Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes, 0.4 &#181;m, 25 mm diameter</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:132px;">WHA110607</td>
			<td>400 nm membrane</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:683px;">Whatman Nucleopore Track-Etched Membranes, 0.2 &#181;m, 25 mm diameter</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:132px;">WHA110606</td>
			<td>200 nm membrane</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3264-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VWR Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass, 13x100 mm</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>47729-572</td>
			<td>glass tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Perchloric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30755-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Molybdate Tetrahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-7302</td>
			<td>ammonium molybdate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">(+)-Sodium L-ascorbate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7631-25G</td>
			<td>sodium ascorbate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bio-Beads SM2 adsorbents</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1523920</td>
			<td>polystyrene beads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;2.0 mL Microtubes clear</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>10011-742</td>
			<td>Reconstitution tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reconstitution glass tube</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td style="width:132px;">53283-800</td>
			<td>Reconstitution glass tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zetasizer&#160;</td>
			<td>Malvern&#160;</td>
			<td></td>
			<td>DLS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fluorescence-based assay of phospholipid scramblase activity

Scramblases traslocano fosfolipidi attraverso il doppio strato di membrana bidirezionale in modo ATP-indipendente. Il primo scramblase per essere identificati e biochimicamente verificato è stato opsin, la apoprotein della rodopsina fotorecettori. Rhodopsin è un recettore accoppiato alla proteina G localizzato in rod fotorecettori membrane a disco della retina dove è responsabile per la percezione della luce. Attività scramblase di Rhodopsin non dipende dal suo ligando 11- cis -retinal, cioè, il opsin apoprotein è anche attivo come scramblase. Sebbene fosfolipidi costitutiva e regolato scrambling svolgono un ruolo importante nella fisiologia cellulare, solo pochi scramblases fosfolipidi sono stati identificati finora oltre opsin. Qui si descrive un saggio di fluorescenza a base di attività di scramblase opsin. Opsina viene ricostituito in grandi liposomi unilamellari composti di fosfatidilcolina, phosphatidylglycerol e una quantità traccia di fluorescenza NBD marcato PC (1-palmitoyl-2- {6- [7-nitro-2-1,3-benzoxadiazole-4-il) ammino] esanoile} - sn -glycero-3-phosphocholine). attività Scramblase è determinata misurando la misura in cui le molecole NBD-PC situati nel foglietto interno della vescicola sono in grado di accedere al foglietto esterno dove la loro fluorescenza viene eliminata chimicamente da un agente riducente che non può attraversare la membrana. I metodi che descriviamo hanno applicabilità generale e può essere utilizzato per identificare e caratterizzare le attività scramblase di altre proteine ​​di membrana.

Descriviamo la ricostituzione di opsin in luvs per caratterizzare la propria attività scramblase usando un test basato sulla fluorescenza. Analizziamo i risultati di porre un limite inferiore del tasso di fosfolipidi opsin mediata scomposizione e per determinare lo stato oligomerico in cui opsin ricostituisce funzionalmente nelle vescicole. Per identificare le condizioni ottimali di ricostituzione, è necessario determinare e...

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A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

We describe a fluorescence-based assay to measure phospholipid scrambling in large unilamellar liposomes reconstituted with opsin.

Un test fluorescenza a base di fosfolipidi Scramblase Activity

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

13.8K Views.  Weill Cornell Medical College. We describe a fluorescence-based assay to measure phospholipid scrambling in large unilamellar liposomes reconstituted with opsin. 

Video: A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many of these conditions cause protein unfolding in the cell and have detrimental impact on the survival of the organism. A group of unrelated, stress-specific molecular chaperones have been shown to play essential roles in the survival of these stress conditions. While fully folded and chaperone-inactive before stress, these proteins rapidly unfold and become chaperone-active under specific stress conditions. Once activated, these conditionally disordered chaperones bind to a large number of different aggregation-prone proteins, prevent their aggregation and either directly or indirectly facilitate protein refolding upon return to non-stress conditions. The primary approach for gaining a more detailed understanding about the mechanism of their activation and client recognition involves the purification and subsequent characterization of these proteins using in vitro chaperone assays. Follow-up in vivo stress assays are absolutely essential to independently confirm the obtained in vitro results.
This protocol describes in vitro and in vivo methods to characterize the chaperone activity of E. coli HdeB, an acid-activated chaperone. Light scattering measurements were used as a convenient read-out for HdeB&#39;s capacity to prevent acid-induced aggregation of an established model client protein, MDH, in vitro. Analytical ultracentrifugation experiments were applied to reveal complex formation between HdeB and its client protein LDH, to shed light into the fate of client proteins upon their return to non-stress conditions. Enzymatic activity assays of the client proteins were conducted to monitor the effects of HdeB on pH-induced client inactivation and reactivation. Finally, survival studies were used to monitor the influence of HdeB&#39;s chaperone function in vivo.

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

This study describes biophysical, biochemical and molecular techniques to characterize the chaperone activity of Escherichia coli HdeB under acidic pH conditions. These methods have been successfully applied for other acid-protective chaperones such as HdeA and can be modified to work for other chaperones and stress conditions.

Rilevamento del pH-dipendente attività di<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; e<em&gt; In Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Ricerca

Biochimica

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some S100 proteins have the capacity to bind transition metals with high affinity and effectively sequester them away from invading microbial pathogens in a process that is termed "nutritional immunity". S100A12 (EN-RAGE) binds both zinc and copper and is highly abundant in innate immune cells such as macrophages and neutrophils. We report a refined method for the expression, enrichment and purification of S100A12 in its active, metal-binding configuration. Utilization of this protein in bacterial growth and viability analyses reveals that S100A12 has antimicrobial activity against the bacterial pathogen, Helicobacter pylori. The antimicrobial activity is predicated on the zinc-binding activity of S100A12, which chelates nutrient zinc, thereby starving H. pylori which requires zinc for growth and proliferation.

Here, we present a method to express and purify S100A12 (calgranulin C). We describe a protocol to measure its antimicrobial activity against the human pathogen H. pylori.

Espressione, purificazione e attività antimicrobica di S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ metabolic activity assays can provide information about the spatial distribution of metabolic activity within a tissue. We provide here a detailed protocol for monitoring the activity of the enzyme lactate dehydrogenase directly in tissue samples. Lactate dehydrogenase is an important determinant of whether consumed glucose will be converted to energy via aerobic or anaerobic glycolysis. A solution containing lactate and NAD is provided to a frozen tissue section. Cells with high lactate dehydrogenase activity will convert the provided lactate to pyruvate, while simultaneously converting provided nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) to NADH and a proton, which can be detected based on the reduction of nitrotetrazolium blue to formazan, which is visualized as a blue precipitate. We describe a detailed protocol for monitoring lactate dehydrogenase activity in mouse skin. Applying this protocol, we found that lactate dehydrogenase activity is high in the quiescent hair follicle stem cells within the skin. Applying the protocol to cultured mouse embryonic stem cells revealed higher staining in cultured embryonic stem cells than mouse embryonic fibroblasts. Analysis of freshly isolated mouse aorta revealed staining in smooth muscle cells perpendicular to the aorta. The methodology provided can be used to spatially map the activity of enzymes that generate a proton in frozen or fresh tissue.

We describe a protocol for mapping the spatial distribution of enzymatic activity for enzymes that generate nicotinatmide adenine dinucleotide phosphate (NAD(P)H) + H+ directly in tissue samples.

Metabolismo di mappatura: Monitoraggio dell'attività della deidrogenasi del lattato direttamente nel tessuto

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved N6-isopentenyladenosine modifications occurs at the A37 position in a subset of tRNAs. This modification improves translation efficiency and fidelity by increasing the affinity of the tRNA for the ribosome. Mutation of enzymes responsible for this modification in eukaryotes are associated with several disease states, including mitochondrial dysfunction and cancer. Therefore, understanding the substrate specificity and biochemical activities of these enzymes is important for understanding of normal and pathologic eukaryotic biology. A diverse array of methods has been employed to characterize i6A modifications. Herein is described a direct approach for the detection of isopentenylation by Mod5. This method utilizes incubation of RNAs with a recombinant isopentenyl transferase, followed by RNase T1 digestion, and 1-dimensional gel electrophoresis analysis to detect i6A modifications. In addition, the potential adaptability of this protocol to characterize other RNA-modifying enzymes is discussed.

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Here, we describe a protocol for the biochemical characterization of the yeast RNA-modifying enzyme, Mod5, and discuss how this protocol could be applied to other RNA-modifying enzymes.

Un test In Vitro per rilevare attività di tRNA-Isopentenyl Transferase

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic properties of the absorbed/immobilized mass on sensor surfaces, allowing the measurements of the interaction of proteins with solid-supported surfaces, such as lipid bilayers, in real-time and with a high sensitivity. Annexins are a highly conserved group of phospholipid-binding proteins that interact reversibly with the negatively charged headgroups via the coordination of calcium ions. Here, we describe a protocol that was employed to quantitatively analyze the binding of annexin A2 (AnxA2) to planar lipid bilayers prepared on the surface of a quartz sensor. This protocol is optimized to obtain robust and reproducible data and includes a detailed step-by-step description. The method can be applied to other membrane-binding proteins and bilayer compositions.

Here, we present an experimental protocol that can be employed to determine the binding affinities and mode of interaction of label-free phospholipid-binding protein annexin A2 with immobilized solid-supported bilayers (SLB) by simultaneously measuring the mass uptake and the viscoelastic properties of the protein annexin A2.

Microgravimetry dissipativo per studiare la dinamica di associazione del fosfolipide proteina Annessina A2 a lipidici solido-supportato utilizzando un risonatore al quarzo

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released from many cell types and play a pivotal role in regulating cell-cell communication and a diverse range of biological processes. Many different methods for the characterization of EVs have been described. However, most of these methods have the disadvantage that the preparation and characterization of the samples are very time-consuming, or it is extremely difficult to analyze specific markers of interest due to their small size and due to the lack of discrete populations. While methods for analysis of EVs have been considerably improved over the last decade, there is still no standardized method for characterization of single EVs. Here, we demonstrate a semi-automated method for characterization of single EVs by fluorescence-based nanoparticle-tracking analysis. The protocol that is presented addresses the common problem of many researchers in this field and provides the complete workflow for rapid isolation of EVs and characterization with PKH67, a general cell membrane linker, as well as with specific surface markers such as CD63, CD9, vimentin, and lysosomal-associated membrane protein 1 (LAMP-1). The presented results show a high level of reproducibility, as confirmed by other methods, such as Western blotting. In the conducted experiments, we exclusively used EVs isolated from human serum samples, but this method is also suitable for plasma or other body fluids and can be adjusted for characterization of EVs from cell culture supernatants. Irrespective of the future progress of research on EV biology, the protocol that is presented here provides a rapid and reliable method for rapid characterization of single EVs with specific markers.

In this protocol, we describe the complete workflow for rapid isolation of extracellular vesicles from human whole blood and characterization of specific markers by fluorescence-based nanoparticle-tracking analysis. The presented results show a high level of reproducibility and can be adjusted to cell culture supernatants.

Rapida caratterizzazione basata sulla fluorescenza delle singole vescicole extracellulari nel sangue umano con analisi Nanoparticle tracking

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often viruses exhibit cell and tissue tropism and are adapted to specific cell or tissue proteases. Moreover, these viruses can introduce mutations or insertions into their genome during replication that may affect the cleavage, and thus can contribute to adaptations to a new host. Here, we present a fluorogenic peptide cleavage assay that allows a rapid screening of peptides mimicking the cleavage site of viral fusion proteins. The technique is very flexible and can be used to investigate the proteolytic activity of a single protease on many different substrates, and in addition, it also allows exploration of the activity of multiple proteases on one or more peptide substrates. In this study, we used peptides mimicking the cleavage site motifs of the coronavirus spike protein. We tested human and camel derived Middle East Respiratory Syndrome coronaviruses (MERS-CoV) to demonstrate that single and double substitutions in the cleavage site can alter the activity of furin and dramatically change cleavage efficiency. We also used this method in combination with bioinformatics to test furin cleavage activity of feline coronavirus spike proteins from different serotypes and strains. This peptide-based method is less labor- and time intensive than conventional methods used for the analysis of proteolytic activity for viruses, and results can be obtained within a single day.

We present a fluorogenic peptide cleavage assay that allows a rapid screening of the proteolytic activity of proteases on peptides representing the cleavage site of viral fusion peptides. This method can also be used on any other amino acid motif within a protein sequence to test for the protease activity.

Un'analisi di clivaggio Peptide fluorogenico alla schermata per attività proteolitica: applicazioni per coronavirus spike l'attivazione della proteina

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often ...

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

Mitochondria play the most prominent roles in cellular metabolism by producing ATP through oxidative phosphorylation and regulating a variety of physiological processes. Mitochondrial dysfunction is a primary cause of a number of metabolic and neurodegenerative diseases. Intact mitochondria are critical for their proper functioning. The enzyme citrate synthase is localized in the mitochondrial matrix and thus can be used as a quantitative enzyme marker of intact mitochondrial mass. Given that many molecules and pathways that have important functions in mitochondria are highly conserved between humans and Drosophila, and that an array of powerful genetic tools are available in Drosophila, Drosophila serves as a good model system for studying mitochondrial function. Here, we present a protocol for fast and simple measurement of citrate synthase activity in tissue homogenate from adult flies without isolating mitochondria. This protocol is also suitable for measuring citrate synthase activity in larvae, cultured cells, and mammalian tissues.

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

We present a protocol for a colorimetric assay of citrate synthase activity for quantification of intact mitochondrial mass in Drosophila tissue homogenates.

Un saggio colorimetrico dell'attività Citrate Synthase in Drosophila Melanogaster

Mitochondria play the most prominent roles in cellular metabolism by producing ATP through oxidative phosphorylation and regulating a variety of ...

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets for treatment of fungal infections and for genome mining of fungal secondary metabolites. Inhibitor screening, however, requires purified enzyme activities. Since class 1 deacetylases exert their function as multiprotein complexes, they are usually not active when expressed as single polypeptides in bacteria. Therefore, endogenous complexes need to be isolated, which, when conventional techniques like ion exchange and size exclusion chromatography are applied, is laborious and time consuming. Tandem affinity purification has been developed as a tool to enrich multiprotein complexes from cells and thus turned out to be ideal for the isolation of endogenous enzymes. Here we provide a detailed protocol for the single-step enrichment of active RpdA complexes via the first purification step of C-terminally TAP-tagged RpdA from Aspergillus nidulans. The purified complexes may then be used for the subsequent inhibitor screening applying a deacetylase assay. The protein enrichment together with the enzymatic activity assay can be completed within two days.

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets to treat fungal infections. Here we present a protocol for the specific enrichment of TAP-tagged RpdA combined with an HDAC activity assay that allows in vitro efficacy testing of histone deacetylase inhibitors.

Arricchimento in un solo passaggio di un istone deacetilasi con tag TAP del fungo filamentoso Aspergillus nidulans per il saggio di attività enzimatica

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets for treatment of fungal infections and for genome mining of ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. Nucleases display a variety of vital physiological roles in prokaryotic and eukaryotic organisms, ranging from maintaining genome stability to providing protection against pathogens. Altered nuclease activity has been associated with several pathological conditions including bacterial infections and cancer. To this end, nuclease activity has shown great potential to be exploited as a specific biomarker. However, a robust and reproducible screening method based on this activity remains highly desirable.
Herein, we introduce a method that enables screening for nuclease activity using nucleic acid probes as substrates, with the scope of differentiating between pathological and healthy conditions. This method offers the possibility of designing new probe libraries, with increasing specificity, in an iterative manner. Thus, multiple rounds of screening are necessary to refine the probes&#39; design with enhanced features, taking advantage of the availability of chemically modified nucleic acids. The considerable potential of the proposed technology lies in its flexibility, high reproducibility, and versatility for the screening of nuclease activity associated with disease conditions. It is expected that this technology will allow the development of promising diagnostic tools with a great potential in the clinic.

Altered nuclease activity has been associated with different human conditions, underlying its potential as a biomarker. The modular and easy to implement screening methodology presented in this paper allows the selection of specific nucleic acid probes for harnessing nuclease activity as a biomarker of disease.

Screening cinetico dell'attività nucleana utilizzando sonde con acido Nucleic

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...