Bu çalışma 2014 için KAIST tarafından finanse edilen K-Vadisi RED &amp; B Projesi ve Temel Bilimler Araştırma Programı Kore Ulusal Araştırma Vakfı aracılığıyla (NRF- 2012R1A6A3A040395 NRF-2013R1A1A2057708, NRF- 2012R1A1A1011023) tarafından desteklenmektedir.

Dikkat: kanserojen aseton ve kloroform Kullanmadan önce Malzeme Güvenlik Bilgi Formları (MSDS) bakın. Düz hava su ara-yüzünde Fosfolipid Monolayer hazırlanması 1. <ol><li> Bir fosfolipid tek tabaka oluşumu <ol><li> Bir fosfolipid çözeltisinin hazırlanması <ol><li> Aseton, etanol ve deiyonize su, en az üç kez kullanarak bir politetrafloroetilen kaplı kap Şişeyi ve su kurtulmak için şişe içine iyice azot gazı darbe ml bir 4 temizleyin. </li><li> Fosfolipidin 1 mg çözülür (örneğin, dioleoilfosfatidilkolin, DOPC) şişe içinde kloroform 1 ml 1 mg / ml konsantrasyon elde edilmiştir. Güvenliği için Davlumbaz bu yordamı gerçekleştirin. Fosfolipid çözeltisinin daha düşük ya da daha yüksek konsantrasyonlarda gerektiğinde kullanın. </li><li> Ekle boya fosfolipidleri etiketli (örneğin, Rodamin dipalmitoilfosfatidiletanolamin, Rodamin DPPE) fosfolipid Solu az 1 mol ile%tion, bir floresan mikroskobu ile fosfolipid tek tabaka görselleştirmek için. Güvenliği için Davlumbaz bu yordamı gerçekleştirin. </li><li> Çözücü buharlaşmasını önlemek için politetrafloroetilen bant ile flakon sarın ve -20 ° C&#39;de bir dondurucuda örnek saklayın. </li></ol></li><li> Hava-su arayüzü üzerine Fosfolipidlerin Biriktirme <ol><li> Petri (çapı 55 mm ve yüksekliği 12 mm) etanol ve deiyonize su, en az üç kez temizleyin. </li><li> Bir hava-su ara yüzeyine oluşturmak için deiyonize su, 10 ml ile Petri doldurun. </li><li> Istenilen yüzey basıncını elde etmek ve önceki deney yapıyor, tamamen çözücü buharlaşması için en az 30 dakika beklemek temiz bir arayüz üzerine mikro şırınga ile fosfolipid çözümün birkaç mikrolitre yayıldı. Not: Langmuir çukur yüzeyi basınç hassas kontrol gerekirse yerine Petri kabı kullanılabilir. </li></ol></li></ol></li><li> Surface basıncı ölçümü <ol><li> Bir Wilhelmy plakası tansiyometre ile fosfolipid tek tabaka yüzey basıncını ölçün. Filtre kağıdı bir Wilhelmy plaka olarak kullanıldığında, filtre kağıdı kadar ıslatılmış almak için en az 30 dakika boyunca bekleyin. Ayrıntılı bir protokol Kuhn ve diğerleri mevcuttur. 20. </li><li> Tam yüzey basıncını kontrol etmek fosfolipid yatırılan miktarını ayarlayın. ~ 5 mN / m bir yüzey basıncı, eğer arayüzün 30,25 cm 2 &#39;lik üzerine DOPC çözeltisi (1 mg / ml) içinde 4 ul ekle gereklidir. Not: Filtre kağıdı tam ıslatılmış değilse, yüzey basıncı nedeniyle filtre kağıdı ağırlık değişimi için deney ilk 30 dakika boyunca büyük ölçüde değişir. </li></ol></li><li> Tek tabakalı konvektif akışının minimizasyonu <ol><li> Petri kabı büyük bir bölümüne bağlı olan iki ince kanalları 3 mm rezervuarı içeren bir koni şeklinde cihazı kullanın, bir konvektif akışını bastırmak içinmorfoloji görüntüleme ve yüzey basıncı ölçümü rahatsız olabilir tek tabakalı. </li><li> Fosfolipidler hava-su arayüzü üzerine fosfolipid biriktirilmesi önce tüm bölge üzerinde serbestçe hareket sağlamak için koni şeklinde aygıtının iç ve dış arasındaki su seviyelerinin maç emin olun. </li></ol></li></ol> Bir Sıvı fazı Eğimli Yüzeyinde Fosfolipid Monolayer 2. Hazırlık <ol><li> Mikropipet çektirmenin kullanarak bir cam kılcal sürecini sivrilen <ol><li> Mikropipet çektirmenin bir kılcal tutucu bir cam kapiler tüp (OD 1 mm id 0,78 mm, uzunluk 100 mm) yerleştirin. </li><li> (: Pull, Rampa: 60, Vel: 70, Gecikme: Isı 70 ve basınç 200) uygun parametre değerleri ile kılcal çekerek tasarımı için bir program ve üreticinin protokolüne göre tasarlanan program ile kılcal çekin. Not: Bir kılcal birkaç mikrometre çapında bir sona Appl ile 100 mikron damlacık oluşturulması için gerekli olan~ 10 kPa olan bir basınç Ying. Kılcal tepe ucu, daha yüksek bir basınç,&gt; 600 kPa çok küçük olduğu takdirde, bir çok su emici ucu ucuna damlacıkların boyutunu kontrol etmek için sabit iken, damlacık elde etmek için gereklidir. </li></ol></li><li> Damlacık yüzeyi üzerine fosfolipidler emilimi Not: Bir damlacık kavisli arayüzünde bir fosfolipid tek tabaka oluşturmak, boya olmadan bir fosfolipid çözüm Ayrıca prosedür 1. tarafından hazırlanan, düz tek tabakalı karşı, bir yoğunluk kontrastı elde etmek için kullanılan her iki usul 2.2.1 ve 2.2 olan fosfolipidler etiketli 0,2 Burada izin verilebilir. Damlacık yüzeyinde yüzey basıncı hassas kontrol gerekirse, prosedür 2.2.2 şiddetle tavsiye edilir. Ancak, eğer değil, prosedür 2.2.2 çok daha kolay bir yoldur prosedür 2.2.1, yararlıdır. <ol><li> Bir ipucu sonunda Fosfolipidlerin sürecini Kaplama <ol><li> Aseton, etanol, deiyonize su ve en az üç kez kullanan bir slayt camını temizleyin. </li><li> PlBir temizlenmiş slayt camına konik kılcal as ve bir ucu ucu ile slayt cam dokunmadan kolaylaştırmak için kılcal eğin. </li><li> Bir cam şırınga kullanılarak bir cam slayt yapıştırıldığı bir kılcal kısmın ucu ucuna fosfolipid çözeltisi (1 mg / ml) bir kaç damla damlacıklar ve tamamen çözücünün buharlaştırılması için en az 30 dakika bekleyin. Not: Bu son derece uç uç çevre sadece kılcal kuvveti ile ucu sonunda fosfolipidlerin damlacık tutmak için çok küçük olduğu için prosedür 2.2.1.3 sırasında cam slayt kılcal ucu ucuna bağlı tavsiye edilir. </li></ol></li><li> Vezikül solüsyonunun hazırlanması <ol><li> Bir şişe temizleyin ve prosedür 1.1.1.1 tanıtılan olarak, şişeden su çıkarmak. </li><li> Yavaşça azot gazı uygulanarak fosfolipid çözeltisi (1 mg / ml) bir 2 ml hacim kurutun ve kalan çözücünün ortadan kaldırılması için oda sıcaklığında 1 saat için flakon ile kurutun. Güvenliği için Davlumbaz bu yordamı gerçekleştirin. </li><li> 2 Ekleşişe içine ml deiyonize su lipidler, kurutuldu ve 1 saat süre ile 60 ° C&#39;de bir fırın içinde şişe inkübe içeren. </li><li> Flakon birkaç kez çalkalayın ve sonikasyon (HF-frekans: 40 kHz, Güç kadar: 370 W) veziküller elde etmek için 30 dakika. </li><li> Tek dağılımlı tek lamelli veziküller elde edilmesi için ekstrüzyon ve donma-çözülme süreçleri gerçekleştirme. Hazırlanması veziküller detaylı bir protokol Mayer ve ark. 21 tarif edilmiştir. Not: Damlacık arayüzü Yüzey basıncı monodispers unilamellar veziküller içeren damlacık oluşumundan sonra bekleme süresini ayarlayarak tam kontrol edilir. Bir kolye bırak yöntemini kullanarak 22, önceden deney yapıyor, zamana göre yüzey basıncı değişimi ölçmek için gereklidir. </li></ol></li></ol></li><li> Kavisli yüzeyinde bir fosfolipid tek tabaka içeren bir damlacık oluşumu <ol><li> Prosedüründe de-iyonize edilmiş su 10 ul&#39;lik konik kılcal doldurune 2.2.1. Seçenek olarak ise, prosedür 2.2.2 vezikül çözeltisi 10 ul kullanın. </li><li> Damlacık oluşturulması için basınç temin etmek üzere otomatik bir mikro enjektöre kılcal bağlayın. </li><li> Tam olarak kılcal konumunu kontrol etmek için bir mikromanipülatör için bir mikro-, enjektöre bağlı kılcal monte edin. </li><li> CCD kamera ile kılcal yanal görünümünü görüntüleme için: (10X NA 0.3 Mikroskop 1, objektif lens) parlak alan mikroskobu hazırlayın. Mikroskop 1 nedenle z ekseni boyunca damlanın kesin konumunu gözlemlemek ve damlacık büyüklüğünü tahmin sağlar. </li><li> ~ 100 (uygun büyüklükte kadar kılcal ucu ucuna bir değişken basınç (~ 100 hPa) ucu ucuna yanal görünümü de bir micromanipulator kullanarak Mikroskop 1 tarafından görüntülenmiştir bir konuma uç uca getirin ve uygulamak damlacık çapı um) oluşturulur. Not: Bu otomatik mikro enjektör ve mikromanipülatör kullanımı olması önerilird damlacık damlacık boyutu ve konumu ince kontrolü gereklidir, eğer. Bu manuel olanları kullanmak da mümkündür. </li></ol></li></ol> Damlacık birleştirdikten sonra 3. Görüntüleme Floresan Kurtarma Not: Bu protokol temel ilkeleri damla kaynaştırma işlemi dışında, sıkı bağlamak tekniğin özdeştir. FRAP detaylı bir protokol ve ilgili teoriler A. Lopez ve ark., 15 ve D Axelrod vd. 16 mevcuttur. <ol><li> İzleme ve damlacık konumunu kontrol <ol><li> Rhodamine-DPPEs (560 nm&#39;de uyarma, 583 nm emisyon) için uygun bir filtre seti ile bir floresan mikroskop hem sağlar (: 10X NA 0.3, tüp lens odak uzaklığı 17 cm Mikroskop 2, objektif lens) ayarlanmış ters bir mikroskop hazırlayın ve parlak bir alan mikroskobu. Bir floresan mikroskop m damlanın üst görüşlerini görselleştirmek için buraya bir CCD kamera kullanınkaside ve parlak alan mikroskobu modu. </li><li> Z ekseni boyunca düz bir hava-su arayüzü bir fosfolipid ile kaplanmış damlacık taşıyabilirsiniz, ancak mikromanipülatör kullanarak, henüz damlacık birleştirme yok. Damlacık yanal görünümünü görselleştirmek için Mikroskop 1 kullanın. </li><li> Mikromanipülatör kullanarak, düz tek tabaka üst görünümden merkezinde damlacığı bulun. Düz tek tabaka üstten görünümünü görselleştirmek için Mikroskobu 2 aydınlık alan mikroskobu modunu kullanın. </li></ol></li><li> Düz hava-su arayüzü üzerine damlacığı birleştirme <ol><li> Damlacık mikromanipülatör kullanarak, arayüzü üzerine birleştirir kadar düz arayüzü doğru daha da damlacık hareket ettirin. Birleştirme işlemi başarıyla yapılırsa, beyaz bir arka plan ile çevrili bir dairesel şekle sahip bir karanlık bölge, Mikroskop 2 floresan modunu kullanarak gözlenir. </li><li> Micros floresan modunu kullanarak, damlacık birleştirdikten sonra zamana göre floresan görüntü serisi kaydedin2. Burada tek tabaka difüzyon süresi ölçeğinde daha hızlı bir kare hızı kullanın başa. DOPC tek tabaka olarak, tamamen 200 mikron-karanlık alana yaymak için bir kaç dakika sürer. </li></ol></li></ol> 4. Görüntü Analizi Difüzyon Katsayısı belirlenmesi Not: Aşağıda tarif edildiği gibi bir görüntü dizisinden difüzyon katsayısının saptanması için, görüntü analizi için özel program inşa edilmiştir. Bu programın detaylı bir kaynak kodu vallahi sitesinde mevcuttur. <ol><li> Ilgi dairesel bir tespit edilmesi <ol><li> Ilgili bölgenin merkezine tespiti <ol><li> Dairesel karanlık alanı ve beyaz bir arka plan içeren bir kurtarma işlemi sırasında kaydedilmiş olan floresan görüntüleri bir dizi elde etmek ve bir referans görüntü olarak serinin ilk resmi ayarlayın. Burada, R D referans görüntüdeki karanlık alanın yarıçapı. </li><li> Beyaz bir daire ile referans görüntü dürülmüş kimse yoğunluğu bütün bölge üzerinde üniforma olduğunu. İşte özelleştirilmiş program satırına 124. kaynak kodda gösterildiği gibi kıvrım için &#39;conv2&#39; adlı gömülü işlevini kullanın, beyaz çemberin yarıçapı R D biraz daha küçüktür. </li><li> Kıvrım hesaplamasında asgari değeri gösterir bir pozisyon bulun ve referans görüntüdeki ilgi bölgenin merkezi olarak bu konumunu ayarlamak. </li></ol></li><li> Ilgili bölgenin çapındaki belirlenmesi <ol><li> Bütün bölge üzerinde bir prosedür 4.1 ve üniform yoğunluk tarafından belirlenen bir merkez konumunu içeren beyaz bir daire ile referans görüntü dürülmüş. Burada, R S beyaz dairenin yarıçapı. Kullan yineleme gibi &#39;için&#39; veya özelleştirilmiş program satırına 109 102 kaynak kodda gösterildiği gibi beyaz bir daire yapmak için bir çemberin denklemi ile &#39;while&#39; olarak. </li><li> Biraz olan başka bir beyaz bir daire ile referans görüntü dürülmüşR, S daha büyük yarıçapı (% 5-% 10), R L,. Özelleştirilmiş program satırına 120 113 kaynak kodda gösterildiği gibi daire yapmak için prosedür 4.1.2.1 ile aynı yöntemi kullanın. </li><li> 4.1.2.1 ve 4.1.2.2 iki convolution hesaplamalarında arasındaki değer farkı edinin. </li><li> Bir piksel seviyesi ile R S ve R L artırarak, R S = 2R D R S = R D / 2 yukarıdaki işlemleri tekrarlayın. Tekrarlamak 4.1.2.3 prosedürü 4.1.2.1 gelen tüm kaynak kodları içeren bir yineleme olun. </li><li> İki convolution hesaplamalar arasındaki değer maksimum farkını gösterir R S yarıçapını bulun. Bu R, böylece referans görüntüdeki karanlık alanın yarıçapını gösterir S 149. özelleştirilmiş program satırına 148 kaynak kodda gösterildiği gibi yarıçapı bulmak için &#39;max&#39; adlı Kullanım gömülü fonksiyon değeri en yüksek farkını gösterir. </li></ol></li&gt; </ol></li><li> Kesirli yoğunluğunun hesaplanması <ol><li> Ilgi bir bölge olarak prosedür 4.1 tarafından belirlenen bir merkez konumu ve çapındaki içeren bir daire olarak ayarlayın. </li><li> Zamana göre flüoresans görüntü bir dizi ilgili bölgenin ortalama yoğunlukları hesaplayın. Ilgi bölgesi ile her kareyi dürülmüş ve ortalama yoğunluğunu hesaplamak için ilgi bölgenin alanına bölerek. Ayrıntılar vallahi sitesinde mevcuttur özelleştirilmiş programın kaynak kodu mevcuttur. </li><li> F (t) zamana göre bir ilgi alanı olan bir daire içinde, ortalama yoğunluğu, aşağıdaki denklemde, tanımlanmış bir fraksiyonel yoğunluğu hesaplanır, K i daire içinde başlangıç ​​yoğunluğu ve F o yoğunluğudur bir beyaz arka. f (t) = (F (±) - F i) / (F o - F i) (Denklem 1). </li></ol></li><li> F takılmasıFRAP teorisine ractional yoğunluğu <ol><li> Ben 1 uydurma programı kullanarak, Bessel fonksiyonları modifiye edilmiş, τ karakteristik difüzyon süresi ve 0 aşağıda denklemi ile fraksiyonel yoğunluğunu Fit ve τ elde <img alt="Denklem 2" src="/files/ftp_upload/53376/53376eq2.jpg" /> (Denklem 2). </li><li> D, difüzyon katsayısı ve karanlık bir yerde yarıçapıdır ilişkisi, τ göre bir difüzyon katsayısı = a 2/4 D elde edilir. Not: uydurma işlemi sırasında kurtarma işlemi zaten görüntüleri kaydederken önce başladığı bir zaman ekseni boyunca fraksiyonel yoğunluk profili kayması mümkündür. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Van Meer, G., Voelker, D. R., Feigenson, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+lipids:+where+they+are+and+how+they+behave.">Membrane lipids: where they are and how they behave.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (2), 112-124 (2008).</li><li>Christon, R., Even, V., Daveloose, D., L&#233;ger, C. L., Viret, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+fluidity+and+lipid&#8212;protein+relationships+in+pig+intestinal+brush-border+membrane+by+dietary+essential+fatty+acid+deficiency.">Modification of fluidity and lipid&#8212;protein relationships in pig intestinal brush-border membrane by dietary essential fatty acid deficiency.</a> Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 980 (1), 77-84 (1989).</li><li>Stubbs, C. D., Smith, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+modification+of+mammalian+membrane+polyunsaturated+fatty+acid+composition+in+relation+to+membrane+fluidity+and+function.">The modification of mammalian membrane polyunsaturated fatty acid composition in relation to membrane fluidity and function.</a> Biochim. Biophys. Acta - Rev. Biomembr. 779 (1), 89-137 (1984).</li><li>Holthuis, J. C. M., Menon, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+landscapes+and+pipelines+in+membrane+homeostasis.">Lipid landscapes and pipelines in membrane homeostasis.</a> Nature. 510 (7503), 48-57 (2014).</li><li>Alonso, C., Waring, A., Zasadzinski, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+lung+surfactant+where+it+belongs:+protein+regulation+of+two-dimensional+viscosity.">Keeping lung surfactant where it belongs: protein regulation of two-dimensional viscosity.</a> Biophys. J. 89 (1), 266-273 (2005).</li><li>Kim, K., Choi, S. Q., Zell, Z. a., Squires, T. M., Zasadzinski, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cholesterol+nanodomains+on+monolayer+morphology+and+dynamics.">Effect of cholesterol nanodomains on monolayer morphology and dynamics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.). 110 (33), E3054-E3060 (2013).</li><li>Hormel, T. T., Kurihara, S. Q., Brennan, M. K., Wozniak, M. C., Parthasarathy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Lipid+Membrane+Viscosity+Using+Rotational+and+Translational+Probe+Diffusion.">Measuring Lipid Membrane Viscosity Using Rotational and Translational Probe Diffusion.</a> Phys. Rev. Letters. 112 (18), 188101 (2014).</li><li>Ding, J., Warriner, H. E., Zasadzinski, J. a., Schwartz, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+needle+viscometer+for+Langmuir+monolayers.">Magnetic needle viscometer for Langmuir monolayers.</a> Langmuir. 18 (13), 2800-2806 (2002).</li><li>Dhar, P., Cao, Y., Fischer, T. M., Zasadzinski, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+interfacial+shear+microrheology+of+aging+protein+films.">Active interfacial shear microrheology of aging protein films.</a> Phys. Rev. Letters. 104 (1), 1-4 (2010).</li><li>Kim, K., Choi, S. Q., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfacial+microrheology+of+DPPC+monolayers+at+the+air-water+interface.">Interfacial microrheology of DPPC monolayers at the air-water interface.</a> Soft Matter. 7 (17), 7782-7789 (2011).</li><li>Choi, S. Q., Steltenkamp, S., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+microrheology+and+simultaneous+visualization+of+sheared+phospholipid+monolayers.">Active microrheology and simultaneous visualization of sheared phospholipid monolayers.</a> Nature Commun. 2 (5), 312 (2011).</li><li>Caruso, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+lateral+diffusion+coefficients+in+air-water+monolayers+by+fluorescence+quenching+measurements.">Determination of lateral diffusion coefficients in air-water monolayers by fluorescence quenching measurements.</a> J. Am. Chem. Soc. 113 (16), 4838-4843 (1991).</li><li>Filippov, A., Or&#228;dd, G., Lindblom, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cholesterol+on+the+lateral+diffusion+of+phospholipids+in+oriented+bilayers.">The effect of cholesterol on the lateral diffusion of phospholipids in oriented bilayers.</a> Biophys. J. 84 (5), 3079-3086 (2003).</li><li>Schwille, P., Korlach, J., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+correlation+spectroscopy+with+single-molecule+sensitivity+on+cell+and+model+membranes.">Fluorescence correlation spectroscopy with single-molecule sensitivity on cell and model membranes.</a> Cytometry. 36 (3), 176-182 (1999).</li><li>Lopez, A., Dupou, L., Altibelli, A., Trotard, J., Tocanne, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+recovery+after+photobleaching+(FRAP)+experiments+under+conditions+of+uniform+disk+illumination.+Critical+comparison+of+analytical+solutions,+and+a+new+mathematical+method+for+calculation+of+diffusion+coefficient+D.">Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) experiments under conditions of uniform disk illumination. Critical comparison of analytical solutions, and a new mathematical method for calculation of diffusion coefficient D.</a> Biophys. J. 53 (6), 963-970 (1988).</li><li>Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobility+measurement+by+analysis+of+fluorescence+photobleaching+recovery+kinetics.">Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics.</a> Biophys. J. 16 (9), 1055-1069 (1976).</li><li>Vaz, W. L., Clegg, R. M., Hallmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+diffusion+of+lipids+in+liquid+crystalline+phase+phosphatidylcholine+multibilayers.+A+comparison+of+experiment+with+theory.">Translational diffusion of lipids in liquid crystalline phase phosphatidylcholine multibilayers. A comparison of experiment with theory.</a> Biochemistry. 24 (3), 781-786 (1985).</li><li>Wu, E. S., Jacobson, K., Papahadjopoulos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+diffusion+in+phospholipid+multibilayers+measured+by+fluorescence+recovery+after+photobleaching.">Lateral diffusion in phospholipid multibilayers measured by fluorescence recovery after photobleaching.</a> Biochemistry. 16 (17), 3836-3841 (1977).</li><li>Peters, R., Beck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+diffusion+in+phospholipid+monolayers+measured+by+fluorescence+microphotolysis.">Translational diffusion in phospholipid monolayers measured by fluorescence microphotolysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.). 80 (23), 7183-7187 (1983).</li><li>Kuhn, H., Mobius, D., Bucher, H., Crawley, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Physical Methods of Chemistry. 1, Part 3B, 651-653 (1972).</li><li>Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicles+of+variable+sizes+produced+by+a+rapid+extrusion+procedure.">Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure.</a> Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 858 (1), 161-168 (1986).</li><li>Rotenberg, Y., Boruvka, L., Neumann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+surface+tension+and+contact+angle+from+the+shapes+of+axisymmetric+fluid+interfaces.">Determination of surface tension and contact angle from the shapes of axisymmetric fluid interfaces.</a> J. Colloid Interface Sci. 93 (5), 169-183 (1983).</li><li>Jeong, D. W., Kim, K., Lee, S., Choi, M. C., Choi, S. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+recovery+after+merging+a+surfactant-covered+droplet:+a+novel+technique+to+measure+the+diffusion+of+phospholipid+monolayers+at+fluid/fluid+interfaces.">Fluorescence recovery after merging a surfactant-covered droplet: a novel technique to measure the diffusion of phospholipid monolayers at fluid/fluid interfaces.</a> Langmuir. 30 (48), 14369-14374 (2014).</li></ol>

The authors declare no competing financial interest.

FRAM özellikle belirli bir alanı beyazlatma sonra floresan kurtarma ölçmek için FRAP ile temel ilkeleri, bir sürü paylaşır, ancak FRAM bir ağartılmış alan oluşturmak için düz arayüzü üzerine bir damlacık birleştirme yerine yoğun bir ışık uygulamak bir işlem kullanır. Birleştirme işlemi böylece FRAM en önemli adımdır ve özellikle, bir damlacık birleştirdikten sonra düz tek tabaka karanlık leke şekli yayınım ölçüm doğruluğunu belirler. Özellikle, bir akım yöntemine dayalı, biz sadece prosedür 4&#39;te gösterilen koyu leke ortalama yoğunluğunu hesaplamak için bir ilgi bölge olarak bir R yarıçaplı daire ayarlayın ve dairesel şekilden bir çok sapma varsa, Bu difüzyon katsayısı hassas ölçüm rahatsız olur. Bu nedenle, bu dairesel şekilli karanlık bölgeye elde etmek için gerekli olduğunu, ancak, dairesel olmayan şekiller çeşitli nedenlerden dolayı zaman oluşturulur. İlk olarak, Pet, bir konvektif akışını mevcutsari çanağı, koyu alanın şekli akış yönünde uzatılmış olur. Prosedür 1,3 belirtildiği gibi, koni şekilli cihazı konvektif akışını bastırmaya yardımcı olur ve bu uzama minimize olacaktır. Kılcal uç son bir birleşme sürecinde düz arayüzü dokunursa kılcal uç birleştirme işlemini keser çünkü İkincisi, karanlık alan şekillerin çeşitli ile oluşturulmuştur. Sadece kılcal sonuna asılı olan bir damlacık elde ederek, bu durdurma önlenebilir. Özellikle, kılcal bir hidrofobik tedavi kılcal en sonunda oturup damlacık yardımcı olur. Bu nedenle, yukarıdaki sorun çekimleri ve değişiklikler daha doğrusu difüzyon özelliklerini ölçmek için bize sağlar. Bu iyi sorunlarını giderdiğiniz İşlem, bu nedenle FRAM FRAP göre çok önemli avantajlara sahip olmasını sağlar. İlk olarak, FRAM FRAP kıyasla daha basit bir ekipman gerektirir. FRAM için, basit bir floresan Micros kullanmak yeterlidiryerine dalga boyu boya emme spektrumu ile eşleşmesi gerekir bir yüksek güç lazer ile pahalı bir konfokal mikroskop, baş. Buna ek olarak, bu FRAM damlacık boyutu veya damlacık yüzeyinde yüzey basıncını ayarlayarak kolayca alanın boyutunu kontrol eder, FRAP ağartılmış alanına boyutunu ayarlamak için ilave aygıtlar kullanmak gereklidir. İkinci olarak, bu ömürlük, boyalar, çeşitli türlerin kullanılması mümkündür. FRAP sadece kimin ağartma işlemi difüzyon süreci çok daha hızlı boya molekülleri kullanır. Boyaların difüzyon ağartma işlemi sırasında oluşursa, doğru difüzyon özelliği tahmin etmek zordur. FRAM Ancak, boyalar ağartılması için bir işlemi gerektirir ve bu nedenle fluoresans görüntüsü boyalar çeşitli kullanımını sağlar. Buna ek olarak, sıkı bağlamak ek yüksek güç lazerleri gerektirir ve filtre o FRAM filtre setleri yerine sadece gerekli ise, boya türlerini değiştirmek için ayarlar. NihayetFRAP yalnızca ölçer, damla yüzeyi ve düz arayüzde mono tabakaları, çünkü bu şekilde arası difüzyon incelenmesine imkan veya A-tip B tipi tek tabakalı için tek tabaka birleştirme iki farklı lipid tek katmanlarının arasındaki karıştırma bağımsız olarak oluşturulabilir bir tek tabaka kendini difüzyon. Bu avantajlara rağmen, düz bir hava-su arayüzü üzerine bir damlacık birleştirme süreci potansiyel nedeniyle böyle iki mono tabakaları arasındaki yüzey basıncı uyumsuzluğu, birleştirme işleminin zaman ölçeği olarak endişe olabilir çeşitli konulara, bu tekniği sınırlandırabilir damlacıkları birleştirdikten sonra düz bir tek tabaka yüzey basınç ve artış. Bu konular, ancak, aşağıdaki nedenlerden dolayı önemli ölçüde difüzyon ölçümünü etkilemez. İlk olarak, iki farklı mono tabakaları yüzey basınçları oldukça farklı olsa bile, bir dengeleme süreci kurtarma işlemi sırasında çok erken bir aşamada tamamlanır. Örneğin, tYüzey basıncı dengeleyecek kadar o damlacık yüzeyinde tek tabaka basıncı düz hava-su ara yüzeyinde tek tabaka daha yüksek olduğu yüzey, karanlık alanı genişler. Bu süreç 10 msn içinde tamamlanır olduğundan önemli ölçüde difüzyon sürecini etkilemektedir önce yüzey basıncı dengelenmiş olacaktır. Birleştirme işleminin zaman ölçeği yeterince hızlı ise İkincisi, hiç difüzyon ölçümü sınırı yok. Neyse ki, tipik bir birleştirme işlemi de 10 msn içinde tamamlanır. Son olarak, çukur yüzey alanının beri yüzey basıncını artırmak değil düz arayüzü üzerine damlacıkların hatta birden birleştirilmesi damlacık yüzey alanının çok büyüktür. Protokolde tarif edilen çukur ve damlacıkların, boyutlarına göre, molekül başına alan bir damlacık birleştirerek en az 0,015% artar. Bu duruma göre, bağlı molekül başına alan değişikliğine yüzey basıncı artışı negligibl olan% 0.1&#39;den az, birVVilhelmy plâka tansiyometre ile ölçülen e bu yüzey basıncı tipik hata çok daha küçük olduğu için. Özetle, biz düz arayüzü üzerine damlacık tek tabaka birleştirerek bir fosfolipid tek tabaka yanal yayılma özelliği ölçmek için yeni bir yöntem tanıttı. Bu teknik, nispeten basit bir ekipman gerektirir ve aynı zamanda boya türlerin çeşitli türlerdeki kullanımını sağlar. FRAM böylece sıvı-sıvı arayüzünde fosfolipidler, blok kopolimerleri, proteinler ve hatta nanopartiküller içeren herhangi bir yüzey aktif ajan, bir difüzyon ölçümleri için potansiyel olarak uygulanabilir. Ayrıca, FRAM iki farklı yüzey aktif maddeler arasında karıştırma arası difüzyon veya çalışmak için yeni bir yol sağlar bekliyoruz.

<html> Fosfolipidler önemli hücre zarlarının yapı parçalarıdır ve organellerin zarları, ve bu membran katmanlarının akışkanlığı genellikle membran proteinlerinin 1 aktivitesini değiştirerek hücresel fonksiyonları etkiler - 3. Örneğin, membran için &#160; homeostazda zar proteinleri ile tespit edilir membran akışkanlığını düzenleyen elde edilir ve akışkanlık anormal düzeyde hepatik steatoz ve kolestaz 4 gibi ciddi hastalıklara neden olur. Buna ek olarak, hava alveol sıvı arayüzünde bir fosfolipid tek tabaka akışkanlığı fonksiyonları önemli etkileri vardır. Düşük akışkanlık ekshalasyonun 5,6 sırasında alveol içinde kalmak katmanı sağlar, oysa akciğer yüzey fosfolipid tek tabaka yüksek akışkanlık, inhalasyon sırasında katmanın yayılmasını kolaylaştırır. Bu rollerini anlamak için fosfolipid tabakaların akışkanlığını tahmin etmek oldukça önemlidir. _content &quot;&gt; akışkanlığı bir doğrudan bir ölçüsüdür viskozitesi ve fosfolipid tabakaların viskozitesi mikron boyutunda kolloidleri 7, manyetik iğneler 8,9 ve manyetik mikro-düğme 6,10,11 kullanılarak ölçülmüştür. Bununla birlikte, bu tekniklerin nispeten sert filmler sınırlıdır ve daha az viskoz filmler ölçemez. Bu gibi durumlarda, yayınım fosfolipid tabakaların akışkanlığını ölçmek için bir alternatif olacaktır. Birkaç on yıl için, fosfolipid tabakaların difüzyon özelliklerini ölçmek için çeşitli teknikler geliştirilmiştir Böyle floresan su verme yöntemi 12, darbeli alan degrade NMR 13 ve flüoresan korelasyon spektroskopisi (FCS) en iyi temsil eden yöntemlerden 14. Bir şekilde (sıkı bağlamak) 15,16 photobleaching sonra floresan kurtarma olduğunu. ölçüm prosedürü ve ilgili basitliği nedeniyle Fosfolipid katmanların difüzyon özelliklerine teori, çeşitli çalışmalar FRAP kullanılarak yapılmıştır <sup&gt; 17 - 19. Ancak, sıkı bağlamak genellikle yüksek güç lazer pahalı bir konfokal mikroskop kurulum gerektirir. Burada, biz (FRAM) birleştirdikten sonra floresan kurtarma olarak adlandırılan fosfolipid mono tabakaları, yanal difüzyonunu ölçmek için yeni bir teknik sunuyoruz. FRAP ve FRAM arasındaki temel fark photobleaching adım damla birleşme yerini olmasıdır. Bir floresan etiketli düz tek tabaka üzerine olmayan floresan tek tabaka ile kaplıdır bir damlacık birleştirme, böylece photobleaching aşaması ile aynı başlangıç ​​durumunu kurma, parlak düz tek tabaka üzerinde dairesel koyu bir leke bırakır. Daha sonra yanal yayılma ölçmek için zaman karanlık leke floresan kurtarma gözlemlemek. Damla birleşme ile bu yeni &quot;ağartma&quot; adım FRAP göre önemli avantajlar sağlamaktadır: FRAM sadece bir floresan mikroskop ziyade FRAP için gerekli olan bir yüksek güç lazer ile pahalı bir konfokal mikroskop gerektirir. beno photobleaching sürecini içermez çünkü n eklenmesi, FRAM floresan boyaların geniş bir yelpazesi vardır. Son olarak, iki farklı tek tabakalar bir damlacık tek tabaka ve düz tek-tabakalı, ve böylece sıkı bağlamak yalnızca mono tabakaları kendi kendine difüzyonunu ölçer interdifüzyon, ölçülmesine izin verecek şekilde, bağımsız bir şekilde hazırlanabilir. FRAM yaklaşık sürtünmesiz materyallere oldukça yapışkan bir malzemeden difüzyon ölçümleri, geniş bir dizi sağlar. Difüzyon damla coalescence süreci (~ 10 msn) zamanında bölgede 100 mikron 100 mikron arasında meydana geldiğinde Prensipte, FRAM, mevcut tekniklere karşılaştırılabilir 10 6 mikron 2 / sn, maksimum yayılma ölçebilirsiniz. Tek molekül sıraları, katı olmadıkça Ayrıca, yavaş bir difüzyon işlemi kolaylıkla ölçülebilir. FRAM sürece uygun floresan etiketli moleküller bulunmaktadır gibi yüzey aktif maddelerin her türlü için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>Acetone</td><td>OCI corporation</td><td>Acetone 3.8L Extra Pure</td><td>Purity: &amp;ge; 99.5%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use.</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>OCI corporation</td><td>Ethanol 3.8L Extra Pure</td><td>Purity: &amp;ge; 94%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use.</td></tr><tr><td>Dioleoylphosphatidylcholine, DOPC</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375C</td><td>Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. Chloroform is carcinogenic.</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>LiChrosolv</td><td>Chloroform ultrapure (A3633)</td><td>Purity: &amp;ge; 99.8%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. Carcinogenic</td></tr><tr><td>Rhodamine DPPE</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810158C, 810158P</td><td>Avoid direct light exposure to prevent photobleaching</td></tr><tr><td>Wilhelmy plate tensiometer</td><td>R&amp;amp;K ultrathin organic film technology</td><td>Wilhelmy tensiometer</td><td>http://www.rieglerkirstein.de/index.htm</td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Sutter instrument</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Micro-injector</td><td>Eppendorf</td><td>Femtojet</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Eppendorf</td><td>Micromanipulator 5171</td><td></td></tr><tr><td>Microscope 1</td><td>Objective lens: Olympus</td><td>Objective lens: UPlanFl 10x</td><td>Objective lens: 10X NA 0.3</td></tr><tr><td>Microscope 2</td><td>Objective lens: Olympus, Tube lens: Thorlabs</td><td>Objective lens: UPlanFl 10x</td><td>Objective lens: 10X NA 0.3, tube lens: focal length 17 cm</td></tr><tr><td>CCD for Microscope 1</td><td>Jai</td><td>CV 950 camera</td><td></td></tr><tr><td>CCD for Microscope 2</td><td>Andor</td><td>iXon3 EMCCD</td><td></td></tr><tr><td>Filter set</td><td>Chroma technology</td><td>Catalog Set 49004: ET545, T565, ET605</td><td>Prepare suitable for dye molecules</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>DAIHAN Scientific</td><td>Wiseclean WUC-D06H</td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescence recovery after merging a droplet to measure the two-dimensional diffusion of a phospholipid monolayer

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after merging (FRAM). FRAM adopts the same principles as the fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) technique, especially for measuring fluorescence recovery after bleaching a specific area, but FRAM uses a drop coalescence instead of photobleaching dye molecules to induce a chemical potential gradient of dye molecules. Our technique has several advantages over FRAP: it only requires a fluorescence microscope rather than a confocal microscope equipped with high power lasers; it is essentially free from the selection of fluorescence dyes; and it has far more freedom to define the measured diffusion area. Furthermore, FRAM potentially provides a route for studying the mixing or inter-diffusion of two different surfactants, when the monolayers at a surface of droplet and at a flat air/water interface are prepared with different species, independently.

Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi floresans görüntüleri bir dizi düz DOPC tek tabaka üzerine DOPC tek tabaka ile kaplanmış bir damlacık birleştirme sonrası iyileşme sürecinde zaman elde edilmiştir. Düz bir hava-su ara DOPC tek tabakalı düşük miktarlarda katkılı edildi Rodamin-DPPE ve bu böylece bir parlak renkli ve yeni düz arayüzü eklenmiştir koyu bölgesi ile bir arka plan görselleştirmek için yapılmıştır. Orada, bir geri kazanım işlemi, sabit yüzey basıncı 23 mN / m gözlenmiştir. Zamana göre fraksiyonel yoğunluk değişimine denklem 1 &#39;in bir uyum, bu uyum R2 değeri 0,999 olan. Şekil 2&#39; de gösterilmiştir ve bu uyum bile hala daha düşük ya da daha yüksek yüzey basınçlarda çalışır. Bu uyum elde DOPC tek tabaka difüzyon katsayısı yüzey basıncı 23 mN / m 27,54 um 2 / sn idi. FRAM daha doğrulama, DO difüzyon katsayılarıPC ve dipalmitoilfosfatidilkolin (DPPC) mono tabakalar yüzey basıncına göre ölçülmüştür. Şekil 3&#39;te gösterildiği gibi, FRAM ~ 9 mN / m bir yüzey basıncı, LC (sıvı yoğunlaştırılmış) nerede DPPC tek tabaka yayılma katsayısının hızlı bir düşüş yakalar - LE (sıvı genişletilmiş) faz geçiş 10 ortaya çıkar ve değerler difüzyon katsayıları da Peters ve ark. 19 tarafından önceden ölçümlerle iyi kabul edilir. Buna ek olarak, yüzey basıncı ile difüzyon katsayısı bir üstel çürüme DOPC tek tabaka gözlendi ve bu eğilim Caruso ve diğ. 12 ile ölçülen biri ile hemen hemen aynıdır. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53376/53376fig1.jpg" /> Şekil 1. (A) FRAM şematik gösterimi (birleştirdikten sonra floresan kurtarma) tekniği. Dudak olarakid tek tabakalı kaplı damlacık düz hava-su arayüzü birleştirilir, floresan olmadan lipit tek katmanlı lipit düz floresan lipit tek tabaka yerleştirilir etiketledi. Yüzey basıncı 23 mN / m (ölçek bar = 100 um) bir DOPC tek tabaka kurtarma işlemi sırasında zaman (B) Floresan mikroskop görüntüleri. DOPC tek tabaka karanlık bölge tamamen birkaç dakika içinde difüzyon işlemi ile elde edilir. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53376/53376fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53376/53376fig2.jpg" /> Zamana karşı 2. Kısmi yoğunluğunu Şekil. Siyah çevreler ve gri noktalı çizgi, zamanla fraksiyonel şiddetleri görüntü analizi (prosedürler 4.1 ve 4.2) ve denklemin 1 uyum elde kesirli şiddetleri değerlerini gösterirprosedür 4.3 gösterilen sırasıyla. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53376/53376fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53376/53376fig3.jpg" /> DOPC (üçgen) ve DPPC (boş kare) yüzey basıncının bir fonksiyonu olarak mono tabakaları Şekil 3. Difüzyon katsayıları. Parlak gri renk ve koyu gri renkli çizgiler daha önce Peters ve arkadaşları tarafından bildirilen difüzyon katsayısı değerlerini göstermektedir. ve Caruso ve ark., sırasıyla. Bu rakam Jeong et al. 23 modifiye edilmiştir. Jeong ve ark., Langmuir. 30 (48), 14369-14374 izni ile yayımlanmaktadır. Telif Hakkı 2014 American Chemical Society. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53376/53376fig3large.jpg" target="_blank">Onu tıklayınız</a>e bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için.

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer at JoVE.com

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.

Bir Damlacık birleştirme sonra Floresan Kurtarma Fosfolipid Monolayer İki boyutlu Difüzyon Tedbir

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

fluorescence-recovery-after-merging-droplet-to-measure-two

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.0K Görüntüleme.  KAIST. We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.

Video: Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

Bir floresan dalgalanma spektroskopisi tahlil Protein-Protein etkileşimlerinin hücre-hücre kişiler

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Biyokimya

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

Kültür Nöronlar Membran Proteinlerin Yanal Difüzyon ve ekzositoz Floresans Kurtarma ve Floresans kaybı Photobleaching kullanarak Değerlendirilen

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Nörobilim

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

Ticari Mikroskop Canlı Hücre Zarları Moleküler Difüzyon Kanunu Hızlı Floresans Görüntüleme Gönderen

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Biyomühendislik

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

Planar on Tek Molekül Floresans Mikroskopi bilayers Desteklenen

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found to represent a novel lipid transfer protein (LTP) group in yeast and human cells. They transfer phosphatidylserine (PS) from the endoplasmic reticulum (ER) to the plasma membrane (PM) via PS/phosphatidylinositol 4-phosphate (PI(4)P) exchange cycles. This finding allows a better understanding of how PS, which is critical for signaling processes, is distributed throughout the cell and the investigation of the link between this process and phosphoinositide (PIP) metabolism. The development of new fluorescence-based protocols has been instrumental in the discovery and characterization of this new cellular mechanism in vitro at the molecular level. This paper describes the production and the use of two fluorescently labelled lipid sensors, NBD-C2Lact and NBD-PHFAPP, to measure the ability of a protein to extract PS or PI(4)P and to transfer these lipids between artificial membranes. First, the protocol describes how to produce, label, and obtain high-purity samples of these two constructs. Secondly, this paper explains how to use these sensors with a fluorescence microplate reader to determine whether a protein can extract PS or PI(4)P from liposomes, using Osh6p as a case study. Finally, this protocol shows how to accurately measure the kinetics of PS/PI(4)P exchange between liposomes of defined lipid composition and to determine lipid transfer rates by fluorescence resonance energy transfer (FRET) using a standard fluorometer.

Here, we describe protocols using fluorescent lipid sensors and liposomes to determine whether a protein extracts and transports phosphatidylserine or phosphatidylinositol 4-phosphate in vitro.

Membranlar Arasında Fosfataylserine/Fosfatidiylinositol 4-Fosfat Değişiminin Floresan Bazlı Ölçümleri

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found ...

Measuring Diffusion Coefficients via Two-photon Fluorescence Recovery After Photobleaching

Multi-fluorescence recovery after photobleaching is a microscopy technique used to measure the diffusion coefficient (or analogous transport parameters) of macromolecules, and can be applied to both in vitro and in vivo biological systems. Multi-fluorescence recovery after photobleaching is performed by photobleaching a region of interest within a fluorescent sample using an intense laser flash, then attenuating the beam and monitoring the fluorescence as still-fluorescent molecules from outside the region of interest diffuse in to replace the photobleached molecules. We will begin our demonstration by aligning the laser beam through the Pockels Cell (laser modulator) and along the optical path through the laser scan box and objective lens to the sample. For simplicity, we will use a sample of aqueous fluorescent dye. We will then determine the proper experimental parameters for our sample including, monitor and bleaching powers, bleach duration, bin widths (for photon counting), and fluorescence recovery time. Next, we will describe the procedure for taking recovery curves, a process that can be largely automated via LabVIEW (National Instruments, Austin, TX) for enhanced throughput. Finally, the diffusion coefficient is determined by fitting the recovery data to the appropriate mathematical model using a least-squares fitting algorithm, readily programmable using software such as MATLAB (The Mathworks, Natick, MA).

In this article we will describe the procedure for measuring diffusion coefficients using multi-photon fluorescence recovery after photobleaching. We will begin by aligning the laser along the optical path to the sample and determining the proper experimental parameters, then continue generating and finally fitting fluorescence recovery curves.

İki foton Floresan Kurtarma üzerinden Photobleaching sonra Difüzyon Katsayıları Ölçüm

Multi-fluorescence recovery after photobleaching is a microscopy technique used to measure the diffusion coefficient (or analogous transport parameters) ...

Biyoloji

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological studies. In the past years, it has become increasingly clear that living cells respond, not only to the biochemical nature of the molecules presented to them but also to the way these molecules are presented. Creating protein micro-patterns is therefore now standard in many biology laboratories; nano-patterns are also more accessible. However, in the context of cell-cell interactions, there is a need to pattern not only proteins but also lipid bilayers. Such dual proteo-lipidic patterning has so far not been easily accessible. We offer a facile technique to create protein nano-dots supported on glass and propose a method to backfill the inter-dot space with a supported lipid bilayer (SLB). From photo-bleaching of tracer fluorescent lipids included in the SLB, we demonstrate that the bilayer exhibits considerable in-plane fluidity. Functionalizing the protein dots with fluorescent groups allows us to image them and to show that they are ordered in a regular hexagonal lattice. The typical dot size is about 800 nm and the spacing demonstrated here is 2 microns. These substrates are expected to serve as useful platforms for cell adhesion, migration and mechano-sensing studies.

We present a protocol to functionalize glass with nanometric protein patches surrounded by a fluid lipid bilayer. These substrates are compatible with advanced optical microscopy and are expected to serve as platform for cell adhesion and migration studies.

Bir Desteklenen lipit iki tabakalı içinde Ligand Nano küme Diziler

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific lipid component within a membrane, as in the case of phosphoinositides (PIPs), to ensure specific subcellular localization and/or activation. PIPs and cellular PIP-binding domains have been studied extensively to better understand their role in cellular physiology. We applied a pH modulation assay on supported lipid bilayers (SLBs) as a tool to study protein-PIP interactions. In these studies, pH sensitive ortho-Sulforhodamine B conjugated phosphatidylethanolamine is used to detect protein-PIP interactions. Upon binding of a protein to a PIP-containing membrane surface, the interfacial potential is modulated (i.e. change in local pH), shifting the protonation state of the probe. A case study of the successful usage of the pH modulation assay is presented by using phospholipase C delta1 Pleckstrin Homology (PLC-&#948;1 PH) domain and phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) interaction as an example. The apparent dissociation constant (Kd,app) for this interaction was 0.39 &#177; 0.05 &#181;M, similar to Kd,app values obtained by others. As previously observed, the PLC-&#948;1 PH domain is PI(4,5)P2 specific, shows weaker binding towards phosphatidylinositol 4-phosphate, and no binding to pure phosphatidylcholine SLBs. The PIP-on-a-chip assay is advantageous over traditional PIP-binding assays, including but not limited to low sample volume and no ligand/receptor labeling requirements, the ability to test high- and low-affinity membrane interactions with both small and large molecules, and improved signal to noise ratio. Accordingly, the usage of the PIP-on-a-chip approach will facilitate the elucidation of mechanisms of a wide range of membrane interactions. Furthermore, this method could potentially be used in identifying therapeutics that modulate protein&#39;s capacity to interact with membranes.

Here we present a supported lipid bilayer in the context of a microfluidic platform to study protein-phosphoinositide interactions using a label-free method based on pH modulation.

PIP-on-a-chip: Protein-fosfoinositid Etkileşimlerinin Etiketsiz Bir Çalışması

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

High-resolution imaging techniques have shown that many ion channels are not static, but subject to highly dynamic processes, including the transient association of pore-forming and auxiliary subunits, lateral diffusion, and clustering with other proteins. However, the relationship between lateral diffusion and function is poorly understood. To approach this problem, we describe how lateral mobility and activity of individual channels in supported lipid membranes can be monitored and correlated using total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Membranes are fabricated on an ultrathin hydrogel substrate using the droplet interface bilayer (DIB) technique. Compared to other types of model membranes, these membranes have the advantage of being mechanically robust and suitable for highly sensitive analytical techniques. This protocol measures Ca2+ ion flux through single channels by observing the fluorescence emission of a Ca2+-sensitive dye in close proximity to the membrane. In contrast to classical single-molecule tracking approaches, no fluorescent fusion proteins or labels, which can interfere with lateral movement and function in the membrane, are required. Possible changes in ion flux associated with conformational changes of the protein are only due to protein lateral motion in the membrane. Representative results are shown using the mitochondrial protein translocation channel TOM-CC and the bacterial channel OmpF. In contrast to OmpF, the gating of TOM-CC is very sensitive to molecular confinement and the nature of lateral diffusion. Hence, supported droplet-interface bilayers are a powerful tool to characterize the link between lateral diffusion and the function of ion channels.

Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy

This protocol describes how to use TIRF microscopy to track individual ion channels and determine their activity in supported lipid membranes, thereby defining the interplay between lateral membrane movement and channel function. It describes how to prepare the membranes, record the data, and analyze the results.

Toplam İç Yansıma Floresan (TIRF) Mikroskobu Kullanılarak Lipid Çift Katmanlarında Yanal Mobilite ve İyon Kanalı Aktivitesinin Tek Moleküllü Görüntülenmesi

High-resolution imaging techniques have shown that many ion channels are not static, but subject to highly dynamic processes, including the transient ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial and temporal resolution. FCS can quantify the molecular concentration and diffusion coefficient of fluorescently labeled molecules in the cell membrane. This technique has the ability to explore the molecular diffusion characteristics of molecules in the plasma membrane of immune cells in steady state (i.e., without processes affecting the result during the actual measurement time). FCS is suitable for studying the diffusion of proteins that are expressed at levels typical for most endogenous proteins. Here, a straightforward and robust method to determine the diffusion rate of cell membrane proteins on primary lymphocytes is demonstrated. An effective way to perform measurements on antibody-stained live cells and commonly occurring observations after acquisition are described. The recent advancements in the development of photo-stable fluorescent dyes can be utilized by conjugating the antibodies of interest to appropriate dyes that do not bleach extensively during the measurements. Additionally, this allows for the detection of slowly diffusing entities, which is a common feature of proteins expressed in cell membranes. The analysis procedure to extract molecular concentration and diffusion parameters from the generated autocorrelation curves is highlighted. In summary, a basic protocol for FCS measurements is provided; it can be followed by immunologists with an understanding of confocal microscopy but with no other previous experience of techniques for measuring dynamic parameters, such as molecular diffusion rates.

A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.

Flüoresan Korelasyon Spektroskopisi Ölçülen İlköğretim Lenfositler Plazma Membranlarda moleküler difüzyon

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...