This work is supported by the National Institutes of Health (NIH) grants R01DK093953 (X.L.), P30NS069271, BRFSG-2014-07 (X.L.). C.J. is partially supported by American Heart Associate pre-doctoral fellowship (14PRE20380168, to C.J.).

1. Membranblatt Vorbereitung und Fixierung <ol><li> Bereiten Membranblätter markiert mit iRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 <ol><li> Bereiten Sie die DNA - Plasmid - Codierung iRFP-PAmCherry1-PH PLC 23 molekularen Standardbiologische Techniken mit &amp; dgr; 1. </li><li> Kultur INS-1 - Zellen auf # 1.5 18 mm runden Deck vorbeschichtet mit 30 ug / ml Fibronektin zu 50-70% Konfluenz folgenden Standard INS-1 - Zellkulturprotokolle 38,39. Transfizieren einen Tag, um die Zellen nach 50 bis 70% Konfluenz erreicht ist. </li><li> Transfizieren Zellen mit iRFP-PAmCherry1-PH PLC &amp; dgr; 1 der Protokolle folgenden Hersteller Liposom Transfektionsreagenz verwenden. Nach der Transfektion erlauben, die Zellen für 48 Stunden wachsen. </li><li> Am Tag des Experiments coat Deckgläser (auf einer Seite) mit ~ 0,5-1 ml von 500 ug / ml Poly-D-Lysine; für 1-2 h (PDL in dH 2 O verdünnt). Dann PDL Drain durch ein Tissue-Papier Platzierung aufder Rand des Deckglases. Platzieren Sie die Deckgläser auf einem vorgekühlten (4 ° C) Metallplatte zur späteren Verwendung. </li><li> Waschen vorge transfizierten INS-1-Zellen wachsen auf Deckgläser mit ~ 0,5-1 ml eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), enthaltend 1 mM EGTA. Wiederholen Sie die Wäsche dreimal und Drain-PBS. </li><li> Platzieren Sie die Deckgläser mit kultivierten Zellen (cell-Seite nach unten) auf den PDL-beschichtete Deckgläser auf einem vorgekühlten Metallplatte mit einer Pinzette. Verlassen , um die Platte in einem Kühlschrank (4 ° C) für 7 bis 10 min Zellen zu ermöglichen, den PDL-beschichtete Deckgläser (Abbildung 2) zu befestigen. HINWEIS: Die Inkubationszeit in dem Bereich von 7 sein sollte - 10 min für eine bessere Befestigung der Zellen an der PDL-beschichteten Oberfläche. Der Kühlschrank Umgebung ist trocken und Inkubation sollte nicht zu lang sein. </li><li> Entfernen Sie die Metallplatte aus dem Kühlschrank. schälen Sie vorsichtig das Deckglas die Pre-transfizierten Zellen mit einer Pinzette enthält. Dies erzeugt eine dünne Schicht der Zellmembran Blatt auf derPDL-beschichtete Deckglas. Waschen Sie sich leicht die Membranblätter mit ~ 0,5-1 ml eiskaltem PBS und dann fix mit ~ 0,5-1 ml eiskaltem 4% Paraformaldehyd (PFA) + 0,2% Glutaraldehyd (GA) in PBS für 15 min bei 4 ° C. Achtung: Paraformaldehyd und Glutaraldehyd sind giftig. Behandeln Sie sie in einem Abzug mit der Haut und Augenschutz. </li><li> 1 ml PBS bei 4 ° C - Nach der Fixierung Bild sofort die Membranfolien oder lagern in ~ 0.5 (siehe Abschnitt 3). HINWEIS: Nachdem das Membranblatt Fixierung, wird es kein Gleichgewicht sein Bindung von pH - Sonden von Cytosol PI (4,5) P2. Die gebundenen pH-Sonden werden nach und nach aus dem Membranblatt dissoziieren und diffundieren in die Lösung (obwohl es Tage bis Wochen dauern kann). Daher ist es die festen Proben direkt nach der Probenvorbereitung auf Bild empfohlen. </li></ol></li><li> Bereiten Membranblätter für PI (4,5) P 2 - spezifische Antikörper - Markierung <ol><li> Kultur INS-1-Zellen auf # 1.5, 18 mm rund Deck vorbeschichtet mit 30 &amp;# 181; g / ml Fibronektin zu 50% -70% Konfluenz. Transfizieren Zellen mit Plasmid-DNA, am nächsten Tag als 1.1.3 in Schritt beschrieben. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte von 1.1.4 bis 1.1.7, wie oben beschrieben. ANMERKUNG: Führen Sie die folgenden Verfahren, bei 4 ° C. </li><li> Waschen Sie die Deckgläser befestigt PM Blätter enthält , dreimal mit ~ 0,5 bis 1 ml eiskaltem PBS 50 mM NH 4 Cl enthält. Quenche die Blätter mit ~ 0,5-1 ml 0,1% Natriumborhydrid in PBS für 7 min, und wasche mit ~ 0,5-1 ml PBS (ohne 50 mM NH 4 Cl). </li><li> Blockieren der Proben mit ~ 0,5-1 ml Blockierungslösung (PBS - Lösung , enthaltend 5% (v / v) normales Ziegenserum, 5% (v / v) Rinderserumalbumin und 50 mM NH 4 Cl) für 45 min. Dann inkubieren mit ~ 0,5-1 ml primären PI (4,5) P 2 - Antikörper (1: 300 Verdünnung) in Lösung für 1 h blockiert. Waschen dreimal (je 10 min) mit ~ 0,5-1 ml PBS 50 mM NH 4 Cl enthält. </li><li> Inkubieren Proben mit ~ 0,5-1 ml Sekundär F (ab &#39;) 2-Ziege-Anti-MausAntikörper mit Fluorophoren konjugiert (1: 300) Puffer für 1 h bei der Blockierung. Waschen dreimal mit ~ 0,5-1 ml PBS. </li><li> Postfix-Proben mit 4% PFA + 0.2% GA für 15 min, dann waschen Proben dreimal mit PBS (7 min jedesmal). Fahren Sie mit Abschnitt 3 für die Bildgebung oder lagern in ~ 0.5 ~ 1 ml PBS bei 4 ° C für die spätere Verwendung. HINWEIS: Bereiten Proben bei 4 ° C. Verwenden Sie 4% PFA + 0,2% GA Fixiermittel die physiologische Verteilung von Phosphoinositid in der PM zu erhalten. RT Vorbereitung oder Fixierung mit 4% PFA allein kann erhebliche Artefakte (Abbildung 4). </li></ol></li></ol> 2. Zellkultur Vorbereitung für das Live-Cell - Imaging mit mEOS3.1-PH PLC δ1 <ol><li> Bereiten Sie die DNA - Plasmid , das die mEOS3.1-PH PLC δ1 wie zuvor 23 beschrieben. </li><li> Kultur INS-1-Zellen auf # 1.5 18 mm runden Deckgläschen vorbeschichtet mit 30 ug / ml Fibronektin, bis sie erreichen 50% -70% confluency folgende Standard - INS-1 - Zellkulturprotokolle 38,39. </li><li> Am folgenden Tag, transfizieren INS-1 - Zellen mit dem mEOS3.1-PH PLC &amp; dgr; 1 - DNA - Plasmid - Liposom - Transfektionsreagenz unter Verwendung des Protokolls nach der Herstellung. Inkubieren für 48 Stunden vor der Bildgebung. </li></ol> 3. PALM Image Acquisition von Membranblätter und lebenden Zellen <ol><li> PALM Bildaufnahme von Membranfolien HINWEIS: Hier wird eine interne Totalreflexion Fluoreszenz (TIRF) Mikroskop auf Basis SMLM System (100X Öl, APO, NA = 1,49, WD 0,12 mm) 23 wird für alle Bildaufnahme verwendet. <ol><li> Vor Bildgebung, verdünnen 1 ul fluoreszierenden Beadlösung in 10 ml PBS + 50 mM MgCl 2. In 200 ul verdünnte Lösung in die Abbildungskammer enthält, Zellproben (aus den Schritten 1.1.8 / 1.2.6) für 10 min. Dann waschen mit PBS dreimal. </li><li> Starten Sie das PALM-Bildgebungssystem. In der zugehörigen Imaging-Software, wählen Sie den &quot;iRFP Kanal &amp;# 34; Taste (642 nm Laseranregung, 700/75 nm-Emission). Finden Sie die Zellmembran PH Sonden im iRFP Kanal exprimieren. HINWEIS: Die Membranfolie eine fluoreszierende Perle in der Nähe haben. Dies wird später für Driftkorrektur erforderlich. </li><li> Verwenden Sie die &quot;Aufnahme&quot; Taste ein herkömmliches TIRF Bild von der Zellmembran in iRFP Kanal als Referenz für zukünftige Bildrekonstruktion zu sammeln. Stellen Sie einen normalen TIRF Winkel (dh nach den kritischen Winkel erreichen, biegen Sie weitere 1,5 Grad) von in 2140 in den TIRF Winkel Eingabe für die Bildgebung zu setzen. Verwenden Sie diesen Winkel für alle Schritte einstellen, sofern nicht anders vermerkt. HINWEIS: In der TIRF hier beschriebenen System 3500 ist die vertikale up Winkel, 2200 ist der TIRF kritische Winkel, und 2140 ist der normale TIRF Winkel, der 1,5 Grad mehr nach TIRF kritische Winkel. Der schmale TIRF Winkel unten erwähnt in 3.2.3 ist 2120, das ist ein weiterer 2 Grad nach TIRF kritischen Winkel erreicht. </li><li> Wechseln Sie in den PAmCherry1 Kanal durch th klickene RFP Kanaltaste (561 nm Anregung, 600/50 nm Emissionsfilter). Stellen Sie die Bildlaufleiste in der &quot;AOTF&quot; pad den ganzen Weg auf der rechten Seite für 10-20 sec volle Leistung Beleuchtung von 561-nm-Laser zu haben, um die Hintergrund Membran Fluoreszenz bleichen. </li><li> Stellen Sie die optimale Kameraeinstellung (2x2 Binning) im Register &quot;Format&quot; und die schnelle Akquisitionsprotokoll in &quot;ND Sequenzerfassung&quot; Register (typischerweise 10.000-40.000 Bilder bei 20 Hz). </li><li> Starten Sie Erwerb von PAmCherry1 Bilder (561-nm-Laser bei voller Leistung, 50 ms / Frame) bei gleichzeitiger 405 nm Laseraktivierung auf einem niedrigen Niveau (0,1% - 1%), indem Sie auf den &quot;Jetzt ausführen&quot; klicken. Passen Sie die Intensität von 405 nm Laser, so dass räumlich getrennt einzelne Punkte in jedem Frame leicht identifizierbar sind. HINWEIS: Die Anzahl der aktivierbaren PAmCherry1 Moleküle nimmt allmählich während der Erfassung. 405 nm Laserintensität allmählich erhöht werden sollte, um die optimale Dichte der einzelnen Molekül Signale in jedem zu haltenRahmen. </li><li> Weiter Bilder zu erwerben, bis kein PAmCherry1 einzelnes Molekül Signal aktiviert wird. </li></ol></li><li> PALM-Bildgebung in lebenden Zellen <ol><li> Vor der Bebilderung, verdünntem fluoreszierenden Kügelchen in die Abbildungskammer für 10 min, wie in Schritt 3.1.1 beschrieben. PALM Bildgebung durch Öffnen der zugehörigen Imaging-Software Starten Sie dann. HINWEIS: Verwenden Sie eine magnetische Schnellspann Imaging-Kammer für Live-Cell-Imaging. Aufrechterhaltung der Mitte des Abbildungsfeldes bei 35 ° C mit einem Temperaturregler unter konstanter Perfusion mit extrazellulären Puffer (extrazelluläre Lösung: 135 mM NaCl, 5,6 mM KCl, 2,6 mM CaCl 2, 1,2 mM MgCl 2, 3 mM Glucose und 20 mM HEPES; pH = 7,3). </li><li> Wählen Sie die GFP-Kanal-Taste (525/50 nm-Emission). Identifizieren Sie die Zellmembran fluoreszierende Sonden auf Basis von grün fluoreszierenden von mEOS3 unter 488 nm Laseranregung ausdrückt. Stellen Sie sicher, dass fluoreszierende Kügelchen in der Nähe auch während der Bildgebung wie diese enthalten sind später für die Offline-dri erforderlich istft Korrektur. </li><li> Klicken Sie auf die &quot;Aufnahme&quot; Taste, um ein TIRF Bild von der Zellmembran in mEOS3 (grün) Kanal als Referenzbild zu sammeln. Verwenden Sie eine flache abklingende Welle Anregungsbeleuchtung (nach den kritischen Winkel erreichen, biegen Sie weitere 2 Grad) von in 2120 in der TIRF Winkel eingeben Einstellung für Live-Cell-Imaging. ANMERKUNG: Dies minimiert die Fluoreszenz von dem ungebundenen mEos3-PH im Cytosol angrenzend an die Plasmamembran. </li><li> Wechseln Sie in den &quot;RFP-Kanal&quot; Taste (561 nm Anregung, 600/50 nm-Emission). Verwenden Sie die volle Leistung 561 nm Laser-Hintergrundfluoreszenz der Membranblätter zu bleichen für 10 ~ 20 sec mit dem Scrollbar in der &quot;AOTF pad&quot; (siehe 3.1.4). </li><li> Starten der Bildaufnahme die &quot;Run Now&quot; durch Klicken auf die Taste im roten Kanal (561 nm volle Leistung, eingestellt bei 10 ms / Frame in der &quot;Kamera&quot; Einstellung Tab) bei gleichzeitiger 405 nm Laseraktivierung. Stellen Sie die 405-nm-Laserintensität zu aktivieren räumlich getrennten Punktenin jedem Rahmen. HINWEIS: Erwerb Erlös, un-umgewandelt mEOS3.1-PH PLC δ1 Molekülzahl langsam abnimmt. Erhöhen Sie die 405 nm Laserleistung des einzelnen Moleküls Signal zu optimieren. Die Abbildungsakquisitionslänge ist abhängig von der experimentellen Zweck. Erwerben Sie Bilder kontinuierlich für 5 min unter normalen Bedingungen. Wenn eine längere Akquisition erforderlich ist, sammeln mehrere Bildstapel statt eines einzelnen, großen Bildstapel. Die Dateigröße der einzelnen Bildstapel sollte nicht mehr als 4 GB oder es wird später Software-Analyse beeinflussen. </li></ol></li></ol> 4. SMLM Bildverarbeitung und Wiederaufbau <ol><li> Übertragen Sie die Bilddateien (TIF-Bildstapel) zu einer Bildanalysestation. Starten Sie die Bildwiederaufbauprogramm (speziell geschriebenen) in Matlab wie zuvor 37 beschrieben und laden Sie die Bildstapel durch die Registerkarte &quot;Datei&quot; im Hauptmenü klicken, dann auf &quot;öffnen&quot;, dann &quot;neue Datei&quot;. </li><li> Identifizieren und locaLize einzelnen molekularen Ereignisse aus jedem Rahmen. Stellen Filterung Intensitätsschwelle mit einer Schwellenzahl (1-10) in der &quot;Wavelet&quot;. Überprüfen Sie die optimalen Parametereinstellungen für Punkterkennung visuell vor dem Umbau. Dann gehen Sie auf die &quot;PALM&quot; und klicken Sie &quot;einen Schritt Prozess&quot; Bildrekonstruktion zu starten. HINWEIS: Intensitäts-Grenzwert für Punkterkennung ist willkürlich und hängt von persönlichen Erfahrungen. Mehrere Studien kann eine optimale Detektionsschwelle zu erzeugen, erforderlich sein, dass weder zu viele unqualifizierte aufgreift (dim) Punkte noch filtert zu viele qualifizierte (hell) Punkte aus. Stellen Sie andere Parameter Datenanalyse zu optimieren. Hier Nachbarschaft Abstand (Fluoreszenzpunkte in den benachbarten Rahmen in einem Abstand kombiniert werden) wird als 65 nm (1/2 Pixelbreite) und als ein einzelnes Molekül eingebaut. Gap-Frames (Einzelmolekül Ereignisse, die innerhalb dieser Rahmen und Nachbarschaft Entfernung auftraten, wurden kombiniert und als ein einzelnes Molekül Ereignis vorhanden) istSet als 26 Frames (1,3 sec) für PAmCherry1 Bildgebung 40. Stellen Sie diese Parameter entsprechend den Eigenschaften der Einzelmolekülsonden und Erfassungsrate zu vermeiden 40 in SMLM Über zählen. Anwenden Driftkorrektur mit fluoreszierenden Kügelchen während der Rekonstruktionen. <ol><li> Für die Abbildung der festen Membranblätter gekennzeichnet durch iRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1, rekonstruieren die ganze Bildstapel aus der gleichen Membranfolie in einem einzigen Super-Resolution Bild 37. </li><li> Für lebende Zelle markierten Proben von mEOS3.1-PH PLC δ1, den gesamten Bildstapel in mehrere kleinere Stapel von 1.000 Frames trennen , so dass 1000-konsekutiven Rahmen Stapel wird als ein einzelnes Superauflösungsbild rekonstruiert, die eine zeitliche Auflösung hat von 10 sec. Am Ende vereinen alle Zeitreihen - Bilder in der letzten Zeitreihenstapel 23. HINWEIS: In lebenden Zellen PALM-Bildgebung kann eine kleine Anzahl der aktivierten Sonden bewegen oder trennenvon PI (4,5) P 2 in der PM vor dem Bleichen. Um der Überabtastungs der Sonden verbinden einzelnen Molekül Signale in den benachbarten Einzelbildern innerhalb von 130 nm (anstelle von 65 nm) in einem einzigen Emissionsereignis während der Bildanalyse. </li></ol></li><li> Nachdem die rekonstruierten Bilder zu erhalten, führen Sie weitere Bildanalyse mit dem speziell geschriebenen Programm in Matlab Moleküldichte, Mikrodomänendichte / Größe und Clusteranalyse mit paar Korrelation 41 zu quantifizieren. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Zur Fehlersuche, müssen zwei Prozesse besondere Aufmerksamkeit: Membranfolie Produktion und Probenfixierung. Wie in dem Protokoll beschrieben, ist die Inkubationszeit von den Deckgläsern in Schritt 1.1.6 wichtig für die Membranfolie Produktion. Optimale Inkubationszeit unter unseren experimentellen Bedingungen ist 7-10 min (Abbildung 2). Länger als 10 Minuten Inkubation werden intakte Zellen produzieren anstelle der Membranblätter auf PDL Deck und kürzere Inkubation wird weniger oder kein Membranblätter auf den PDL-beschichtete Deckgläser führen. Wie in dem Protokoll beschrieben, sind die Fixiermittel und Temperatur während der Fixierung der kritischen PI (4,5) P 2 -Verteilung im PM aufrechtzuerhalten. Die Fixierung bei RT oder die Verwendung von 4% -PFA allein könnte die normale Lipidverteilung in der PM verzerren. Durch die Anwendung PALM - Mikroskopie Lipidforschung an der Membran, sind wir in der Lage , die Nanometer - Skala Verteilung von PI (4,5) P2, ein Schlüssel Phosphoinositid , die m vermittelt zu beobachtenalle grundlegenden zellulären Aktivitäten. Diese räumliche Verteilung von PI (4,5) P2 mit begrenzter Konzentrationsgradienten in INS-1 - Zellen bietet einen Rahmen Lipid-Protein - Wechselwirkungen und lokale Signalereignisse von PI (4,5) P 2 in diesen Zellen für ein Umdenken. Darüber hinaus sind die in dieser Arbeit entwickelten Methoden können auch mit der richtigen Sonden, wodurch bietet neue Werkzeuge zum Studium Phosphoinositiden in biologischen Prozessen zu anderen Membran Phospholipid Forschung angewendet werden. Die Verwendung von Membranfolien in dieser Arbeit umgeht zwei wichtige Anliegen in Phospholipid morphologische Studien: Detergens-Behandlung und mögliche Signal Kontamination aus dem Cytosol. Waschmittel verursachen oft Clustering und einen erheblichen Verlust von PM Phospholipid-Signal. Die Kontamination von zytosolischen Signal ist besonders problematisch im Fall von geringer Häufigkeit Phosphoinositiden auf der PM 23, wie beispielsweise PI (3,4,5) P 3 und PI (3,4) P 2. Membranfolienproben sind in der Lage Circumvent diese Probleme ohne wesentliche Strukturen mit der Plasmamembran, wie kortikale Aktin meshwork und Clathrin-beschichtete Pits 42,43 zugeordnet stören. Die relative homogene Verteilung von PI (4,5) P2 in der PM ist in guter Übereinstimmung mit anderen schnellen Einfrieren EM - Studien unter Verwendung von GST-PH PLC δ1 Sonden in der Fibroblasten - Membran 44. Es ist wichtig zu beachten, dass unsachgemäßer Probenverarbeitungsbedingungen irreführende Ergebnisse erzeugen kann. Erstens ist es wichtig, die Befestigungsschritte bei einer niedrigeren Temperatur (4 ° C) und Verwendung der Fixiermittel GA für Membranfolienherstellung durchzuführen. Wie in 3 gezeigt, warme Temperatur und PFA Fixierung ohne GA ist nicht ausreichend Phosphoinositid in Zelle PM zu beheben. Dies könnte die intakten PI (4,5) P 2 Verteilung verzerren und scharfe Cluster erzeugen , die in lebenden Zellen unter physiologischen Bedingungen beobachtet werden , nicht. Zweitens ist die Verwendung von PAmCherry1 alsdie SMLM Sonde, eher als andere Sonden ist, ausschlaggebend für die quantitative PALM-Bildgebung. Der Vorteil der PAmCherry1 Anwendung kommt von seiner gut charakterisierten einzelnen molekularen photophysikalischen Eigenschaften 35,40,45, wie Helligkeit, hohe Photoaktivierung Effizienz und vor allem sehr begrenzt Photo Blinken. Diese Eigenschaften ermöglichen es uns , potenzielle Cluster Artefakte aus Photo Blinken zu beseitigen und quantitativ die molekulare Dichte der Membran PI analysieren (4,5) P 2. Dieser Ansatz hat auch seine Grenzen. Erstens verwendet das Membranblatt Verfahren in dieser Studie nicht vollständig kann die physiologische Verteilung von PI (4,5) P 2 nachahmen , da die Zelle vor der Abbildung gestört wird. Aber unsere Live - PALM - Bildgebung zeigt ähnliche relativ homogene Verteilung von PI (4,5) P2, die Ergebnisse beobachtet , die mit Membranfolie Proben unterstützen. Zweitens, wie wir in unserer bisherigen Arbeit 23 diskutiert, erfordert SMLM Imaging Expertise und extra antention Bildartefakte zu vermeiden, die von verschiedenen Prozessen, einschließlich der verwendeten Sonden, Probenvorbereitung und Fixierung, Bild Probenahme und Wiederaufbau entstehen könnten. Schließlich, obwohl die PH - Domäne basierte Sonden und Antikörper sind weit verbreitet in der Phosphoinositid Studien 46,47 verwendet worden bleibt es möglich , dass nicht alle PI (4,5) P2 in der Membran kann durch diesen Ansatz nachgewiesen werden. Beispielsweise PI (4,5) P 2 durch andere endogene Proteine gebunden sind, können nicht auf pH - Sonden oder Antikörper zugänglich sein, und dies kann eine Unterschätzung von PI (4,5) P 2 aufgrund der Raum Hinderung der Sonden selbst verursachen. Eine alternative Möglichkeit zur Etikettierung PI (4,5) P 2 würde auf den Schwanz des ursprünglichen Top-Fluor PI (4,5) P 2 48, a pre-markierten PI (4,5) P 2 Analogon mit einer Modifikation verwendet werden , PI (4,5) P 2. Allerdings kann es schnell in andere Phosphoinositid-Subtypen durch schnelle Live-Zellstoffwechsel umgewandelt werden, da seine Inositolrings die gleiche wie endogenou ists PI (4,5) P 2. Damit stellt sich die Sorge , ob diese voretikettierten PI (4,5) P 2 analoge in lebenden Zellen treu PI (4,5) P 2 nicht seine Stoffwechselprodukte darstellen kann. Daher ist trotz einiger Einschränkungen, PH - Domäne basierte Sonden sind immer noch zu den besten Sonden , die häufig verwendet wurden PI (4,5) P 2 Verteilung und Dynamik auf dem PM von Zellen zu überwachen. Die künftige Anwendung dieser Methodik kann auf andere Phosphoinositid Studien erweitert werden, wie beispielsweise PI (3,4,5) P 3 und PI (3,4) P 2. Zusammenfassend verwendet die neuartige SMLM Ansatz eröffnet hier neue Wege Phosphoinositid in Zellen zu untersuchen. Verwendung von PI (4,5) P 2 als Beispiel zeigen wir die einzigartigen Eigenschaften von PALM Bildgebung in die morphologische und quantitative Untersuchung der Zellmembran - Moleküle sowie ihre Nachteile. Dieser Ansatz kann an andere Moleküle von Interessen angepasst werden und breite Anwendungen in der Zellbiologie haben.

Phosphoinositiden tragen zu einem geringen Teil der gesamten Membranlipiden, sondern in einer Vielzahl von zellulären Prozessen eine entscheidende Rolle spielen. Sie umfassen sieben Mitglieder abgeleitet von reversible Phosphorylierung oder Dephosphorylierung des inositol Ringe auf der 3., 4. und 5. Positionen 1. Phosphatidylinositol - 4-phosphat (PI4P) und Phosphatidylinositol - 4,5-bisphosphat (PI (4,5) P 2) sind zwei wichtige Phosphoinositiden , die relativ unabhängig wie die Determinante Lipide der Zellplasmamembran (PM) 2,3 funktionieren. Phosphatidylinositol (3,4,5) -trisphosphate (PIP 3) viel weniger reichlich als PI4P und PI (4,5) P 2, aber es hat einzigartige Funktionen in verschiedenen zellulären Prozessen , einschließlich Krebs und Diabetes 4 5. Diese Lipide haben komplexe molekulare Interaktionen mit ihren Effektoren und viele andere Proteine. Daher ist es entscheidend, die räumliche Organisation dieser pho zu verstehensphoinositides im PM auf der Nanometer-Skala. Montage Beweise hat gezeigt , dass Proteinkomplexe oder Molekülcluster in den engen PM Bereichen als Signal Hotspots 6 dienen kann. Zum Beispiel Syntaxin 1a, ein Schlüsselprotein , das die Membranfusion 7-9, zeigt Cluster - Organisation in der PM reguliert. Unterscheidet sich von der Konsensusansicht der Clusterorganisation von Syntaxin 1a, die räumliche Verteilung von Phosphoinositiden in der PM ist umstritten. PI (4,5) P 2 Verteilungsmuster reichen von Uniform 10-12, große Flecken 13,14, zu dichten Büscheln 14-18, je nach Zelltypen und experimentelle Methoden verwendet. Die räumliche Organisation von PI (4,5) P 2 mit höherer Auflösung ist auch widersprüchlich. Eine Studie unter Verwendung von stimulierten Emission-Depletion (STED) Mikroskopie 19 hat eine große Anzahl von dicht PI (4,5) P 2 Nanocluster (~ 73 nm Durchmesser) in den PM Blätter PC-12 - Zellen 20 ergab </sup&gt;. Dieses Ergebnis unterscheidet sich von Studien unter Verwendung von Schnellfroster Elektronenmikroskopie (EM) 21,22, ein Ansatz, der die intakte PM Struktur von lebenden Zellen viel besser als chemische Fixierung bewahrt. Diese zeigten einen deutlichen Pools von PI (4,5) P 2; relativ konzentrierten PI (4,5) P 2 in Caveolae und beschichtet sowie eine gleichmäßige Verteilung auf der flachen Region PM Pits. Darüber hinaus nanoskaligen PI (4,5) P 2 Organisation in Membranfolien können in lebenden und fixierten Zellen unterscheiden. Unsere jüngsten Arbeiten untersucht dieses Problem in stationären und leben INS-1 - Zellen Einzelmolekül - Lokalisationsmikroskopie (SMLM) 23 verwendet wird . SMLM basiert auf stochastisch Einschalten nur eine kleine Teilmenge von Fluorophoren zu einem bestimmten Zeitpunkt, so dass einzelne Fluorophore mit hoher Genauigkeit lokalisiert werden. Viele Super-Resolution Imaging-Ansätze wurden unter Verwendung ähnlicher Prinzipien entwickelt, um die Beugungsgrenze der konventionellen Lichtmikroskopie zu überwinden, wie eins Photoaktivierungslokalisationsmikroskopie (PALM) 24, Fluoreszenzphotoaktivierungslokalisationsmikroskopie (FPALM) 25, stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (STORM) 26,27 und direkte STORM (dSTORM) 28. Mit photoschaltbare oder photoaktivierbaren Fluorophore (Farbstoffe oder fluoreszierende Proteine), erlauben SMLM Techniken Wissenschaftler Bild biologischen Strukturen in Nanometer - Auflösung 24,29,30 mit Video-Rate in lebenden Zellen 31,32. Mit PI (4,5) P 2 als Beispiel, haben wir das SMLM Ansatz die nanoskalige Verteilung von Phosphoinositid auf dem PM zu studieren. Die PH - Domäne von PLCδ1 (Phospholipase C δ1) , die PI bindet spezifisch an (4,5) P 2 eine gut etablierte Sonde zur Bildgebung PI (4,5) P 2 subzelluläre Verteilung und Dynamik 33,34 in der PM . Wir haben genetisch diese Domäne mit zwei fluoreszierenden Proteinen markiert, PAmCherry1 35 und 36 iRFP </sup&gt; , um eine Zweifarben - Fusionsprotein (iRFP-PAmCherry1-PH PLCδ1) (1A-B). PAmCherry1 dient als photoaktivierbare Sonde von PH - Domäne für PALM und iRFP dient als allgemeiner Indikator zu transfizierten Zellen zu identifizieren , bevor PALM Erwerb . Wir wenden diese zweifarbige Fluoreszenzsonde für SMLM Bildgebung in den festen Membranfolien. Für Live - PALM - Bildgebung, getaggt wir mEOS3 37 anstelle von PAmCherry1 an die PH PLCδ1 Domäne der mEOS3.1-PH PLCδ1 Sonde für seine bessere Photoneneffizienz und Helligkeit (1C-D) zu erzeugen. SMLM Bildgebung mit dieser neuartigen Sonden in der PM von insulinsezernierenden INS-1 - Zellen 38 hat homogene Markierung von PI (4,5) P 2 in der Mehrzahl der PM Regionen sowie konzentrierte PI (4,5) P 2 freigelegt Mikrodomänen , die in der Wohnung PM und einige Filopodien artige Strukturen 23 dünn miteinander vermischt werden. Dann einnoScale Verteilung von PI (4,5) P 2 eine strukturelle Basis für ein Umdenken , wie es funktioniert in lebenden Zellen.

<table><tbody><tr><td>Microscope</td><td>Nikon</td><td>Ti-U</td><td></td></tr><tr><td>sCMOS camera</td><td>Andor</td><td>Neo</td><td></td></tr><tr><td>Spinning disk</td><td>Yokogawa</td><td>CSU X-1, 10,000 rpm&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>High Power Monolithic Laser Combiner SP with 405, 488, 561 and 642 nm lasers.</td><td>Agilent</td><td>MLC400</td><td>laser original powers &amp;amp; powers at the end of optical fiber)&lt;br/&gt; 405&amp;nbsp;nm: 15 mW &amp;amp; 13&amp;nbsp;mW;&lt;br/&gt; 488&amp;nbsp;nm: 45 mW &amp;amp; 42&amp;nbsp;mW;&lt;br/&gt; 561&amp;nbsp;nm: 45 mW &amp;amp; 40&amp;nbsp;mW;&lt;br/&gt; 640&amp;nbsp;nm: 35 mW &amp;amp; 16&amp;nbsp;mW.</td></tr><tr><td>100X Objective</td><td>Nikon</td><td></td><td>APO 100X Oil, NA 1.49, WD 0.12&amp;nbsp;mm</td></tr><tr><td>Nikon acquisition and analysis software (NIS Element)</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Warner</td><td>64-0714</td><td>Round 18&amp;nbsp;mm coverslip, #1.5</td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Millipore</td><td>FC010-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamin 3000 (transfection reagent)</td><td>Invitrogen</td><td>L3000-008</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>#16120</td><td></td></tr><tr><td>PI(4,5)P&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 1&lt;sup&gt;st&lt;/sup&gt; antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-53412</td><td></td></tr><tr><td>secondary antibody&amp;nbsp; F(ab&amp;rsquo;)2-goat-anti-mouse Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A-21237</td><td></td></tr><tr><td>Tetraspeck beads</td><td>Invitrogen</td><td>T7279</td><td></td></tr><tr><td>magnetic quick release imaging chamber&amp;nbsp;</td><td>Warner Instruments</td><td>Cat#641994</td><td></td></tr><tr><td>temperature controller</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344C</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffer saline</td><td>Sigma</td><td>P4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>3780</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Sigma</td><td>A0171</td><td></td></tr><tr><td>Goat serum</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>bovine serum albumin</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8226;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8226;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldyhyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr></tbody></table>

single-molecule super-resolution imaging of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the plasma membrane with novel fluorescent probes

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a determinant phosphoinositide of the plasma membrane (PM), and it is required to modulate ion channels, actin dynamics, exocytosis, endocytosis, intracellular signaling, and many other cellular processes. However, the spatial organization of PI(4,5)P2 in the PM is controversial, and its nanoscale distribution is poorly understood due to the technical limitations of research approaches. Here by utilizing single molecule localization microscopy and the Pleckstrin Homology (PH) domain based dual color fluorescent probes, we describe a novel method to visualize the nanoscale distribution of PI(4,5)P2 in the PM in fixed membrane sheets as well as live cells.

Die Lokalisierungsunsicherheit (σ) unserer Super-Resolution - System ist 14,73 nm 23. Direkte Vergleiche zwischen TIRF und PALM Bilder zeigten eine signifikante Verbesserung der räumlichen Auflösung. 3A-B zeigt die repräsentative PI (4,5) P 2 TIRF Bilder markiert mit PI (4,5) P 2 - Antikörper und iRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 in typischen Membranfolien und lebenden Zellen. Die Bilder mit herkömmlichen TIRF - Mikroskopie in Membranblätter bemerkenswert ähnlich sind zu denjenigen in intakten lebenden mit dem enhanced green fluorescence protein markierten Zellen (EGFP) tagged PH Domänen (EGFP-PH PLCδ1) (3C). Alle Proben zeigten eine gleichmäßige Verteilung von Sonden. Im Gegensatz dazu führte nicht optimale Fixierung der Proben in scharfen dichten PI (4,5) P 2 -Clustern und eine Abnahme der Signalintensität (Abbildung 4). Unter optimalen Fixierbedingungen, ter super-aufgelöste Bilder von PI (4,5) P 2 in fixierten Zellen (Figur 5) zeigte eine homogene Verteilung von Sonden in einem erheblichen Teil des PM nur begrenzten Konzentrationsgradienten. Einige Membranflecken angereichert mit PI (4,5) P2 - Sonden wurden dünn verteilt und hatten verschiedene Größen. Live Cell PALM Bilder zeigen eine ähnliche räumliche Verteilung als feste Zellen (Abbildung 6). Eine detaillierte Analyse von PI (4,5) P2 Signale über die Zeit resultiert in schnelle Dynamik in lokalen Bereichen, ohne wesentliche Änderungen ihrer Fülle in weiten Bereichen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54466/54466fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schema für Fluoreszenzsonden in dieser Studie verwendet. (AB) iRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 Sonde in den festen Membranfolie Experimente verwendet. Während herkömmliche TIRF imaging (A), eine 640 nm<html> Laser wird verwendet, um die iRFP zu erregen (Ex: 692 nm; Em: 713 nm). TIRF Bild in diesem Zustand genommen dient als TIRF Referenzbild für die superauflösende Bildgebung von PALM - Bildgebung (B) erhalten. A 405-nm-Laser verwendet wird Photo aktivieren Sie die PAmCherry1 Fluorophor und ein 561-nm-Laser verwendet wird PAmCherry1 zu erregen (Ex: 564 nm; Em: 595 nm) für PALM-Bildgebung. (CD) mEos3.1-PH PLCδ1 Sonde in den lebenden Zellen Experimente verwendet. (C) Bei der konventionellen TIRF Bildgebung, ein 488 nm - Laser verwendet mEOS3.1 (Ex: 506 nm; Em: 519 nm) anzuregen. (D) Nach dem Photokonversion von einem 405 - nm - Laser, wird mEos3.1 in die rote Form (Beispiel: 573 nm; Em: 584 nm). Und einem 561 - nm - Laser wird für PALM Akquisitionen <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version zu sehen diese Figur.</a> s / ftp_upload / 54466 / 54466fig2.jpg &quot;/&gt; Abbildung 2. Schema für Membranblatt Vorbereitung von INS-1 - Zellen. (A) Legen Sie das Deckglas mit kultivierten Zellen nach unten auf einen PDL-beschichtete Deckglas und warten auf 7 ~ 10 min bei 4 ° C Zellbindung an die PDL- zu ermöglichen beschichtete Deckglas. (B) die obere Deckglas mit einer Pinzette abziehen und fixieren Sie die Folienmembran auf die vorbeschichteten Deck PDL angebracht. (C) Bild der Proben mit TIRFM und PALM. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54466/54466fig3.jpg" /> Abbildung 3. PI (4,5) P 2 räumliche Organisation ist ähnlich zwischen den Membranblättern und intakten lebenden Zellen unter konventionellen TIRF - Mikroskop. (A) Atypische TIRF Bildbögen Membran bei 4 ° C mit 4% PFA und 0,2% GA fixiert. PI (4,5) P 2 wurde mit PI (4,5) P 2 spezifische Antikörper markiert. (B) ein Membranblatt von der INS-1 - Zellen iRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 exprimieren. (C) TIRF - Bild von zwei intakten lebenden Zellen EGFP-PH PLCδ1 auf verschiedenen Ebenen. Maßstabsbalken: (A): 3 &amp; mgr; m; (B) und (C):. 5 &amp; mgr; m <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54466/54466fig4.jpg" /> Abbildung 4. PI (4,5) P 2 räumliche Organisation in Membranblätter ist empfindlich gegen gemeinsamen Fixierbedingungen. (A) Membranblätter bei 37 ° C mit 4% PFA alleinund PI (4,5) P 2 - spezifischen Antikörpers (wie in 3A) markiert. (B) Membranfolie bei RT mit PFA fixiert allein und mit PI (4,5) P 2 spezifische Antikörper markiert. Man beachte , dass die dichten Cluster von PI (4,5) P 2 Sonden unter TIRF Mikroskop deutlich sichtbar sind, im Gegensatz zu den viel gleichmäßiger Fluoreszenzbilder in 3A gezeigt. Maßstabsbalken: AB:. 3 &amp; mgr; m <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54466/54466fig5.jpg" /> Abbildung 5. PALM Bildgebung von PI (4,5) P 2 Sonden zeigt ihre Nanometer - Skala Verteilung in einem INS-1 - Zellen Uhr. (A) iRFP TIRF Bild einer Membranfolie aus einer INS-1 - Zellen exprimiert iRFP-PAmCherry1-PH PLCδ1. (B) entsprechende PALM Bild von PM in der gleichen Region basierend auf PAmCherry1 Signalrekonstruktion. Beachten Sie die homogene PI (4,5) P 2 räumliche Verteilung in großen PM Regionen und mehrere PI (4,5) P 2 Mikrodomänen. (C) eine vergrößerte Ansicht des eingerahmten Bereichs in (B). Pfeile zeigen dünn mit PI (4,5) P 2 Sonden angereichert PM Mikrodomänen verteilt. Maßstabsbalken: A und B: 3 um; C: 500 nm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/54466/54466fig6.jpg" /> Abbildung 6. PALM Bildgebung in der Live - INS-1 - Zellen. (A) TIRF Bild von PI (4,5) P 2 in einer Live - INS-1 - Zellen mEos3.1-PH PLC exprimierenδ1. Das Bild wurde in den grünen Kanal vor PALM Erwerb (35 ° C) schnell erworben. (B) Sequential lebenden Zellen PALM Bilder in 10 Sekunden - Intervall. Einschübe zeigen die Intensitätsprofile des lokalen PI (4,5) P 2 Dichte entlang der gleichen Position gerade Linie 1 zu verschiedenen Zeitpunkten in (B) und (C). Beachten Sie ihre großen lokalen Intensitätsänderungen innerhalb von 10 Sekunden. (D) Zeitverlauf der durchschnittlichen Intensitätsänderungen von PI (4,5) P 2 in der großen Fläche (box2, 3x3 um) und kleine Kreise (3, 4, und 5, 500 nm Durchmesser) in (B) während 5 min von PALM-Bildgebung (Rahmen / 10 sec). Beachten Sie die schnelle Intensitätsschwankungen der lokalen PI (4,5) P 2 Sonden (Kreis 3, 4 und 5) im Vergleich zu sehr kleine Veränderungen in der breiten Fläche (Kasten 2). (E) Vergrößerte PALM Bilder der box2 Region in (B) zu den angegebenen Zeiten. Die Pfeile zeigen PI (4,5) P 2 angereicherte Membranflecken unter physiological Bedingungen. Maßstabsbalken: C: 3 um; E: 500 nm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig6large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

PI (4,5) P 2 regelt verschiedene Zellfunktionen, aber die nanoskaligen Organisation in der Zellplasmamembran ist wenig bekannt. Durch Markierung PI (4,5) P 2 mit einer zweifarbige Fluoreszenzsonde zur Domäne Pleckstrin Homology fusioniert beschreiben wir einen neuen Ansatz der PI (4,5) P 2 in der räumlichen Verteilung der Plasmamembran im Nanometerbereich zu studieren .

Einzelmolekül-Super-Resolution Imaging von Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat in der Plasmamembran mit neuartigen Fluoreszenzsonden

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

single-molecule-super-resolution-imaging-phosphatidylinositol-45

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.5K Aufrufe.  University of Wisconsin-Madison.  PI (4,5) P 2 regelt verschiedene Zellfunktionen, aber die nanoskaligen Organisation in der Zellplasmamembran ist wenig bekannt. Durch Markierung PI (4,5) P 2 mit einer zweifarbige Fluoreszenzsonde zur Domäne Pleckstrin Homology fusioniert beschreiben wir einen neuen Ansatz der PI (4,5) P 2 in der räumlichen Verteilung der Plasmamembran im Nanometerbereich zu studieren . 

Serie: Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular identity and function. Each of the seven PtdInsPs varies in their distribution and abundance, which are tightly regulated by specific kinases and phosphatases. The abundance of PtdInsPs can change abruptly in response to various signaling events or disturbance of the regulatory machinery. To understand how these events lead to changes in the amount of PtdInsPs and their resulting impact, it is important to quantify PtdInsP levels before and after a signaling event or between control and abnormal conditions. However, due to their low abundance and similarity, quantifying the relative amounts of each PtdInsP can be challenging. This article describes a method for quantifying PtdInsP levels by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, which is incorporated into PtdInsPs. Phospholipids are then precipitated and deacylated. The resulting soluble 3H-glycero-inositides are further extracted, separated by high-performance liquid chromatography (HPLC), and detected by flow scintillation. The labeling and processing of yeast samples is described in detail, as well as the instrumental setup for the HPLC and flow scintillator. Despite losing structural information regarding acyl chain content, this method is sensitive and can be optimized to concurrently quantify all seven PtdInsPs in cells.

Phosphoinositides are signaling lipids whose relative abundance rapidly changes in response to various stimuli. This article describes a method to measure the abundance of phosphoinositides by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, followed by extraction and deacylation. Extracted glycero-inositides are then separated by high-performance liquid chromatography and quantified by flow scintillation.

Radiomarkierung und Quantifizierung von Cellular Ebenen Phosphoinositide von High Performance Liquid Chromatography-gekoppelten Durchflussscintilla

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Forschung

Chemie

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an experimental approach with excellent spatial and temporal resolutions. Moreover, such an approach must also have the ability to distinguish receptors localized on the PM from those in intracellular compartments. Most importantly, detecting receptors in a single vesicle requires outstanding detection sensitivity, since each vesicle carries only a small number of receptors. Standard approaches for examining receptor trafficking include surface biotinylation followed by biochemical detection, which lacks both the necessary spatial and temporal resolutions; and fluorescence microscopy examination of immunolabeled surface receptors, which requires chemical fixation of cells and therefore lacks sufficient temporal resolution1-6 . To overcome these limitations, we and others have developed and employed a new strategy that enables visualization of the dynamic insertion of receptors into the PM with excellent spatial and temporal resolutions 7-17 . The approach includes tagging of a pH-sensitive GFP, the superecliptic pHluorin 18, to the N-terminal extracellular domain of the receptors. Superecliptic pHluorin has the unique property of being fluorescent at neutral pH and non-fluorescent at acidic pH (pH &lt; 6.0). Therefore, the tagged receptors are non-fluorescent when within the acidic lumen of intracellular trafficking vesicles or endosomal compartments, and they become readily visualized only when exposed to the extracellular neutral pH environment, on the outer surface of the PM. Our strategy consequently allows us to distinguish PM surface receptors from those within intracellular trafficking vesicles. To attain sufficient spatial and temporal resolutions, as well as the sensitivity required to study dynamic trafficking of receptors, we employed total internal reflection fluorescent microscopy (TIRFM), which enabled us to achieve the optimal spatial resolution of optical imaging (~170 nm), the temporal resolution of video-rate microscopy (30 frames/sec), and the sensitivity to detect fluorescence of a single GFP molecule. By imaging pHluorin-tagged receptors under TIRFM, we were able to directly visualize individual receptor insertion events into the PM in cultured neurons. This imaging approach can potentially be applied to any membrane protein with an extracellular domain that could be labeled with superecliptic pHluorin, and will allow dissection of the key detailed mechanisms governing insertion of different membrane proteins (receptors, ion channels, transporters, etc.) to the PM.

By tagging the extracellular domains of membrane receptors with superecliptic pHluorin, and by imaging these fusion receptors in cultured mouse neurons, we can directly visualize individual vesicular insertion events of the receptors to the plasma membrane. This technique will be instrumental in elucidating the molecular mechanisms governing receptor insertion to the plasma membrane.

Imaging Receptor Insertion in die Plasmamembran pHluorin-Tag in der Grundschule Cultured Mäuseneuronen

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Neurowissenschaften

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and sensitivity in cells because the resolution of conventional light microscopy is diffraction-limited to ~250 nm. By combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM), PPIs can be visualized in cells with single molecule sensitivity and nanometer spatial resolution. BiFC is a commonly used technique for visualizing PPIs with fluorescence contrast, which involves splitting of a fluorescent protein into two non-fluorescent fragments. PALM is a recent superresolution microscopy technique for imaging biological samples at the nanometer and single molecule scales, which uses phototransformable fluorescent probes such as photoactivatable fluorescent proteins (PA-FPs). BiFC-PALM was demonstrated by splitting PAmCherry1, a PA-FP compatible with PALM, for its monomeric nature, good single molecule brightness, high contrast ratio, and utility for stoichiometry measurements. When split between amino acids 159 and 160, PAmCherry1 can be made into a BiFC probe that reconstitutes efficiently at 37 &#176;C with high specificity to PPIs and low non-specific reconstitution. Ras-Raf interaction is used as an example to show how BiFC-PALM helps to probe interactions at the nanometer scale and with single molecule resolution. Their diffusion can also be tracked in live cells using single molecule tracking (smt-) PALM. In this protocol, factors to consider when designing the fusion proteins for BiFC-PALM are discussed, sample preparation, image acquisition, and data analysis steps are explained, and a few exemplary results are showcased. Providing high spatial resolution, specificity, and sensitivity, BiFC-PALM is a useful tool for studying PPIs in intact biological samples.

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC-PALM

Protein-protein interactions are visualized in cells with nanometer spatial resolution by combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM). Described here is the use of BiFC-PALM for imaging Ras-Raf interactions in U2OS cells for visualizing the nanoscale clustering and diffusion of individual Ras-Raf complexes.

Photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie mit Bimolekulare Fluoreszenzkomplementation (BIFC-PALM)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and ...

Biotechnik

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

Einzelmolekülfluoreszenzmikroskopie auf Planar Unterstützte Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found to represent a novel lipid transfer protein (LTP) group in yeast and human cells. They transfer phosphatidylserine (PS) from the endoplasmic reticulum (ER) to the plasma membrane (PM) via PS/phosphatidylinositol 4-phosphate (PI(4)P) exchange cycles. This finding allows a better understanding of how PS, which is critical for signaling processes, is distributed throughout the cell and the investigation of the link between this process and phosphoinositide (PIP) metabolism. The development of new fluorescence-based protocols has been instrumental in the discovery and characterization of this new cellular mechanism in vitro at the molecular level. This paper describes the production and the use of two fluorescently labelled lipid sensors, NBD-C2Lact and NBD-PHFAPP, to measure the ability of a protein to extract PS or PI(4)P and to transfer these lipids between artificial membranes. First, the protocol describes how to produce, label, and obtain high-purity samples of these two constructs. Secondly, this paper explains how to use these sensors with a fluorescence microplate reader to determine whether a protein can extract PS or PI(4)P from liposomes, using Osh6p as a case study. Finally, this protocol shows how to accurately measure the kinetics of PS/PI(4)P exchange between liposomes of defined lipid composition and to determine lipid transfer rates by fluorescence resonance energy transfer (FRET) using a standard fluorometer.

Here, we describe protocols using fluorescent lipid sensors and liposomes to determine whether a protein extracts and transports phosphatidylserine or phosphatidylinositol 4-phosphate in vitro.

Fluoreszenzbasierte Messungen des Phosphatidylserin/Phosphatidylinositol-4-Phosphat-Austauschs zwischen Membranen

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found ...

Biochemie

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific lipid component within a membrane, as in the case of phosphoinositides (PIPs), to ensure specific subcellular localization and/or activation. PIPs and cellular PIP-binding domains have been studied extensively to better understand their role in cellular physiology. We applied a pH modulation assay on supported lipid bilayers (SLBs) as a tool to study protein-PIP interactions. In these studies, pH sensitive ortho-Sulforhodamine B conjugated phosphatidylethanolamine is used to detect protein-PIP interactions. Upon binding of a protein to a PIP-containing membrane surface, the interfacial potential is modulated (i.e. change in local pH), shifting the protonation state of the probe. A case study of the successful usage of the pH modulation assay is presented by using phospholipase C delta1 Pleckstrin Homology (PLC-&#948;1 PH) domain and phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) interaction as an example. The apparent dissociation constant (Kd,app) for this interaction was 0.39 &#177; 0.05 &#181;M, similar to Kd,app values obtained by others. As previously observed, the PLC-&#948;1 PH domain is PI(4,5)P2 specific, shows weaker binding towards phosphatidylinositol 4-phosphate, and no binding to pure phosphatidylcholine SLBs. The PIP-on-a-chip assay is advantageous over traditional PIP-binding assays, including but not limited to low sample volume and no ligand/receptor labeling requirements, the ability to test high- and low-affinity membrane interactions with both small and large molecules, and improved signal to noise ratio. Accordingly, the usage of the PIP-on-a-chip approach will facilitate the elucidation of mechanisms of a wide range of membrane interactions. Furthermore, this method could potentially be used in identifying therapeutics that modulate protein&#39;s capacity to interact with membranes.

Here we present a supported lipid bilayer in the context of a microfluidic platform to study protein-phosphoinositide interactions using a label-free method based on pH modulation.

PIP-on-a-Chip: Eine Label-freie Studie von Protein-Phosphoinositid-Wechselwirkungen

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

High-resolution imaging techniques have shown that many ion channels are not static, but subject to highly dynamic processes, including the transient association of pore-forming and auxiliary subunits, lateral diffusion, and clustering with other proteins. However, the relationship between lateral diffusion and function is poorly understood. To approach this problem, we describe how lateral mobility and activity of individual channels in supported lipid membranes can be monitored and correlated using total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Membranes are fabricated on an ultrathin hydrogel substrate using the droplet interface bilayer (DIB) technique. Compared to other types of model membranes, these membranes have the advantage of being mechanically robust and suitable for highly sensitive analytical techniques. This protocol measures Ca2+ ion flux through single channels by observing the fluorescence emission of a Ca2+-sensitive dye in close proximity to the membrane. In contrast to classical single-molecule tracking approaches, no fluorescent fusion proteins or labels, which can interfere with lateral movement and function in the membrane, are required. Possible changes in ion flux associated with conformational changes of the protein are only due to protein lateral motion in the membrane. Representative results are shown using the mitochondrial protein translocation channel TOM-CC and the bacterial channel OmpF. In contrast to OmpF, the gating of TOM-CC is very sensitive to molecular confinement and the nature of lateral diffusion. Hence, supported droplet-interface bilayers are a powerful tool to characterize the link between lateral diffusion and the function of ion channels.

Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy

This protocol describes how to use TIRF microscopy to track individual ion channels and determine their activity in supported lipid membranes, thereby defining the interplay between lateral membrane movement and channel function. It describes how to prepare the membranes, record the data, and analyze the results.

Einzelmolekül-Bildgebung der lateralen Mobilität und Ionenkanalaktivität in Lipiddoppelschichten mittels Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF)

High-resolution imaging techniques have shown that many ion channels are not static, but subject to highly dynamic processes, including the transient ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during the fusion of vesicle and plasma membranes. These rapid and localized changes are achieved by dynamic interactions between lipids and specialized proteins that control membrane curvature. The absence of such interactions would not only have devastating consequences for vesicle fusion, but a host of other cellular functions that involve control of membrane shape. In recent years, the identity of a number of proteins with membrane-shaping properties has been determined. What remains missing is a roadmap of when, where, and how they act as fusion and content release progress.
Our understanding of the molecular events that enable membrane remodeling has historically been limited by a lack of analytical methods that are sensitive to membrane curvature or have the temporal resolution to track rapid changes. PTIRFM satisfies both of these criteria. We discuss how pTIRFM is implemented to visualize and interpret rapid, submicron changes in the orientation of chromaffin cell membranes during dense core vesicle (DCV) fusion. The chromaffin cells we use are isolated from bovine adrenal glands. The membrane is stained with a lipophilic carbocyanine dye,1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate, or&#160;diD. DiD intercalates in the membrane plane with a &#34;fixed&#34; orientation and is therefore sensitive to the polarization of the evanescent field. The diD-stained cell membrane is sequentially excited with orthogonal polarizations of a 561&#160;nm laser (p-pol, s-pol). A 488&#160;nm laser is used to visualize vesicle constituents and time the moment of fusion. Exocytosis is triggered by locally perfusing cells with a depolarizing KCl solution. Analysis is performed offline using custom-written software to understand how diD emission intensity changes relate to fusion pore dilation.

Polarization-based Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) enables real-time detection of cell membrane dynamics. This article describes the implementation of pTIRFM for the study of membrane remodeling during regulated exocytosis. The technique is generalizable to other processes in cell biology that directly or indirectly involve changes in membrane shape.

Imaging Plasmamembran Verformungen Mit pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Biologie

Utilizing pHluorin-tagged Receptors to Monitor Subcellular Localization and Trafficking

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular organelles and those localized on the plasma membrane. Traditional fluorescence-based measurements lack the capability to distinguish membrane proteins residing in different organelles. Cutting edge methodologies transcend traditional methods by coupling pH-sensitive fluorophores with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). TIRF illumination excites the sample up to approximately 150 nm from the glass-sample interface, thus decreasing background, increasing the signal to noise ratio, and enhancing resolution. The excitation volume in TIRFM encompasses the plasma membrane and nearby organelles such as the peripheral ER. Superecliptic pHluorin (SEP) is a pH sensitive version of GFP. Genetically encoding SEP into the extracellular domain of a membrane protein of interest positions the fluorophore on the luminal side of the ER and in the extracellular region of the cell. SEP is fluorescent when the pH is greater than 6, but remains in an off state at lower pH values. Therefore, receptors tagged with SEP fluoresce when residing in the endoplasmic reticulum (ER) or upon insertion in the plasma membrane (PM) but not when confined to a trafficking vesicle or other organelles such as the Golgi. The extracellular pH can be adjusted to dictate the fluorescence of receptors on the plasma membrane. The difference in fluorescence between TIRF images at neutral and acidic extracellular pH for the same cell corresponds to a relative number of receptors on the plasma membrane. This allows a simultaneous measurement of intracellular and plasma membrane resident receptors. Single vesicle insertion events can also be measured when the extracellular pH is neutral, corresponding to a low pH trafficking vesicle fusing with the plasma membrane and transitioning into a fluorescent state. This versatile technique can be exploited to study localization, expression, and trafficking of membrane proteins.

Labeling the extracellular domain of a membrane protein with a pH sensitive fluorophore, superecliptic pHluorin (SEP), allows subcellular localization, expression, and trafficking to be determined. Imaging SEP-labeled proteins with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) enables the quantification of protein levels in the peripheral ER and plasma membrane.

pHluorin-getaggt Receptors Verwendung zu überwachen subzelluläre Lokalisierung und Handel

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular ...

Live Fluorescence, Inverse Imaging of Cell Ruffling, and Macropinocytosis

Macropinocytosis is a highly conserved but still incompletely understood process that is essential for the uptake and ingestion of fluid, fluid-phase nutrients and other material in cells. The dramatic extension of cell surface ruffles, their closure to form macropinosomes, and the maturation of internalized macropinosomes are key events in this pathway that can be difficult to capture using conventional confocal imaging based on tracking a bolus of fluorescent cargo. Fluorescent dextrans are commonly used experimentally as fluid phase markers for macropinosomes and for other endocytic pathways. A method the lab has adopted to optimize the imaging of dextran uptake involves using live imaging of cells bathed in high concentrations of fluorescent dextran in the medium, with the unlabeled cells appearing in relief (as black). The cell ruffles are highlighted to visualize ruffle closure, and internalized macropinosomes appear as fluorescent vacuoles in the cell interior. This method is optimal for visualizing macropinosome features and allows for easy segmentation and quantification. This paper describes dual-labeling of pathways with different sized dextrans and the co-expression of lipid probes and fluorescent membrane proteins to demark macropinosomes and other endosomes. The detection of internalized dextran at an ultrastructural level using correlative light and electron microscopy (CLEM) is also demonstrated. These cell processes can be imaged using multiple live imaging modalities, including in 3D. Taken together, these approaches optimize macropinosome imaging for many different settings and experimental systems.

<meta charset="utf8"></head><body>Live-Fluoreszenz, inverse Bildgebung von Zellkräuseln und Macropinozytose

This protocol demonstrates dextran imaging in live cells using continuous uptake and inverse images to optimize visualization of ruffling, macropinosome maturation, and analysis of dextran and other cell labelings.

Live-Fluoreszenz, inverse Bildgebung von Zellkräuseln und Macropinozytose

Macropinocytosis is a highly conserved but still incompletely understood process that is essential for the uptake and ingestion of fluid, fluid-phase ...