Diese Arbeit wird durch die KAIST finanzierten K-Tal RED &amp; B-Projekt für 2014 und der Basic Science-Research-Programm durch die National Research Foundation of Korea (NRF- 2012R1A6A3A040395, NRF-2013R1A1A2057708, NRF- 2012R1A1A1011023) unterstützt.

Achtung: Siehe Sicherheitsdatenblätter (MSDS) vor der Verwendung von Aceton und Chloroform, die krebserregend sind. 1. Herstellung von Phospholipidschicht an einer Wohnung Luft-Wasser- <ol><li> Bildung einer Phospholipidschicht <ol><li> Herstellung einer Phospholipidlösung <ol><li> Reinigen Sie eine 4 ml mit einem Polytetrafluorethylen Kappe mit Aceton, Ethanol und entionisiertem Wasser mindestens dreimal Fläschchen, und blasen Stickstoffgas gründlich in das Fläschchen, um Wasser zu entfernen. </li><li> Man löst 1 mg Phospholipid (zB Dioleoylphosphatidylcholin, DOPC) auf 1 ml Chloroform in dem Fläschchen auf 1 mg / ml Konzentration zu erhalten. Führen Sie dieses Verfahren in einem Abzug für die Sicherheit. Verwenden Sie niedrigere oder höhere Konzentrationen von Phospholipid-Lösung, falls erforderlich. </li><li> Farbstoff hinzuzufügen markierte Phospholipide (beispielsweise Rhodamin Dipalmitoylphosphatidylethanolamin, Rhodamin DPPE) mit weniger als 1 Mol-% des Phospholipids solution, um die Phospholipidschicht mit einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar zu machen. Führen Sie dieses Verfahren in einem Abzug für die Sicherheit. </li><li> Wickeln Sie das Fläschchen mit einem Polytetrafluorethylen-Band auf Lösungsmittelverdampfung zu verhindern, und lagern Sie die Probe in einem Gefrierschrank bei -20 ° C. </li></ol></li><li> Abscheidung von Phospholipiden auf die Luft-Wasser-Grenz <ol><li> Reinigen einer Petrischale (55 mm Durchmesser und 12 mm Höhe) mit Ethanol und entionisiertem Wasser mindestens dreimal. </li><li> Füllen Sie die Petrischale mit 10 ml VE-Wasser, um ein Luft-Wasser-Grenzfläche zu schaffen. </li><li> Verteilt einige Mikroliter der Phospholipid-Lösung mit einer Mikrospritze auf ein sauberes Schnittstelle, um die gewünschte Flächenpressung zu erreichen, und eine Wartezeit von 30 min vollständig vor tut das Experiment verdampfe das Lösungsmittel. Hinweis: Ein Langmuir-Trog kann anstelle einer Petrischale verwendet werden, wenn eine genaue Steuerung der Oberflächendruck erforderlich ist. </li></ol></li></ol></li><li> Sun-Schnittstelle Druckmessung <ol><li> Messen Sie die Oberflächendruck des Phospholipid-Monoschicht mit einer Wilhelmy-Platte Tensiometer. Warten Sie mindestens 30 Minuten zu bekommen, das Filterpapier benetzt genug, wenn Filterpapier wird als ein Wilhelmy-Platte verwendet. Die ausführliche Protokoll ist in Kuhn et al. 20. </li><li> Einstellen der abgeschiedenen Menge des Phospholipid um den Oberflächendruck genau zu steuern. In 4 ul der DOPC-Lösung (1 mg / ml) auf die 30,25 cm 2 -Bereich der Schnittstelle, wenn ~ 5 mN / m der Oberflächendruck erforderlich ist. Hinweis: Wenn das Filterpapier nicht vollständig benetzt werden, ändert Oberflächendruck drastisch während der ersten 30 min des Versuchs aufgrund der Gewichtsänderung des Filterpapiers. </li></ol></li><li> Minimierung der Konvektionsströmung der Mono <ol><li> Verwenden Sie eine kegelförmige Vorrichtung, die eine 3 mm Reservoir mit zwei dünnen Kanälen enthält, zu einem großen Teil von der Petrischale verbunden ist, um die konvektive Strömung des zu unterdrückendie Monoschicht, die Morphologie Bildgebung und Oberflächendruckmessung stören können. </li><li> Achten Sie darauf, die Wasserstände zwischen der Innen- und Außenseite der Kegelform Gerät entsprechen, um sicherzustellen, dass Phospholipide frei bewegen über den gesamten Bereich vor dem Abscheiden Phospholipide auf die Luft-Wasser-Grenzfläche. </li></ol></li></ol> 2. Herstellung von Phospholipid-Monoschicht an der gekrümmten Oberfläche eines Tropfens <ol><li> Verjüngende Prozess einer Glaskapillare mit Mikropipettenzieher <ol><li> Legen Sie eine Glaskapillare (od 1 mm, ID 0,78 mm, Länge 100 mm) auf einem Kapillarhalter einer Mikropipette Abzieher. </li><li> Entwerfen Sie ein Programm zum Ziehen der Kapillaren mit entsprechenden Parameterwerte (Heat: Rampe, Ziehen: 60, Vel: 70 Verzögerung: 70 und Druck 200) und die Kapillaren mit dem konzipiertes Programm nach Herstellerprotokoll zu ziehen. Anmerkung: Eine Kapillare Ende mit einigen Mikrometern Durchmesser ist erforderlich, um eine 100 &amp; mgr; m-Tröpfchen durch appl bildenying einen Druck mit ~ 10 kPa. Wenn das Spitzenende der Kapillare zu gering ist, viel höheren Druck,&gt; 600 kPa, ist erforderlich, um den Tropfen zu erhalten, während es schwierig ist, die Größe der Tröpfchen mit einem zu großen Kapillarspitze Ende zu steuern. </li></ol></li><li> Absorption von Phospholipiden auf der Tröpfchenoberfläche Hinweis: Um eine Phospholipidschicht an der gekrümmten Schnittstelle eines Tröpfchens bilden, ein Phospholipid-Lösung ohne Farbstoff markierte Phospholipide verwendet, um einen Intensitätskontrast zu erhalten, gegen die flache Monoschicht nach Verfahren 1 hergestellt Zusätzlich beide Verfahren 2.2.1 und 2.2 0,2 sind hier zulässig. Wenn eine präzise Steuerung der Oberflächendruck an der Tropfenoberfläche notwendig ist, wird Verfahren 2.2.2 sehr zu empfehlen. Aber wenn nicht, Verfahren 2.2.1, die eine viel einfachere Weise als Verfahren 2.2.2, ist nützlich. <ol><li> Beschichtungsverfahren von Phospholipiden an einem Spitzenende <ol><li> Reinigen einer Glasobjektträger unter Verwendung von Aceton, Ethanol und entionisiertem Wasser mindestens dreimal. </li><li> Place den sich verjüngenden Kapillare auf einem gereinigten Glasobjektträger, und kippen Sie die Kapillare zur Erleichterung der Berührung der Glasobjektträger mit einem spitzen Ende. </li><li> Fallen einige Tröpfchen von Phospholipid-Lösung (1 mg / ml) auf die Spitze einer Kapillare, die auf dem Glasträger mit einer Glasspritze angeklebt ist, und warten mindestens 30 min vollständig verdampfen des Lösungsmittels. HINWEIS: Es wird empfohlen, die Spitze der Kapillare auf den Objektträger während des Verfahrens 2.2.1.3 haften, da der Umfang des Spitzenende zu klein ist, um das Tröpfchen der Phospholipide an der Endspitze nur durch Kapillarkraft zu halten. </li></ol></li><li> Herstellung eines Vesikellösung <ol><li> Reinigen Sie ein Fläschchen, und Wasser zu entfernen aus dem Fläschchen, wie in Verfahren 1.1.1.1 eingeführt. </li><li> Trocknen Sie eine 2 ml Volumen von Phospholipid-Lösung (1 mg / ml), indem Stickstoffgas sanft und trocknet das Fläschchen für 1 h bei RT zu beseitigen alle verbleibenden Lösungsmittels. Führen Sie dieses Verfahren in einem Abzug für die Sicherheit. </li><li> In 2ml VE-Wasser in das Fläschchen mit getrockneten Lipide, und Inkubation das Fläschchen in einem Ofen bei 60 ° C für 1 Stunde. </li><li> Schütteln Sie die Ampulle mehrmals, und beschallen (HF-Frequenz: Bis zu 40 kHz, Leistung: 370 W) für 30 Minuten, um Vesikel zu erhalten. </li><li> Zuführen Extrusion und Gefrier-Auftau-Prozesse, um monodisperse unilamellare Vesikel zu erhalten. Die ausführliche Protokoll zur Herstellung von Vesikeln in Mayer et al. 21 beschrieben. Anmerkung: Oberflächendruck der Tröpfchengrenzfläche genau durch Einstellen der Wartezeit nach der Bildung der Tröpfchen, das monodisperse unilamellare Vesikel enthält gesteuert. Verwendung einer Pendant Drop Methode 22, ist es notwendig, die Änderung des Oberflächendrucks nach der Zeit vor tut das Experiment zu messen. </li></ol></li></ol></li><li> Bildung eines Tröpfchens, das eine Phospholipidschicht an der gekrümmten Oberfläche enthält <ol><li> Füllen Sie das verjüngende Kapillare mit 10 ul entionisiertem Wasser aus procedure 2.2.1. Alternativ können Sie 10 ul der Vesikel-Lösung von Verfahren 2.2.2. </li><li> Verbinden die Kapillare an einem automatisierten Mikro Injektor, um den Druck, um das Tröpfchen zu bilden. </li><li> Halterung der Kapillare, die zu einem Mikro Injektor mit einem Mikromanipulator verbunden ist, um die Position der Kapillare genau zu steuern. </li><li> Bereiten Sie eine Hellfeld-Mikroskop (Mikroskop 1, Objektiv: 10x NA 0,3) zur Abbildung der Seitenansicht der Kapillare mit einer CCD-Kamera. Mikroskop 1 ermöglicht somit die exakte Position des Tröpfchens entlang der z-Achse zu beobachten war und die Größe der Tröpfchen. </li><li> Bewegen das Spitzenende zu einer Position, wo die Seitenansicht des vorderen Endes wird auch durch ein Mikroskop 1 visualisiert mit einem Mikromanipulator, und Anwendung einer variablen Druck (~ 100 hPa) mit dem Spitzenende der Kapillare, bis eine geeignete Größe (~ 100 &amp; mgr; m im Durchmesser) von Tröpfchen gebildet. Hinweis: Es wird empfohlen, automatisierte Mikro-Injektor und Mikromanipulator Nutzen seind, wenn eine Feinsteuerung der Tröpfchengröße und Ort des Tropfens erforderlich. Es ist auch möglich, eine manuelle Platte verwenden. </li></ol></li></ol> 3. Imaging Fluorescence Recovery After Droplet Merging Anmerkung: Die Grundprinzipien dieses Protokoll sind identisch zu denen des FRAP-Technik, mit Ausnahme der Tropfenkoaleszenz Prozess. Die detaillierten Protokoll und verwandte Theorien der FRAP sind in A. Lopez et al. 15 und D. Axelrod et al. 16. <ol><li> Überwachen und Steuern der Position des Tröpfchens <ol><li> Bereiten Sie ein inverses Mikroskop gesetzt (Mikroskop 2, Objektiv: 10x NA 0,3, Rohr Linse: Brennweite 17 cm), die sowohl eine Fluoreszenzmikroskop ermöglicht mit einer geeigneten Filtersatz für Rhodamin-DPPES (Anregung bei 560 nm, Emission bei 583 nm) und eine Hellfeld-Mikroskop. Verwenden Sie eine CCD-Kamera hier zur Visualisierung der Draufsichten auf die Tröpfchen mit einem Fluoreszenzmikroskop mOde und eine Hellfeld-Mikroskop-Modus. </li><li> Bewegen des Tröpfchens mit einem Phospholipid mit einem flachen Luft Wasser-Grenzfläche entlang der Z-Achse überzogen, aber noch nicht das Tröpfchen verschmelzen unter Verwendung des Mikromanipulators. Verwenden Mikroskop 1 die Seitenansicht des Tröpfchens zu visualisieren. </li><li> Lokalisieren das Tröpfchen in der Mitte in der Draufsicht des flachen Monoschicht unter Verwendung des Mikromanipulators. Verwenden Sie das Hellfeld-Mikroskop-Modus des Mikroskop 2 zur Draufsicht auf flachen Monolage zu visualisieren. </li></ol></li><li> Zusammenführung der Tröpfchen auf die flache Luft-Wasser-Grenzfläche <ol><li> Bewegen Sie den Tröpfchen weiter in Richtung der flachen Schnittstelle, bis der Tropfen geht auf die Schnittstelle, mit der Mikromanipulator. Wenn die Zusammenführungsprozess erfolgreich war, ein dunkler Bereich mit einer Kreisform, die durch einen weißen Hintergrund umgeben ist, wird unter Verwendung des Fluoreszenzmodus des Mikroskops 2 beobachtet. </li><li> Notieren Sie sich die Reihe von Fluoreszenzbilder nach Zeit nach der Zusammenführung der Tröpfchen unter Verwendung der Fluoreszenz-Modus des Microsbewältigen 2. Verwenden Sie eine schnellere Bildrate als die Diffusionszeitskala der Monoschicht hier. In DOPC-Monoschicht, dauert es ein paar Minuten, um in die 200 &amp; mgr; m-Dunkel-Bereich vollständig diffundieren. </li></ol></li></ol> 4. Bestimmung der Diffusionskoeffizient durch Bildanalyse Hinweis: Um aus einer Reihe von Bildern zu bestimmen, der Diffusionskoeffizient, individuelles Programm zur Bildanalyse aufgebaut wie unten beschrieben. Eine detaillierte Quellcode dieses Programms ist in JoVE Website. <ol><li> Nachweis von einem kreisförmigen Bereich von Interesse <ol><li> Detektion der Mitte der Region von Interesse <ol><li> Besorgen Sie sich eine Reihe von Fluoreszenzbilder, die während eines Wiederherstellungsprozesses, der einen kreisförmigen dunklen Bereich und einem weißen Hintergrund enthält aufgezeichnet worden sind, und legen Sie das erste Bild der Serie als ein Referenzbild. Hier ist R D der Radius des dunklen Bereich in einem Bezugsbild. </li><li> Konvolut das Referenzbild mit einem weißen Kreis, diese Intensität gleichförmig über eine ganze Region. Verwenden Sie eingebettete Funktion namens &#39;CONV2&#39; für die Faltung, wie in der Quellcode der maßgeschneiderte Programmzeile 124. Hier gezeigt wird, ist der Radius des weißen Kreises etwas kleiner als R D. </li><li> Finden Sie eine Position, die einen Minimalwert in der Faltungsberechnung zeigt, und setzen Sie diese Position als Zentrum der Region von Interesse in dem Referenzbild. </li></ol></li><li> Bestimmen eines Radius der Region von Interesse <ol><li> Konvolut das Referenzbild mit einem weißen Kreis, die eine Mittelstellung, nach einem Verfahren 4.1 und gleichmäßige Intensität über eine ganze Region ermittelt enthält. Hier ist R S der Radius des weißen Kreises. Verwenden Iteration wie &#39;for&#39; oder &#39;while&#39; mit Gleichung eines Kreises um den weißen Kreis, wie in den Quellcode des Anwenderprogrammzeile 102 bis 109 dargestellt werden. </li><li> Konvolut das Referenzbild mit einem anderen weißen Kreis, die eine etwas hatgrößeren Radius (5% -10%), R L, als R S. Verwenden Sie dieselbe Methode mit Verfahren 4.1.2.1, um den Kreis, wie in der Quellcode der maßgeschneiderte Programmzeile 113 bis 120 dargestellt werden. </li><li> Besorgen Sie sich die Wertdifferenz zwischen den beiden Faltungsberechnungen 4.1.2.1 und 4.1.2.2. </li><li> Wiederholen der vorstehenden Verfahren von R S = R D / 2 R S = 2R D, durch Erhöhung sowohl der R S und R L mit einem Pixel-Ebene. Stellen Sie eine Iteration, die gesamten Quellcodes von Verfahren 4.1.2.1 enthält, um 4.1.2.3 zu wiederholen. </li><li> Finden Sie den Radius R S, die die maximale Wertunterschied zwischen den beiden Faltungsberechnungen zeigt. Verwenden Sie eingebettete Funktion mit dem Namen &#39;max&#39;, um den Radius zu finden gibt die maximale Differenz der Werte wie in den Quellcode des Anwenderprogrammzeile 148 bis 149. gezeigt Diese Rs zeigt somit an den Radius des dunklen Bereich in dem Referenzbild. </li></ol></li&gt; </ol></li><li> Berechnung einer Bruchstärke <ol><li> Legen Sie einen Kreis, der eine Mittelposition und einen Radius von 4,1 Verfahren als eine Region von Interesse bestimmt, enthält. </li><li> Berechnen der durchschnittlichen Intensität der dem interessierenden Bereich in einer Reihe von Fluoreszenzbildern nach der Zeit. Convolute jedes Rahmens mit dem Bereich von Interesse und teile es durch Fläche des Bereichs von Interesse, den mittleren Intensitäts berechnen. Die Einzelheiten sind in den Quellcode des Anwenderprogramms, die in JoVE Website ist. </li><li> Berechnen eines Bruchintensität, definiert als die nachstehende Gleichung, wobei F (t) ist die mittlere Intensität im Kreis, der einen interessierenden Bereich nach der Zeit, M i der Ausgangsintensität in dem Kreis und F o die Intensität einen weißen Hintergrund. f (t) = (F (t) - F i) / (F o - F i) (Gleichung 1). </li></ol></li><li> Einbau der fractional Intensität FRAP Theorie <ol><li> Den Bruch Intensität, mit der folgenden Gleichung, wo τ ist eine charakteristische Diffusionszeit und I 0, I 1 sind Besselfunktionen modifiziert, mit einem passenden Programm und erhalten τ <img alt="Gleichung 2" src="/files/ftp_upload/53376/53376eq2.jpg" /> (Gleichung 2). </li><li> Erhalten einen Diffusionskoeffizienten basierend auf der Beziehung, τ = eine 2/4 D, wobei D der Diffusionskoeffizient und a der Radius des dunklen Bereich. Anmerkung: Während des Anpassungsprozesses, ist es möglich, den Bruchintensitätsprofil entlang einer Zeitachse zu verschieben, wenn der Wiederherstellungsvorgang bereits begonnen hat, vor dem Aufzeichnen der Bilder. </li></ol></li></ol>

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The authors declare no competing financial interest.

FRAM teilt eine Menge von grundlegenden Prinzipien mit FRAP, vor allem für die Messung der Fluoreszenz Erholung nach dem Bleichen einen bestimmten Bereich, aber FRAM verwendet einen Prozess der Zusammenführung ein Tröpfchen auf die flache Schnittstelle, einen gebleichten Bereich zu bilden, anstelle der Anwendung ein intensives Licht. Der Zusammenführungsprozess ist somit wichtigste Schritt im FRAM und vor allem die Form der dunklen Fleck auf dem flachen Monoschicht nach dem Zusammenführen eines Tröpfchens bestimmt die Genauigkeit der Diffusionsmessung. Insbesondere auf der Grundlage einer aktuellen Methode, wir nur den Kreis mit einem Radius R festgelegt als ein Bereich von Interesse, um die durchschnittliche Intensität der dunklen Fleck, in Verfahren 4 gezeigt zu berechnen, und wenn es eine zu starke Abweichung von der Kreisform, dies würde die genaue Messung des Diffusionskoeffizienten stören. Daher ist es notwendig, einen kreisförmigen dunklen Bereich zu erhalten, aber nicht kreisförmigen Formen werden manchmal aus verschiedenen Gründen gebildet. Erstens, wenn es eine konvektive Strömung in dem Haustierri Schale wird die Form des dunklen Bereichs entlang der Strömungsrichtung langgestreckt ist. Wie in Verfahren 1.3 erwähnt, hilft eine Kegelform Gerät, um die konvektive Strömung zu unterdrücken, und diese Dehnung minimiert werden würde. Zweitens, wenn das Spitzenende der Kapillare die flache Schnittstelle während eines Zusammenführungsprozess berührt, der dunkle Bereich ist mit einer Vielzahl von Formen gebildet, da die Kapillare Ende der Zusammenführungsprozess unterbricht. Mit dem Erwerb einer Tröpfchen, die nur hängen vom Ende der Kapillare, kann diese Unterbrechung verhindert werden. Insbesondere eine Hydrophobierung der Kapillare unterstützt die Tröpfchen am Ende der Kapillare sitzt. Daher obigen Probleme Schießereien und Modifikationen ermöglichen uns, Diffusionseigenschaften genauer zu messen. Dieses gut Störungsbehebung Verfahren erlaubt somit FRAM, mehrere wesentliche Vorteile gegenüber FRAP haben. Zuerst FRAM erfordert einfachere Geräte im Vergleich zum FRAP. Für FRAM, die ausreicht, um eine einfache Fluoreszenz Mikros benutzen ist esgerecht zu werden, statt eines teuren konfokalen Mikroskop mit einem Hochleistungslaser, dessen Wellenlänge muß mit dem Absorptionsspektrum des Farbstoffes zu treffen. Darüber hinaus ist es notwendig, eine zusätzliche Vorrichtung verwenden, um die Größe auf dem gebleichten Bereich im FRAP einzustellen, während der FRAM steuert die Größe der Fläche, durch Einstellen der Größe der Tröpfchen oder der Oberflächendruck an der Tropfenoberfläche. Zweitens ist es möglich, verschiedene Arten von Farbstoffen in FRAM verwenden. FRAP verwendet nur Farbstoffmoleküle, deren Bleichverfahren ist viel schneller als die Diffusionsprozesses. Wenn während des Bleichprozesses die Diffusion der Farbstoffe auftritt, ist es schwierig, die Diffusionseigenschaft genau zu schätzen. Der FRAM, jedoch nicht ein Verfahren zum Bleichen von Farbstoffen erfordern, und dies ermöglicht somit die Verwendung von verschiedenen Arten von Farbstoffen in der Fluoreszenz-Bildgebungs. Darüber hinaus ist die FRAP erfordert zusätzliche Hochleistungslasern und Filtersätze, um die Farbstoffspezies verändern, während es nur notwendig ist, um die Filtersätze in der FRAM ersetzen. EndlichDa die Monoschichten an der Tropfenoberfläche und der ebenen Schnittstelle kann unabhängig ausgebildet werden, wodurch die Untersuchung von Interdiffusion oder Vermischung zwischen zwei Lipid-Monoschichten durch Zusammenführen A-Typ Monoschicht B-Typ-Monoschicht, während die FRAP misst nur die Selbstdiffusion einer Monoschicht. Trotz dieser Vorteile kann der Prozess der Zusammenführung ein Tröpfchen auf eine flache Luft-Wasser-Grenzfläche diese Technik möglicherweise begrenzen auf mehrere Fragen, die von Bedeutung sein könnten, wie beispielsweise ein Oberflächendruck Missverhältnis zwischen den beiden Monoschichten, die Zeitskala der Zusammenführungsprozess und eine Erhöhung des Oberflächendrucks des flachen Monoschicht nach dem Zusammenführen Tröpfchen. Diese Probleme jedoch nicht signifikant auf die Diffusionsmessung aus den folgenden Gründen. Erstens, auch wenn die Oberflächendrücke an den beiden unterschiedlichen Monoschichten sind sehr unterschiedlich, eine Gleichgewichtseinstellung in einem sehr frühen Stadium bei der Wiederherstellung abgeschlossen ist. Wenn beispielsweise ter Oberflächendruck der Monoschicht an der Tropfenoberfläche ist höher als der der Monoschicht an der flachen Luft-Wasser-Grenzfläche, dehnt der dunkle Bereich, bis der Oberflächendruck ausgleicht. Da dieses Verfahren innerhalb von 10 ms beendet ist, wird der Oberflächendruck equilibriert, bevor es beeinflusst die Diffusion. Zweitens, wenn der Zeitmaßstab der Zusammenführungsprozess schnell genug ist, es nicht die Diffusionsmessung begrenzen überhaupt. Glücklicherweise ist eine typische Zusammenführungsprozess auch innerhalb von 10 ms abgeschlossen. Schließlich ist sogar mehrere Verschmelzen der Tröpfchen auf die flache Grenzfläche nicht den Oberflächendruck, da die Oberfläche des Trogs erhöht wesentlich größer ist als die Oberfläche des Tropfens. Entsprechend den Größen der Mulde und die Tröpfchen in dem Protokoll beschrieben, ist die Fläche pro Molekül erhöht weniger als 0,015% durch Zusammenführen eines Tröpfchens. Dementsprechend ist die Erhöhung der Oberflächendruck aufgrund der Änderung der Fläche pro Molekül weniger als 0,1%, das ist negligible weil sie viel kleiner als die typischen Fehler im Oberflächendruck, wie von Wilhelmy-Platten-Tensiometers gemessen. Zusammenfassend haben wir eine neue Methode, um die laterale Diffusion Eigenschaft eines Phospholipid-Monoschicht durch die Zusammenlegung eines Tröpfchens Monoschicht auf der flachen Schnittstelle zu messen. Diese Technik erfordert eine relativ einfache Ausrüstung und ermöglicht auch die Verwendung von verschiedenen Arten von Farbstoffspezies. Der FRAM ist daher potentiell geeignet für Diffusions Messung einer oberflächenaktiven Mitteln, einschließlich Phospholipide, Blockcopolymere, Proteine ​​und auch Nanopartikel in einem Flüssig-Flüssig-Grenzfläche. Darüber hinaus erwarten wir, dass die FRAM bietet einen neuen Weg, um die Interdiffusion oder Vermischung zwischen zwei verschiedenen oberflächenaktiven Mittel zu untersuchen.

<html> Phospholipide sind wichtige Bestandteile der Zellmembranen und die Membranen von Organellen, und die Fließfähigkeit dieser Membranschichten oft auf Zellfunktionen durch Veränderung der Aktivität von Membranproteinen 1-3. B. Membran &#160; Lipidhomöostase durch Regulieren Membranfluidität, die von Membranproteinen detektiert wird erreicht, und ein ungewöhnlich hohes Fließvermögen verursacht schwere Krankheiten, wie Fettleber und Cholestase 4. Zusätzlich Fluidität einer Phospholipidschicht an der Luft-Fluid-Grenzfläche Alveolen hat wichtige Auswirkungen auf seine Funktionen. Hohe Fluidität des Lungensurfactant Phospholipidschicht erleichtert Ausbreiten der Schicht während der Inhalation, während eine geringe Fließfähigkeit ermöglicht die Schicht in den Alveolen während der Ausatmung 5,6 bleiben. Es ist daher wichtig, die Fließfähigkeit der Phospholipidschichten abzuschätzen, ihre Rollen zu verstehen. _content &quot;&gt; ein direktes Maß für die Fließfähigkeit ist, die Viskosität und die Viskosität der Phospholipidschichten wurde durch die Verwendung von Mikrometergröße Kolloide 7, magnetische Nadeln 8,9 und magnetische Mikrotasten 6,10,11 gemessen. Diese Techniken sind relativ steifen Folien begrenzt und kann nicht weniger viskose Filmen zu messen. In solchen Fällen wäre Diffusivität eine Alternative zur Fluidität Phospholipidschichten quantifizieren. Seit mehreren Jahrzehnten wurden eine Vielzahl von Techniken, um die Diffusionseigenschaften der Phospholipidschichten messen entwickelt, wie Fluoreszenz Abschreckverfahren 12, gepulster Feldgradient NMR 13 und die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) 14. Eine der repräsentativen Methoden fluorescence recovery after photo (FRAP) 15,16. Aufgrund der Einfachheit des Messverfahrens und der damit verbundenen Theorien, mehrere Studien über die Diffusionseigenschaften Phospholipidschichten wurden durchgeführt unter Verwendung FRAP <sup&gt; 17-19. Allerdings FRAP erfordert in der Regel eine teure konfokalen Mikroskop Setup mit einem Hochleistungslaser. Hier präsentieren wir eine neue Technik, um die laterale Diffusion von Phospholipid-Monoschichten, als Fluoreszenz bezeichnet Erholung nach der Zusammenführung (FRAM) zu messen. Der wesentliche Unterschied zwischen FRAP und FRAM ist, dass die Photobleichschritt wird durch das Zusammenwachsen von Tropfen ersetzt. Zusammenführen eines Tröpfchens durch nicht-Fluoreszenz-Monoschicht abgedeckt auf eine fluoreszenzmarkierte flache Monoschicht hinterlässt einen kreisförmigen dunklen Fleck auf einem hellen flachen Monoschicht, wodurch die Einrichtung des gleichen Anfangszustand mit dem Photobleichschritt. Wir beobachten dann die Fluoreszenz-Erholung in den dunklen Fleck mit der Zeit, um die laterale Diffusionsfähigkeit zu messen. Diese neue &quot;Bleichen&quot; Schritt Tropfenkoaleszenz bietet erhebliche Vorteile gegenüber FRAP: FRAM erfordert nur eine Fluoreszenzmikroskop anstatt eines teuren konfokalen Mikroskop mit einem Hochleistungslaser, die für FRAP notwendig ist. ichn Darüber hinaus hat FRAM eine breite Auswahl von Fluoreszenzfarbstoffen, da sie nicht die Photobleichprozess einzubeziehen. Schließlich können die zwei unterschiedlichen Monoschichten ein Tröpfchen Monoschicht und einer flachen Monoschicht können unabhängig hergestellt werden, so dass die Interdiffusion zu messen, wobei FRAP misst nur die Selbstdiffusion von Monoschichten. FRAM bietet eine breite Palette von Diffusionsmessungen von hochviskosen Materialien auf nahezu reibungsfreie Materialien. Prinzipiell kann FRAM die maximale Diffusionsvermögen von 10 6 &amp; mgr; m 2 / sec, die vergleichbar ist mit existierenden Techniken zu messen, wenn die Diffusion während der Zeit für den Abfall Koaleszenzprozeß (~ 10 ms), tritt über die Fläche 100 um 100 um. Darüber hinaus kann langsamen Diffusionsprozesses leicht gemessen werden, es sei denn Monoschichten sind fest. FRAM kann für beliebige Arten von oberflächenaktiven Materialien, solange geeignete fluoreszenzmarkierten Molekülen zur Verfügung stehen werden.

<table><tbody><tr><td>Acetone</td><td>OCI corporation</td><td>Acetone 3.8L Extra Pure</td><td>Purity: &amp;ge; 99.5%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use.</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>OCI corporation</td><td>Ethanol 3.8L Extra Pure</td><td>Purity: &amp;ge; 94%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use.</td></tr><tr><td>Dioleoylphosphatidylcholine, DOPC</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375C</td><td>Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. Chloroform is carcinogenic.</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>LiChrosolv</td><td>Chloroform ultrapure (A3633)</td><td>Purity: &amp;ge; 99.8%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. Carcinogenic</td></tr><tr><td>Rhodamine DPPE</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810158C, 810158P</td><td>Avoid direct light exposure to prevent photobleaching</td></tr><tr><td>Wilhelmy plate tensiometer</td><td>R&amp;amp;K ultrathin organic film technology</td><td>Wilhelmy tensiometer</td><td>http://www.rieglerkirstein.de/index.htm</td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Sutter instrument</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Micro-injector</td><td>Eppendorf</td><td>Femtojet</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Eppendorf</td><td>Micromanipulator 5171</td><td></td></tr><tr><td>Microscope 1</td><td>Objective lens: Olympus</td><td>Objective lens: UPlanFl 10x</td><td>Objective lens: 10X NA 0.3</td></tr><tr><td>Microscope 2</td><td>Objective lens: Olympus, Tube lens: Thorlabs</td><td>Objective lens: UPlanFl 10x</td><td>Objective lens: 10X NA 0.3, tube lens: focal length 17 cm</td></tr><tr><td>CCD for Microscope 1</td><td>Jai</td><td>CV 950 camera</td><td></td></tr><tr><td>CCD for Microscope 2</td><td>Andor</td><td>iXon3 EMCCD</td><td></td></tr><tr><td>Filter set</td><td>Chroma technology</td><td>Catalog Set 49004: ET545, T565, ET605</td><td>Prepare suitable for dye molecules</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>DAIHAN Scientific</td><td>Wiseclean WUC-D06H</td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescence recovery after merging a droplet to measure the two-dimensional diffusion of a phospholipid monolayer

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after merging (FRAM). FRAM adopts the same principles as the fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) technique, especially for measuring fluorescence recovery after bleaching a specific area, but FRAM uses a drop coalescence instead of photobleaching dye molecules to induce a chemical potential gradient of dye molecules. Our technique has several advantages over FRAP: it only requires a fluorescence microscope rather than a confocal microscope equipped with high power lasers; it is essentially free from the selection of fluorescence dyes; and it has far more freedom to define the measured diffusion area. Furthermore, FRAM potentially provides a route for studying the mixing or inter-diffusion of two different surfactants, when the monolayers at a surface of droplet and at a flat air/water interface are prepared with different species, independently.

Eine Serie von Fluoreszenzbilder wurden mit der Zeit während der Wiederherstellung nach dem Zusammenführen ein Tröpfchen mit einer DOPC Monoschicht beschichtet auf eine flache DOPC Monoschicht erhalten wurde, wie in Figur 1 aufgeführt. Die DOPC Monoschicht an der flachen Luft-Wasser-Grenzfläche wurde mit geringen Mengen von dotiertem Rhodamin-DPPE und dieses somit wurde es möglich, einen Hintergrund mit einer hellen Farbe und einem dunklen Bereich neu an das flache Schnittstelle hinzugefügt visualisieren. Es wurde ein Recovery-Prozess auf 23 mN / m fester Oberflächendrucks beobachtet. Eine Anpassung von Gleichung 1, um die Änderung der Bruchintensität nach der Zeit ist in Abbildung 2 dargestellt. Der R 2 -Wert von diesem Sitz ist 0,999 und dieser Sitz noch funktioniert gut, auch bei niedrigeren oder höheren Flächenpressungen. Der Diffusionskoeffizient der DOPC-Monoschicht auf dieser fit betrug 27,54 &amp; mgr; m 2 / s bei 23 mN / m Oberflächendruck. Zur weiteren Validierung des FRAM, Diffusionskoeffizienten des DOPC und Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) Monolayer wurden nach Oberflächendruck gemessen. Wie in 3 gezeigt ist, erfasst FRAM die rasche Abnahme der Diffusionskoeffizient des DPPC-Monoschicht auf ~ 9 mN / m Oberflächendruck, wobei eine LC (Flüssigkeit kondensiert) - LE (flüssig expandiert) Phasenübergang 10, und die Werte von Diffusionskoeffizienten sind ebenfalls gut mit den zuvor Messungen durch Peters et al. 19 vereinbart. Zusätzlich wurde ein exponentielles Abklingen des Diffusionskoeffizienten der Oberflächendruck in der DOPC Monoschicht beobachtet wird, und diese Tendenz ist nahezu identisch mit dem von Caruso et al. 12 gemessen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53376/53376fig1.jpg" /> Abbildung 1. (A) Schematische Darstellung des FRAM (Fluoreszenz-Erholung nach dem Zusammenführen) -Technik. Wie der Lippeid Monoschicht beschichtet Tröpfchen auf flache Luft-Wasser-Grenzfläche zusammengeführt, die Lipidmonoschicht ohne Fluoreszenz-markierten Lipid in flachen Leuchtstofflipidmonoschicht eingelegt. (B) Fluoreszenzmikroskop Bilder mit der Zeit bei der Wiederherstellung einer DOPC-Monoschicht auf 23 mN / m der Oberflächendruck (Maßstab = 100 &amp; mgr; m). Der dunkle Bereich des DOPC-Monoschicht vollständig durch den Diffusionsprozess innerhalb weniger Minuten wiederhergestellt. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53376/53376fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53376/53376fig2.jpg" /> Abbildung 2. Fractional Intensität als Funktion der Zeit. Schwarze Kreise und die graue gestrichelte Linie zeigen die Werte für Spitzenintensitäten von Bildanalyse (Verfahren 4.1 und 4.2) und die Anpassung von Gleichung 1 zu den Bruch Intensitäten mit der Zeit erhalten wird,in Verfahren 4.3 gezeigt. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53376/53376fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53376/53376fig3.jpg" /> Abbildung 3. Diffusionskoeffizienten von DOPC (Dreieck) und DPPC (leeres Quadrat) Monoschichten als Funktion der Flächenpressung. Die Leitungen mit dem hellen grauen Farbe und mit der dunkelgrauen Farbe geben die Werte des Diffusionskoeffizienten zuvor von Peters et al. und Caruso et al., auf. Diese Zahl wurde von Jeong et al. 23 geändert. Mit freundlicher Genehmigung von Jeong et al. Langmuir. 30 (48), 14.369-14.374 nachgedruckt. Copyright 2014 American Chemical Society. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53376/53376fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a>e, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.

Fluorescence Recovery nach der Zusammenführung ein Droplet, um die zweidimensionale Diffusion eines Phospholipidschicht Messen

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Serie: Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

Eine Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie Assay von Protein-Protein-Wechselwirkungen an den Zell-Zell-Kontakten

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Forschung

Biochemie

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

Laterale Diffusion und Exozytose von Membranproteinen in kultivierten Neuronen Veranlagte mit Fluorescence Recovery-und Fluoreszenz-Verlust Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Neurowissenschaften

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

Von Fast Fluoreszenz-Imaging, um molekulare Diffusion Gesetz über Live Cell Membrane in einem kommerziellen Mikroskop

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Biotechnik

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

Einzelmolekülfluoreszenzmikroskopie auf Planar Unterstützte Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found to represent a novel lipid transfer protein (LTP) group in yeast and human cells. They transfer phosphatidylserine (PS) from the endoplasmic reticulum (ER) to the plasma membrane (PM) via PS/phosphatidylinositol 4-phosphate (PI(4)P) exchange cycles. This finding allows a better understanding of how PS, which is critical for signaling processes, is distributed throughout the cell and the investigation of the link between this process and phosphoinositide (PIP) metabolism. The development of new fluorescence-based protocols has been instrumental in the discovery and characterization of this new cellular mechanism in vitro at the molecular level. This paper describes the production and the use of two fluorescently labelled lipid sensors, NBD-C2Lact and NBD-PHFAPP, to measure the ability of a protein to extract PS or PI(4)P and to transfer these lipids between artificial membranes. First, the protocol describes how to produce, label, and obtain high-purity samples of these two constructs. Secondly, this paper explains how to use these sensors with a fluorescence microplate reader to determine whether a protein can extract PS or PI(4)P from liposomes, using Osh6p as a case study. Finally, this protocol shows how to accurately measure the kinetics of PS/PI(4)P exchange between liposomes of defined lipid composition and to determine lipid transfer rates by fluorescence resonance energy transfer (FRET) using a standard fluorometer.

Here, we describe protocols using fluorescent lipid sensors and liposomes to determine whether a protein extracts and transports phosphatidylserine or phosphatidylinositol 4-phosphate in vitro.

Fluoreszenzbasierte Messungen des Phosphatidylserin/Phosphatidylinositol-4-Phosphat-Austauschs zwischen Membranen

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found ...

Measuring Diffusion Coefficients via Two-photon Fluorescence Recovery After Photobleaching

Multi-fluorescence recovery after photobleaching is a microscopy technique used to measure the diffusion coefficient (or analogous transport parameters) of macromolecules, and can be applied to both in vitro and in vivo biological systems. Multi-fluorescence recovery after photobleaching is performed by photobleaching a region of interest within a fluorescent sample using an intense laser flash, then attenuating the beam and monitoring the fluorescence as still-fluorescent molecules from outside the region of interest diffuse in to replace the photobleached molecules. We will begin our demonstration by aligning the laser beam through the Pockels Cell (laser modulator) and along the optical path through the laser scan box and objective lens to the sample. For simplicity, we will use a sample of aqueous fluorescent dye. We will then determine the proper experimental parameters for our sample including, monitor and bleaching powers, bleach duration, bin widths (for photon counting), and fluorescence recovery time. Next, we will describe the procedure for taking recovery curves, a process that can be largely automated via LabVIEW (National Instruments, Austin, TX) for enhanced throughput. Finally, the diffusion coefficient is determined by fitting the recovery data to the appropriate mathematical model using a least-squares fitting algorithm, readily programmable using software such as MATLAB (The Mathworks, Natick, MA).

In this article we will describe the procedure for measuring diffusion coefficients using multi-photon fluorescence recovery after photobleaching. We will begin by aligning the laser along the optical path to the sample and determining the proper experimental parameters, then continue generating and finally fitting fluorescence recovery curves.

Mess-Diffusionskoeffizienten über Zwei-Photonen-Fluorescence Recovery After Photobleaching

Multi-fluorescence recovery after photobleaching is a microscopy technique used to measure the diffusion coefficient (or analogous transport parameters) ...

Biologie

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological studies. In the past years, it has become increasingly clear that living cells respond, not only to the biochemical nature of the molecules presented to them but also to the way these molecules are presented. Creating protein micro-patterns is therefore now standard in many biology laboratories; nano-patterns are also more accessible. However, in the context of cell-cell interactions, there is a need to pattern not only proteins but also lipid bilayers. Such dual proteo-lipidic patterning has so far not been easily accessible. We offer a facile technique to create protein nano-dots supported on glass and propose a method to backfill the inter-dot space with a supported lipid bilayer (SLB). From photo-bleaching of tracer fluorescent lipids included in the SLB, we demonstrate that the bilayer exhibits considerable in-plane fluidity. Functionalizing the protein dots with fluorescent groups allows us to image them and to show that they are ordered in a regular hexagonal lattice. The typical dot size is about 800 nm and the spacing demonstrated here is 2 microns. These substrates are expected to serve as useful platforms for cell adhesion, migration and mechano-sensing studies.

We present a protocol to functionalize glass with nanometric protein patches surrounded by a fluid lipid bilayer. These substrates are compatible with advanced optical microscopy and are expected to serve as platform for cell adhesion and migration studies.

Ligand Nano-Cluster-Arrays in einem unterstützten Lipid Bilayer

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific lipid component within a membrane, as in the case of phosphoinositides (PIPs), to ensure specific subcellular localization and/or activation. PIPs and cellular PIP-binding domains have been studied extensively to better understand their role in cellular physiology. We applied a pH modulation assay on supported lipid bilayers (SLBs) as a tool to study protein-PIP interactions. In these studies, pH sensitive ortho-Sulforhodamine B conjugated phosphatidylethanolamine is used to detect protein-PIP interactions. Upon binding of a protein to a PIP-containing membrane surface, the interfacial potential is modulated (i.e. change in local pH), shifting the protonation state of the probe. A case study of the successful usage of the pH modulation assay is presented by using phospholipase C delta1 Pleckstrin Homology (PLC-&#948;1 PH) domain and phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) interaction as an example. The apparent dissociation constant (Kd,app) for this interaction was 0.39 &#177; 0.05 &#181;M, similar to Kd,app values obtained by others. As previously observed, the PLC-&#948;1 PH domain is PI(4,5)P2 specific, shows weaker binding towards phosphatidylinositol 4-phosphate, and no binding to pure phosphatidylcholine SLBs. The PIP-on-a-chip assay is advantageous over traditional PIP-binding assays, including but not limited to low sample volume and no ligand/receptor labeling requirements, the ability to test high- and low-affinity membrane interactions with both small and large molecules, and improved signal to noise ratio. Accordingly, the usage of the PIP-on-a-chip approach will facilitate the elucidation of mechanisms of a wide range of membrane interactions. Furthermore, this method could potentially be used in identifying therapeutics that modulate protein&#39;s capacity to interact with membranes.

Here we present a supported lipid bilayer in the context of a microfluidic platform to study protein-phosphoinositide interactions using a label-free method based on pH modulation.

PIP-on-a-Chip: Eine Label-freie Studie von Protein-Phosphoinositid-Wechselwirkungen

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

High-resolution imaging techniques have shown that many ion channels are not static, but subject to highly dynamic processes, including the transient association of pore-forming and auxiliary subunits, lateral diffusion, and clustering with other proteins. However, the relationship between lateral diffusion and function is poorly understood. To approach this problem, we describe how lateral mobility and activity of individual channels in supported lipid membranes can be monitored and correlated using total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Membranes are fabricated on an ultrathin hydrogel substrate using the droplet interface bilayer (DIB) technique. Compared to other types of model membranes, these membranes have the advantage of being mechanically robust and suitable for highly sensitive analytical techniques. This protocol measures Ca2+ ion flux through single channels by observing the fluorescence emission of a Ca2+-sensitive dye in close proximity to the membrane. In contrast to classical single-molecule tracking approaches, no fluorescent fusion proteins or labels, which can interfere with lateral movement and function in the membrane, are required. Possible changes in ion flux associated with conformational changes of the protein are only due to protein lateral motion in the membrane. Representative results are shown using the mitochondrial protein translocation channel TOM-CC and the bacterial channel OmpF. In contrast to OmpF, the gating of TOM-CC is very sensitive to molecular confinement and the nature of lateral diffusion. Hence, supported droplet-interface bilayers are a powerful tool to characterize the link between lateral diffusion and the function of ion channels.

Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy

This protocol describes how to use TIRF microscopy to track individual ion channels and determine their activity in supported lipid membranes, thereby defining the interplay between lateral membrane movement and channel function. It describes how to prepare the membranes, record the data, and analyze the results.

Einzelmolekül-Bildgebung der lateralen Mobilität und Ionenkanalaktivität in Lipiddoppelschichten mittels Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF)

High-resolution imaging techniques have shown that many ion channels are not static, but subject to highly dynamic processes, including the transient ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial and temporal resolution. FCS can quantify the molecular concentration and diffusion coefficient of fluorescently labeled molecules in the cell membrane. This technique has the ability to explore the molecular diffusion characteristics of molecules in the plasma membrane of immune cells in steady state (i.e., without processes affecting the result during the actual measurement time). FCS is suitable for studying the diffusion of proteins that are expressed at levels typical for most endogenous proteins. Here, a straightforward and robust method to determine the diffusion rate of cell membrane proteins on primary lymphocytes is demonstrated. An effective way to perform measurements on antibody-stained live cells and commonly occurring observations after acquisition are described. The recent advancements in the development of photo-stable fluorescent dyes can be utilized by conjugating the antibodies of interest to appropriate dyes that do not bleach extensively during the measurements. Additionally, this allows for the detection of slowly diffusing entities, which is a common feature of proteins expressed in cell membranes. The analysis procedure to extract molecular concentration and diffusion parameters from the generated autocorrelation curves is highlighted. In summary, a basic protocol for FCS measurements is provided; it can be followed by immunologists with an understanding of confocal microscopy but with no other previous experience of techniques for measuring dynamic parameters, such as molecular diffusion rates.

A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.

Molekulare Diffusion in Plasmamembranen von primären Lymphozyten mittels Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie gemessen

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...