This work was supported in part by grants from the National Multiple Sclerosis Society (RG 5001-A-3 to S.J.C.), the National Institutes of Health (NS065808 to E.R.B.; NS078392 to S.J.C.), start-up funds from the UConn Health Center (to SJC) and the Kim Family Fund (UCHC in support of K.I.C.).

Alle Verfahren, die Tiere wurden in Übereinstimmung mit der Politik auf humane Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt durch das Amt für Labortierschutz (NIH), und nur mit Zustimmung des Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) der Universität dargelegten Connecticut Health Center. 1. Herstellung der Misch Gliakulturen <ol><li> Sterilisieren alle Instrumente vor der Verwendung. 3 ml eiskaltem, sterilen ausgewogener Hank-Salzlösung (HBSS), die keine Kationen (Mg 2 + oder Ca 2 +) zu drei sterile 60 mm Petrischalen auf Eis gehalten kalt zu halten. </li><li> Isolieren Sie die Rinden von postnatalen P0-P2 Maus Welpen, wie zuvor beschrieben, 17,18. HINWEIS: subkortikalen Strukturen, wie Hippocampus, sind nicht in diesen Kulturen enthalten. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Hirnhaut und übertragen dann die isoliert Kortex an die frische HBSS und distanzieren die Gewebe enzymatisch mit einem neural Gewebedissektion Kit nach Vorschrift des Herstellers. </li><li> Platte die Zellen in sterile T-175-Kolben beimpft und über Nacht in den Medien [Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fetales Rinderserum (FBS) mit 1x Penicillin / Streptomycin]. </li><li> Ersetzen Sie alle Medien am nächsten Tag mit frischen Medien. Weiterhin Kulturen inkubiert, mit regelmäßigen Medienwechsel, für ca. 3 Wochen oder bis ein Mobilmonoschicht etabliert. HINWEIS: 1-Verhältnis 19: Diese Monoschicht wird von Astrozyten und Mikroglia mit einer etwa 10 bestehen. </li></ol> 2. Globoidzell- Induktion im gemischten Gliakulturen <ol><li> Bereiten Sie die ECM-beschichtete Deckgläser. <ol><li> Einweichen Kreisdeckgläser mit steriler 1 N Salzsäure (HCl) in einer sterilen Petrischale für 30 min. Waschen Deckgläser mit sterilem Wasser 3x und dann in 95% EtOH einweichen für mindestens 20 min. und lassen Sie dann an der Luft trocknen. </li><li> Ort Tröpfchen verdünnter extrazellulären matrix (ECM) Protein Beschichtungsmaterialien auf ein Blatt Parafilm (zB 150-250 ul / Tröpfchen von Laminin 10 ug / ml in steriler Phosphat-Pufferlösung [PBS]). Verteilen Sie die Tröpfchen, so dass Deckgläser nicht berühren, wenn sie auf dieser Tröpfchen platziert. Stellen sanft getrocknet jedes Deckglas auf einem Tröpfchen mit einer Pinzette. </li><li> Lassen Sie die Deckgläser an den Tröpfchen für ca. 4-6 Stunden in der Kultur Kapuze mit geschlossenem Frontschieber. </li><li> Platzieren Sie die ECM-beschichtete Deckgläser (ECM-beschichtete Seite nach oben) in jede der Vertiefungen einer 24-Well-Platte. Waschen Sie jede Vertiefung mit sterilem PBS 3x und halten bei 4 ° C, bis sie benötigt. </li></ol></li><li> Vorbereitung Gliazellen für die Beschichtung auf Deckgläser. <ol><li> Saugen Sie das Medium von den Gliazellen Kulturen und vorsichtig waschen die Glia-Monolayer 3x mit 10 ml sterilem PBS. Als Nächstes fügen 8-10 ml Trypsin-EDTA-Lösung zu dem T-175 und Inkubation für 5-10 min bei 37 ° C aufweist. </li><li> Wenn die meisten der Monoschicht abgelöst wurde, 20 ml Vollmediumin den Kolben zu Trypsinierung zu stoppen. Sammeln Sie die Medien, die die abgelösten Zellen in ein 50 ml konischen Röhrchen und Spin für 10 min bei 300 g bei Raumtemperatur. </li><li> Saugen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören, und dann wieder die Zellen in 2 ml frischem Vollmedium durch vorsichtiges Pipettieren die Lösung mit dem P1000 Pipette. </li><li> Bestimmen der Anzahl der Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und resuspendieren Zellen in Komplettmedium bei der gewünschten Dichte (beispielsweise 10 5 Zellen / ml). Platte der Zellen auf den ECM-beschichtete Deckgläser (zB 500 ul in jede Vertiefung der 24-Well-Platte). Hinzufügen zusätzlicher frischem Komplettmedium zu jeder Vertiefung für 3-5 Tagen Inkubation bei 37 ° C, oder bis die Zellen wachsen, um die gewünschte optische Konfluenz. </li></ol></li><li> Behandlung mit Psychosin. <ol><li> Die Rekonstitution der Psychosin in eine Aktienkonzentration (108,3 mM) in Dimethylsulfoxid (DMSO). Verdünnen diese Aktie in 100% EtOH, eine Arbeits Lager machen, dass der CANn in jede Vertiefung der 24-Well-Platte gegeben, um eine Endkonzentration von 10 uM zu erzielen. </li><li> Zum Zeitpunkt der Zugabe des Psychosin, schwenken Sie die Kulturplatte, die Psychosin in Kulturmedien zu mischen. Ergänzung der Psychosin, indem das Äquivalent von 10 uM jeden zweiten Tag für eine Woche. </li></ol></li><li> Nach 7 Tagen Psychosin Behandlung, sammeln die Medien und die Pipette 500 ul kaltem 4% Paraformaldehyd (PFA) in jedes Well. Inkubieren bei Raumtemperatur für 20 min, um die Zellen zu fixieren. Dann waschen Sie jedes Well 3x mit PBS und dann halten Platten bei 4 ° C bis zur Immunzytochemie verarbeitet werden (siehe unten). HINWEIS: Zellkulturmedien für enzymatische oder ELISA-Test an dieser Stelle auf Wunsch abgeholt werden. </li></ol> 3. Immunzytochemie (ICC) zu Globoid Zellen sichtbar <ol><li> Ersetzen PBS mit Blockierungspuffer [PBS + 0,3% Tween-20 + 5% normalem Ziegenserum (NGS)], und Inkubieren der Zellen für 1 Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Incubate der fixierten Zellen in primären Antiseren gegen Iba-1 [(1: 1.000) in PBS + 0,3% Tween-20 + 2% NGS] für mindestens 1 h bei Raumtemperatur, dann waschen jedes Well mit PBS 3x 5 min / waschen. </li><li> Fügen Sie den entsprechenden sekundären Fluoreszenz-konjugierte Antikörper, um die primäre Antikörpermarkierung und Gegenfärbung mit 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI, 1: 1.000) zu identifizieren, um Kerne zu identifizieren. Inkubieren sekundären Antikörper-Lösung 1 h bei Raumtemperatur und Waschen mit PBS 3x 5 min. </li><li> Montieren Sie je Deckglas auf Objektträger unter dem Mikroskop Montagemedium. Blick gleitet auf einem Fluoreszenzmikroskop für die visuelle und quantitative Analysen. </li></ol> 4. Analyse und Charakterisierung von Globoidzellen in Primärkultur <ol><li> Verwenden Sie die folgenden drei morphologischen Kriterien, um eine Globoidzell in Kultur zu identifizieren: <ol><li> Identifizieren Globoidzellen mit Fluoreszenzmikroskopie von immun Kennzeichnung für die Mikroglia-Marker Iba-1 +. </li><li> IdentifizierenGloboidzellen als kernigen (dh, zwei oder mehr DAPI positiven Kernen). </li><li> Identifizieren Globoidzellen durch eine abgerundete Morphologie unterscheidet sich von der stark verzweigten Aussehen von ruhenden Mikrogliazellen. Hinweis: Zellen können auch für Zelloberflächenmarker-Analyse und Quantifizierung mittels Durchflusszytometrie aus diesen Kulturen gesammelt werden. </li></ol></li><li> Messung der phagozytierenden Aktivierung der Mikroglia und Globoidzellen <ol><li> Um die phagozytische Aktivität von Psychosin behandelten Mikroglia beurteilen, fügen FITC-markierten Latexkügelchen auf die Vertiefungen in Übereinstimmung mit den Anweisungen des Herstellers. Fügen fluoreszierende Latexkügelchen-konjugierten 48 Stunden vor der Fixierung mit PFA. Fix Zellen mit Perlen behandelt (wie in Abschnitt 2.4 erwähnt), und ein Verfahren zur Immunzytochemie (wie in Abschnitt 3 beschrieben). </li><li> Wählen Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörper, so daß sie das Fluoreszenzemissionsspektrum des Fluorophors markierten Kügelchen nicht überlappen. </li><li> Analyze die phagozytotische Profile der Iba-1 + Mikroglia durch die Identifizierung die Zellen, die Co-Lokalisation mit den fluoreszenzmarkierten Perlen. HINWEIS: Psychosin wird Mikroglia zu aktivieren. Phagozytierten Perlen innerhalb einkernigen und mehrkernigen Iba-1 + Zellen in dieser Kultur Einstellung identifiziert werden. </li></ol></li></ol> 5. Induktion von Globoidzellen aus gereinigten Mikroglia Kulturen HINWEIS: Ein alternativer Ansatz zur interzellulären Signal zwischen dem Astrozyten und Mikroglia zu entziffern ist ein weiterer Vorteil dieses in vitro Globoidzell Modell. Reinigung von primären Mikrogliazellen für Replattierung oder Co-Kultivierung können durch ihre Unterhalten Immobilie in Kultur erreicht werden, wie in den folgenden Schritten (siehe Abschnitt 5.2) beschrieben. <ol><li> Sammeln Sie die Medien aus den zusammenfließenden Misch Gliakulturen in 50 ml konischen Röhrchen und pflegen sie in den Brutschrank bei 37 ° C. </li><li> Mikroglia-Isolierung aus Primär Mixed Gliakulturen.<ol><li> Nach dem Entfernen der Medien aus einer konfluenten gemischten Gliazellen Kultur T175 Kolben gemischt, warmen Schütteln Medien [bestehend aus kompletten Medien + 25 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES) + 25 mM Natriumhydrogencarbonat (Sigma)]. Schütteln Sie die Flaschen für 3-4 h in einem Orbitalschüttler bei 100 Upm (37 ° C). Sammeln Sie die Medien aus diesen Schüttelkolben in 50 ml konischen Röhrchen. HINWEIS: Diese Medien werden die weniger haft Mikroglia aus den Flaschen gehören. </li><li> Drehen Sie die Medien bei 300 g für 10 min bei Raumtemperatur. Saugt den Überstand und resuspendiere die Zellen in 2 ml des Astrozyten-konditioniertem Medium (in Schritt 5.1 gesammelt). </li><li> Stellen Sie die Anzahl von Zellen mit einer Zählkammer und dann die Platte Mikroglia-Zellen auf das Substrat-beschichtete Deckgläser erworben (siehe Abschnitt 2.1) für Immunzytochemie oder Platte auf UltraLow ​​Einhaltung Well-Platten für die künftige Sammlung von Globoidzellen für Co-Kultur mit anderen Zelltypen, wie Oligodendrozyten (als absteigendim folgenden Abschnitt ribed). HINWEIS: Sobald die Mikroglia vergoldet mit Psychosin (10 uM) wie oben beschrieben (siehe Abschnitt 2.3) behandelt werden. </li></ol></li><li> Co-Kultur mit primären Oligodendrozyten für die Analyse der Zytotoxizität. HINWEIS: Sammlung von Psychosin behandelten Mikroglia von den niedrigen Einhaltung Platten für die spätere Co-Kultur auf Primärkulturen von Oligodendrozyten oder Oligodendrozyten-Vorläuferzellen, können verwendet werden, um das Potenzial zytotoxische Funktion dieser Globoid-ähnliche Zellen in vitro zu untersuchen. <ol><li> Entwickeln Kulturen von primären Oligodendrozyten mit etablierten Methoden 18,20. Um die Psychosin behandelten Mikroglia sammeln, vorsichtig pipettieren, um die lose anhaftenden Zellen vom Boden der Wells zu lösen. Sammeln Sie die Zellen, Zentrifuge bei 300 g für 10 min, und dann sorgfältig in Oligodendrozyten-Differenzierung Medien [von Neurobasal Medien zusammen zu suspendieren, L-Glutamin (1x), B-27 Ergänzung (1x) und Trijodthyronin (T3, 10 ng / ml )]. </li><li> Die Anzahl der Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und dann Samen der Mikroglia auf die Oligodendrozyten-Kultur bei 1 x 10 5 Zellen / ml, was eine ungefähre 1: 2 Mikroglia / Oligodendrozyten-Verhältnis. Inkubieren als Co-Kultur für bis zu 3 Tagen. </li><li> Befestigen Sie die Zellen, die für Immunzytochemie (siehe Abschnitt 2.4). Sammeln Zellkulturmedien für ELISA oder chemische Analysen, wie gebraucht. </li></ol></li></ol>

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The authors declare no conflicts of interest.

Das hierin beschriebene Protokoll sieht ein neues Modellsystem, in dem die Entwicklung und funktionelle Charakterisierung von aktivierter Mikroglia und Globoidzellen studieren. Frühere Arbeiten von Im et al. mit einer HEK293-Zelllinie ein Template für die Entwicklung des vorliegenden Protokolls für das Studium der Globoidzell Bildung 21. Es ist auch wichtig, darauf hinzuweisen, dass die Globoidzellen im Modell abgeleitet von den nativen Globoidzellen identifizierbar GLD abweichen. Zum Beispiel hab...

Globoidzell Leukodystrophie (GLD), auch als Morbus Krabbe genannt, ist eine tödliche demyelinisierende Krankheit von Funktionsverlust-Mutationen in der galatocerebrosidase (GALC) Gen 1 resultieren. Die am weitesten verbreitete Form der GLD ist die Kinder-Variante, die von Beginn in der frühen Kindheit und typisiert wird, gekennzeichnet durch einen aggressiven klinischen Verlauf der motorischen und kognitiven Rückgang führt zu vorzeitigem Tod oft vor Ablauf von fünf Jahren 2,3. Genetische Tests wird verwendet, um eine Diagnose der GLD 4 überprüfen. Neuropathologie der GLD enthüllt weit verbreitete Demyelinisierung, neuronale Atrophie, Astrogliose und Gegenwart angeschwollen mehrkern Mikroglia genannt Globoidzellen 5-7. Die Identifizierung von Globoidzellen, oft tubulous Einschlüsse in ihrem Zytoplasma enthält, hat in den letzten 97 Jahre zu einem prägenden Merkmal der GLD, obwohl die spezifische Funktion dieser Zellen ist auffällig vor schwer. Die Beteiligung von Nicht-MYELUrsprung Gliazellen (Astrozyten und Mikroglia) in der Pathogenese der GLD ist seit langem als eine sekundäre Reaktion auf die tiefgreifenden Demyelinisierung bei dieser Erkrankung 8. Interessant ist, dass die erste Beschreibung dieser Krankheit, von Knud Krabbe 1916 5 gemacht, berichtete die Bildung von mehrkernigen Phagozyten, lipidhaltigen Ablagerungen, die genannt worden &#39;Globoidzellen&#39; und sind ein charakteristisches Merkmal dieser Krankheit. Globoidzellen sind das Markenzeichen Merkmal der GLD Pathologie, obwohl ihre Rolle in der GLD ist seit langem ignoriert. Interessanterweise sind diese Zellen zu den ersten charakteristischen Veränderungen in ZNS-Gewebe von GLD. Dieser Mangel an Wissen kann auf der Annahme, daß die Bildung von vielkernigen Phagozyten genannte Riesenzellen bei anderen Krankheiten, werden typischerweise als eine Folge der Pathologie als eher als eine anfängliche Antriebskraft pathogenen 9 gewesen. Daher gibt es nur wenige Studien zur Untersuchung des Mechanismus, durch WHICH Globoidzellen von Phagozyten insbesondere im ZNS von GLD gebildet. Die in diesem Bericht beschriebenen Verfahren konzentriert sich auf die Bedeutung der Globoidzell Bildung im ZNS und unseren bisherigen Nachweis, dass Psychosin-induzierte multinucleation der Mikroglia in vitro und diese Zellen zeigten höhere Phagozytose. In Übereinstimmung mit diesen Beobachtungen, Globoidzellen in twitcher Gehirne enthalten häufig PAS-positive Ablagerungen, was hohe Phagozytose. Globoidzellen finden sich auch immun für Ferritin zu sein (a Mikroglia-Marker) 10, KP-1 / CD68 (a Monozyten-Marker), und einige sind auch positiv für Vimentin (ein Zwischen Filament-Protein und Marker für Astrozyten und aktivierte Mikroglia) 11, HLA-DRa (ein MHCII Oberflächenrezeptor) und TNF-α 7 und Iba-1 (ein Calcium-Bindungsprotein verwendet, um zu identifizieren Mikroglia) 12. Auf der Grundlage dieser Sammlung von Markern, Globoidzellen stammen aus Mikrogliazellen, die sich entwickelnein einzigartiges Phänotyp. Trotz ihrer Einzigartigkeit wurde die spezifische Funktion und der Beitrag der GCs zu GLD Pathogenese weitgehend übersehen. Globoidzellen haben gedacht worden, um eine sekundäre Folge der chronischen Demyelinisierung sein. Allerdings ist durch frühere Studien, die die zeitliche Assoziation von Globoidzellen auf der weißen Substanz Pathologie der GLD die Anwesenheit von Globoid Zellen in der späten embryonalen frühen postnatalen Zeit identifiziert; mal vorstehenden Oligodendrozytenapoptose und offene Demyelinisierung 13. Somit wird die zeitliche Abfolge der Entwicklung der Neuropathologie in GLD legt nahe, dass Globoidzellen im Voraus der Demyelinisierung bei dieser Erkrankung 14 ausgebildet. Dies führte zu unserer Hypothese, dass die frühe Bildung von Globoidzellen in GLD kann eine Definition von pathogenen Veranstaltung eher als eine sekundäre, reaktive Antwort auf Oligodendrozyten-Schaden 15 stellen. Zusätzlich Dysregulation der Mikroglia-Aktivität in GLD ist als ein factor Begrenzung der Langzeitwirksamkeit von hematopeotic Stammzelltherapien für die Behandlung dieser Krankheit 16. Somit untersucht die Zellfunktionen und Regeln der Mikroglia und Globoidzellen in Reaktion auf Psychosin soll neue Einblicke in die Pathogenese von GLD ist. Bis vor kurzem war das Fehlen eines geeigneten Modells, in dem Globoidzell Bildung zu untersuchen, das Verständnis der genauen Funktion und der Beitrag dieser Zellen zu der Pathologie der GLD beschränkt. In neueren Studien wurde festgestellt, dass Globoid-ähnlichen Zellen können als direkte Reaktion gebildet, um Psychosin, eine pathogene Lipid Toxin, das in GLD sammelt werden. Wir fanden, dass Mikroglia, aber nicht Makrophagen, aktiviert und in Reaktion in Globoidzellen in der Grund Gliakulturen transformiert, um Psychosin 15. Die Umwandlung in Globoidzellen wurde gefunden, durch die extrazelluläre Protease, die Matrix-Metalloproteinase (MMP) -3 15 vermittelt werden. In jüngerer Zeit haben wirhaben diese Ergebnisse, dass Psychosin-aktivierte Mikroglia und Globoidzellen in dieser In-vitro-Modellsystem entwickelt, erweitert und bestimmt sind potent giftig für Oligodendrozyten und Oligodendrozyten-Vorläuferzellen. Daher wird, wenn im Rahmen der GLD, der frühen Anhäufung von Psychosin und Bildung Globoidzellen vor Demyelinisierung würde eine aufstrebende primären und möglicherweise pathogene Rolle für Mikroglia bei dieser Krankheit unterstützt betrachtet. Wir schlagen vor, dass die Studie von Globoidzell Bildung wird neue Informationen über die Pathogenese der GLD, die zum Verständnis dieser Krankheit beitragen wird offenbaren. Darüber hinaus kann dieses neue Modell der zellulären GLD ein neues Format, aus denen neue therapeutische Ansätze zur Adresse pathologischen Veränderungen bei dieser Erkrankung getestet werden könnten. Daher wird in diesem Bericht stellen wir ein detailliertes Protokoll für die in vitro Entwicklung von Psychosin induzierte Globoidzellen aus Primärkulturen von nicht-myelinisierenden Glia.

<table><tbody><tr><td>Hank&amp;rsquo;s balanced salt solution (HBSS) containing no cations (Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; and Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;).</td><td>Life technologies</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Neural Tissue Dissociation Kit</td><td>Miltenyi</td><td>130-092-628</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;#956;m cell-strainer</td><td>Fisherbrand</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s balanced salt solution (HBSS) containing cations (Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; and Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;).</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s modified eagle medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>fetal bovine serum (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin/Streptomycin</td><td>Life technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA solution</td><td>Life technologies</td><td>25299-056</td><td></td></tr><tr><td>Psychosine</td><td>Sigma</td><td>P9256</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>19208</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum (NGS)</td><td>Invitrogen</td><td>PCN5000</td><td></td></tr><tr><td>Iba-1</td><td>WAKO</td><td>019-19741</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor conjugated antisera</td><td>Life Technologies</td><td>Various</td><td></td></tr><tr><td>Mounting Media</td><td>Southern Biotech</td><td>OB100-01</td><td></td></tr><tr><td>Phagocytic Assay Kit</td><td>Cayman Chemicals</td><td>500290</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>BP310-500</td><td></td></tr></tbody></table>

an in vitro model for the study of cellular pathophysiology in globoid cell leukodystrophy

Die genaue Funktion der Mehrkern Mikroglia genannt Globoidzellen, die im Zentralnervensystem Globoidzell Leukodystrophie (GLD) eindeutig reichlich sind, ist unklar. Diese Wissenslücke wurde durch den Mangel eines geeigneten in vitro-Modell zur Untersuchung behindert. Hier beschreiben wir einen primären murinen Gliazellen Kultursystem, in dem die Behandlung mit Psychosin ergibt multinucleation der Mikroglia ähnlich den Kenn Globoidzellen in GLD gefunden. Mit diesem neuartigen System definierten wir die Bedingungen und Formen der Analyse für das Studium der Globoidzellen. Die mögliche Verwendung von diesem Modellsystem wurde in unserer vorherigen Studie, die eine mögliche Rolle für die Matrix-Metalloproteinase (MMP) identifiziert validiert -3 in GLD. Diese neuartige in vitro-System kann ein nützliches Modell, in dem die Bildung und Funktion, sondern auch die potentielle therapeutische Manipulation dieser einzigartigen Zellen zu studieren.

Dieses Protokoll, wie geschrieben, wird erwartet, dass etwa 36 Tage, um von Anfang bis Ende (siehe Abbildung 1: Experimentell Workflow-Schema) zu vervollständigen. Es ist unsere Erfahrung, dass die Entwicklung von &quot;Globoid-like &#39;Zellen in dieser Primärkultur-System ist zuverlässig und reproduzierbar: die Bildung von vielkernigen Zellen in Reaktion auf Psychosin konsequent mit 7 Tagen der Behandlung beobachtet. Immunzytochemische Färbung der Mikroglia mit Iba-1 i...

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An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells.

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell für die Untersuchung der zellulären Pathophysiologie in Globoidzell- Leukodystrophie

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

an-vitro-model-for-study-cellular-pathophysiology-globoid-cell

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

7.8K Aufrufe.  University of Connecticut Health Center. Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells. 

Serie: An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and Schwann cells in the peripheral nervous system (PNS). We use an in vitro myelination assay, an established model for studying CNS myelination in vitro. To do this, oligodendrocyte precursor cells (OPCs) are added to the purified primary rodent dorsal root ganglion (DRG) neurons to form myelinating co-cultures. In order to specifically interrogate the roles that particular proteins expressed by oligodendrocytes exert upon myelination we have developed protocols that selectively transduce OPCs using the lentivirus overexpressing wild type, constitutively active or dominant negative proteins before being seeded onto the DRG neurons. This allows us to specifically interrogate the roles of these oligodendroglial proteins in regulating myelination. The protocols can also be applied in the study of other cell types, thus providing an approach that allows selective manipulation of proteins expressed by a desired cell type, such as oligodendrocytes for the targeted study of signaling and compensation mechanisms. In conclusion, combining the in vitro myelination assay with lentiviral infected OPCs provides a strategic tool for the analysis of molecular mechanisms involved in myelination.

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Here we present protocols that offer a flexible and strategic foundation for virally manipulating oligodendrocyte precursor cells to overexpress proteins of interest in order to specifically interrogate their role in oligodendrocytes via the in vitro model of central nervous system myelination.

Herstellung und Verwendung von Lentivirus, um selektiv zu transduzieren Primäre Oligodendrozyten Vorläuferzellen für<em&gt; In-vitro-</em&gt; Myelinisierung Assays

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Preparation of Rat Oligodendrocyte Progenitor Cultures and Quantification of Oligodendrogenesis Using Dual-infrared Fluorescence Scanning

Efficient oligodendrogenesis is the therapeutic goal of a number of areas of research including spinal cord injury, neonatal hypoxia, and demyelinating diseases such as multiple sclerosis and transverse myelitis. Myelination is required to not only facilitate rapid impulse propagation within the central nervous system, but also to provide trophic support to underlying axons. Oligodendrocyte progenitor cells (OPCs) can be studied in vitro to help identify factors that may promote or inhibit oligodendrocyte differentiation. To date, many of the methods available to evaluate this process have either required large numbers of cells, thus limiting the number of conditions that can be investigated at any one time, or labor-intensive methods of quantification. Herein, we describe a protocol for the isolation of large numbers of highly pure OPCs together with a fast and reliable method to determine oligodendrogenesis from multiple conditions simultaneously. OPCs are isolated from P5-P7 neonatal rat cortices and grown in vitro for three days prior to differentiation. Four days after differentiation, oligodendrogenesis is evaluated using a dual-infrared fluorescence-scanning assay to determine expression of the myelin protein.

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. This protocol describes a method for the isolation and culture of their precursors, oligodendrocyte progenitor cells, from rat cortices, as well as a fast and reliable quantitative method to evaluate oligodendrogenesis in vitro in response to experimental factors.

Herstellung von Ratten Oligodendrozyten Vorläuferkulturen und Quantifizierung von Oligodendrogenesis Mit Doppel-Infrarot-Fluoreszenz-Scanning

Efficient oligodendrogenesis is the therapeutic goal of a number of areas of research including spinal cord injury, neonatal hypoxia, and demyelinating ...

Derivation of Glial Restricted Precursors from E13 mice

This is a protocol for derivation of glial restricted precursor (GRP) cells from the spinal cord of E13 mouse fetuses. These cells are early precursors within the oligodendrocytic cell lineage. Recently, these cells have been studied as potential source for restorative therapies in white matter diseases. Periventricular leukomalacia (PVL) is the leading cause of non-genetic white matter disease in childhood and affects up to 50% of extremely premature infants. The data suggest a heightened susceptibility of the developing brain to hypoxia-ischemia, oxidative stress and excitotoxicity that selectively targets nascent white matter. Glial restricted precursors (GRP), oligodendrocyte progenitor cells (OPC) and immature oligodendrocytes (preOL) seem to be key players in the development of PVL and are the subject of continuing studies. Furthermore, previous studies have identified a subset of CNS tissue that has increased susceptibility to glutamate excitotoxicity as well as a developmental pattern to this susceptibility. Our laboratory is currently investigating the role of oligodendrocyte progenitors in PVL and use cells at the GRP stage of development. We utilize these derived GRP cells in several experimental paradigms to test their response to select stresses consistent with PVL. GRP cells can be manipulated in vitro into OPCs and preOL for transplantation experiments with mouse PVL models and in vitro models of PVL-like insults including hypoxia-ischemia. By using cultured cells and in vitro studies there would be reduced variability between experiments which facilitates interpretation of the data. Cultured cells also allows for enrichment of the GRP population while minimizing the impact of contaminating cells of non-GRP phenotype.

This protocol outlines the derivation of Glial Restricted Precursors from fetal spinal cords and maintained in vitro either for transplantation or for the study of oligodendrocytic lineage.

Ableitung von Gliazellen Eingeschränkte Vorstufen aus E13-Mäusen

This is a protocol for derivation of glial restricted precursor (GRP) cells from the spinal cord of E13 mouse fetuses. These cells are early precursors ...

Neurowissenschaften

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8+ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of &#8216;&#8216;collateral&#8217;&#8217; neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

Ein<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Modell eines Oligodendrozyten-gerichtete T-Cell Attack in akuten Hirnschnitten

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Immunologie und Infektion

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Analyse von Lymphozyten-Extravasation einer Verwendung<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell des Barrier Menschliches Blut-Hirn

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Modeling Myotonic Dystrophy 1 in C2C12 Myoblast Cells

Myotonic dystrophy 1 (DM1) is a common form of muscular dystrophy. Although several animal models have been established for DM1, myoblast cell models are still important because they offer an efficient cellular alternative for studying cellular and molecular events. Though C2C12 myoblast cells have been widely used to study myogenesis, resistance to gene transfection, or viral transduction, hinders research in C2C12 cells. Here, we describe an optimized protocol that includes daily maintenance, transfection and transduction procedures to introduce genes into C2C12 myoblasts and the induction of myocyte differentiation. Collectively, these procedures enable best transfection/transduction efficiencies, as well as consistent differentiation outcomes. The protocol described in establishing DM1 myoblast cell models would benefit the study of myotonic dystrophy, as well as other muscular diseases.

In this protocol, we present the procedures in establishing myotonic dystrophy 1 myoblast models, including optimized C2C12 cell maintenance, gene transfection/transduction, and myocyte differentiation.

Modellierung Muskeldystrophie 1 in C2C12 Myoblastenzellen

Myotonic dystrophy 1 (DM1) is a common form of muscular dystrophy. Although several animal models have been established for DM1, myoblast cell models are ...

Medizin

Adult Mouse DRG Explant and Dissociated Cell Models to Investigate Neuroplasticity and Responses to Environmental Insults Including Viral Infection

This protocol describes an ex vivo model of mouse-derived dorsal root ganglia (DRG) explant and in vitro DRG-derived co-culture of dissociated sensory neurons and glial satellite cells. These are useful and versatile models to investigate a variety of biological responses associated with physiological and pathological conditions of the peripheral nervous system (PNS) ranging from neuron-glial interaction, neuroplasticity, neuroinflammation, and viral infection. The usage of DRG explant is scientifically advantageous compared to simplistic single cells models for multiple reasons. For instance, as an organotypic culture, the DRG explant allows ex vivo transfer of an entire neuronal network including the extracellular microenvironment that play a significant role in all the neuronal and glial functions. Further, DRG explants can also be maintained ex vivo for several days and the culture conditions can be perturbed as desired. In addition, the harvested DRG can be further dissociated into an in vitro co-culture of primary sensory neurons and satellite glial cells to investigate neuronal-glial interaction, neuritogenesis, axonal cone interaction with the extracellular microenvironment, and more general, any aspect associated with the neuronal metabolism. Therefore, the DRG-explant system offers a great deal of flexibility to study a wide array of events related to biological, physiological, and pathological conditions in a cost-effective manner.

In this report, the advantages of organotypic cultures and dissociated primary cultures of mouse-derived dorsal root ganglia are highlighted to investigate a wide range of mechanisms associated with neuron-glial interaction, neuroplasticity, neuroinflammation, and response to viral infection.

Erwachsenen Maus DRG Explant und distanzierte Zellmodelle um Neuroplastizität und Antworten auf ökologische Beleidigungen einschließlich Virusinfektion zu untersuchen

This protocol describes an ex vivo model of mouse-derived dorsal root ganglia (DRG) explant and in vitro DRG-derived co-culture of dissociated sensory ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present methods for the development of assays to query potentially clinically significant nonsynonymous changes using in vivo complementation in zebrafish. Zebrafish (Danio rerio) are a useful animal system due to their experimental tractability; embryos are transparent to enable facile viewing, undergo rapid development ex vivo, and can be genetically manipulated.1 These aspects have allowed for significant advances in the analysis of embryogenesis, molecular processes, and morphogenetic signaling. Taken together, the advantages of this vertebrate model make zebrafish highly amenable to modeling the developmental defects in pediatric disease, and in some cases, adult-onset disorders. Because the zebrafish genome is highly conserved with that of humans (~70% orthologous), it is possible to recapitulate human disease states in zebrafish. This is accomplished either through the injection of mutant human mRNA to induce dominant negative or gain of function alleles, or utilization of morpholino (MO) antisense oligonucleotides to suppress genes to mimic loss of function variants. Through complementation of MO-induced phenotypes with capped human mRNA, our approach enables the interpretation of the deleterious effect of mutations on human protein sequence based on the ability of mutant mRNA to rescue a measurable, physiologically relevant phenotype. Modeling of the human disease alleles occurs through microinjection of zebrafish embryos with MO and/or human mRNA at the 1-4 cell stage, and phenotyping up to seven days post fertilization (dpf). This general strategy can be extended to a wide range of disease phenotypes, as demonstrated in the following protocol. We present our established models for morphogenetic signaling, craniofacial, cardiac, vascular integrity, renal function, and skeletal muscle disorder phenotypes, as well as others.

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present a systematic approach for developing physiologically relevant, sensitive and specific in vivo assays for interpreting variation in human pathology. Transient genetic manipulation via microinjection of WT and mutant human mRNA and morpholino (MO) antisense oligonucleotides harness the tractability of the developing zebrafish embryo to rapidly assay pathogenic mutations, especially, but not exclusively, in the context of human developmental disorders.

In Vivo Modellierung des Morbid Human Genome mit Danio rerio

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

Biologie

Ex Vivo Myelination and Remyelination in Cerebellar Slice Cultures as a Quantitative Model for Developmental and Disease-Relevant Manipulations

Studying myelination&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo poses numerous challenges. The differentiation of oligodendrocyte precursor cells (OPCs)&#160;in vitro, although scalable,&#160;does not recapitulate axonal myelination. OPC-neuron cocultures and OPC-fiber cultures allow for the examination of in vitro myelination, but they lack additional cell types that are present in vivo, such as astrocytes and microglia. In vivo&#160;mouse models, however, are less amenable to chemical, environmental, and genetic manipulation and are much more labor intensive. Here, we describe&#160;an&#160;ex vivo mouse cerebellar slice culture (CSC) quantitative system that is useful for: 1) studying developmental myelination, 2) modeling demyelination and remyelination, and 3) conducting translational research. Sagittal sections of the cerebellum and hindbrain are isolated from postnatal day (P) 0&#8211;2 mice, after which they myelinate&#160;ex vivo&#160;for 12 days. During this period, slices can be manipulated in various ways, including the addition of compounds to test for an effect on developmental myelination. In addition, tissue can be fixed for electron microscopy to assess myelin ultrastructure and compaction. To model disease, CSC can be subjected to acute hypoxia to induce hypomyelination. Demyelination in these explants can also be induced by lysolecithin, which allows for the identification of factors that promote remyelination. Aside from chemical and environmental modifications, CSC can be isolated from transgenic mice and are responsive to genetic manipulation induced with Ad-Cre adenoviruses and tamoxifen. Thus, cerebellar slice cultures are a fast, reproducible, and quantifiable model for recapitulating myelination.

Presented is a protocol for an ex vivo quantitative model of demyelination and remyelination using mouse cerebellar slice cultures. This method closely recapitulates an in vivo model with its full complement of CNS cell types in intact tissue, while maintaining the chemical, genetic, and environmental amenability of an in vitro system.

Studying myelination&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo poses numerous challenges. The differentiation of oligodendrocyte precursor cells (OPCs)&#160;in ...

Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine neonates for the isolation of glial subpopulations. The purpose of the procedure is to dissociate microglia, oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), and astrocytes from cortical, cerebellar, brainstem, and spinal cord tissue to facilitate further in vitro analysis. The CNS region isolation procedures allow for the determination of regional heterogeneity among glia in multiple cell culture systems. Rapid CNS region isolation is performed, followed by the mechanical removal of meninges to prevent meningeal cell contamination of glia. This protocol combines gentle tissue dissociation and plating on a specified matrix designed to preserve cell integrity and adherence. Isolating mixed glia from multiple CNS regions provides a comprehensive analysis of potentially heterogenous glia while maximizing the use of individual experimental animals. Additionally, following dissociation of regional tissue, mixed glia are further divided into multiple cell types including microglia, OPCs, and astrocytes for use in either single cell type, cell culture plate inserts, or co-culture systems. Overall, the demonstrated techniques provide a comprehensive protocol of broad applicability for careful dissection of four individual CNS regions from murine neonates and includes methods for the isolation of three individual glia cell types to examine regional heterogeneity in any number of in vitro cell culture systems or assays.

Here we present a protocol for in vitro isolation of multiple glial cell populations from a mouse CNS. This method allows for the segregation of regional microglia, oligodendrocyte precursor cells, and astrocytes to study the phenotypes of each in a variety of culture systems.

Dissektion und Isolierung von murinen Glia aus mehreren Regionen des zentralen Nervensystems

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

Ein

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Herstellung und Verwendung von Lentivirus, um selektiv zu transduzieren Primäre Oligodendrozyten Vorläuferzellen für