R01AA016837 (JCB) und P20AA017828 (AGD und JCB): Diese Studien wurden durch Zuschüsse aus den National Institutes of Health, Nationales Institut für Alkoholmissbrauch unterstützt.

1. Schritte für den am Tag vor dem Test durchführen <ol><li> Wählen L4 Stadium Würmer an die frische Nematoden Wachstumsmedium (NGM) Platten ausgesät mit einem Rasen von OP50 E. coli und Kultur sie bei 20 CO / N. Jeder Test Zustand erfordert 10 Würmer; holen einen Überschuss von Würmern für O / N-Verlust von Würmern ermöglichen. <ol><li> Nur Tiere, die erste Test-Tag Erwachsene sind; viele Mutanten wachsen mit einer geringeren Geschwindigkeit als der Wildtyp. Stellen Sie den Zeitpunkt der Kommissionierung für Stämme, die Entwicklungsverzögerungen haben, so dass alle getesteten Tiere ersten Tag Erwachsene. </li></ol></li></ol> 2. Schritte für den am Tage der Durchführung des Tests <ol><li> Vorbereitung für den Test: <ol><li> Führen Sie Tests auf Standard ungeimpften 60 x 15 mm NGM-Platten. Trocknen Sie alle Platten bei 37 C für 2 h verwendet werden, mit Deckel aus. Für jede experimentelle Studie, verwenden Sie vier getrocknete NGM-Platten; diese werden die 0 mM und 400 mM Ethanol Assay-Platten und die sie begleitenden Akklimatisierung Platten sein. HINWEIS:Die Verwendung von NGM-Platten ist es wichtig, Unterschiede in der Zusammensetzung der Platten, insbesondere deren Osmolarität kann stark Einfluss auf die Dosis-Antwort von Ethanol auf Verhalten ist dies aufgrund, zumindest teilweise auf Änderungen in der Menge von Ethanol von den Tieren 20 akkumuliert. NGM-Agar ist 160 mOsm. </li><li> Nach dem Trocknen wiegen jede der ungeimpften NGM-Platten, um im Assay verwendet werden und das Gewicht. Bestimmen das Volumen der Medien in den Platten basierend auf dem Gewicht einer leeren Platte. Um die Umwandlung des Gewichts des Agars zu Volumen anzunähern, davon ausgehen, dass die Medien wiegt das gleiche wie ein gleiches Volumen Wasser. HINWEIS: Unsere beständigsten Ergebnisse wurden mit NGM Medien, die ausreichend entwässert hat, dass ein Original 10 ml Volumen hat eine Nachtrocknungsvolumen zwischen 8,3 bis 8,9 ml gefunden. Eine Alternative zu der 2 Stunden Trockenzeit ist, um zu trocknen, bis die Platten erreichen diesen Volumenbereich, um Unterschiede in Inkubatoren ausmachen. </li><li> Schmelze 4 Kupferringe (Innendurchmesser von 1.6 cm) in der Oberfläche jeder der Platten als Hürden für die verschiedenen Genotypen oder Behandlungsgruppen worms.Grasp jeder Ring mit einer Zange und Hitze in einer Flamme (eine starke Flamme eines Bunsenbrenners funktioniert gut) für etwa 3 handeln sec. Sofort legen Sie den Ring auf einer Platte, während immer noch den Ring mit der Zange, um sie von &quot;Überspringen&quot; zu verhindern. <ol><li> Sicherzustellen, dass der Ring ruht flach auf der Oberfläche des Agars durch Herunterdrücken mit der Zange an mehreren Stellen auf dem Ring. Beim Anbringen des Rings, seien Sie vorsichtig, um Platz für weitere drei Ringe zu verlassen. </li><li> Schmelzen die drei zusätzlichen Kupferringe in die Oberfläche der Platte, wobei darauf zu ihnen so nahe wie möglich beieinander zu platzieren, so dass alle vier werden in das Sichtfeld der Kamera sein. HINWEIS: Erstellen Sie eine gute Abdichtung mit dem Agar ist wichtig, um die Würmer in den Ringen während des Tests zu halten. Ringe, die um überspringen auf der Platte ist unwahrscheinlich, dass die korrekte Abdichtung mit dem Agar zu machen undkann das Agar, der Würmer zu graben können und stört die Visualisierung der Würmer Narbe. </li><li> Für jede Testplatte vorbereiten eine begleitende &quot;Akklimatisierung&quot; Platte, die getrocknet werden sollte und ungeimpften und kein Ethanol erhalten. Zeigen vier Kupferringe auf diesen Platten. </li></ol></li><li> Kennzeichnen die Unterseite der Platten neben jeder Ring mit dem Wurmstamm, in den Ring eingesetzt werden, wobei darauf zu nicht im Sichtfeld der Ring selbst schreiben. Bringen Sie die Etiketten auf der Testplatte mit der dazugehörigen Akklimatisierung Platte. </li><li> Berechnen der Menge von 100% igem Ethanol zu jeder Testplatte hinzuzufügen, so dass die Endkonzentration 0 mM oder 400 mM Ethanol (Gewicht zu Volumen). Für jedes Experiment (n = 1), wird eine 0 mM und eines 400 mM Ethanol Platte sein; Akklimatisierung Platten erhalten keine Ethanol. Hinzufügen des Ethanols Pipettieren sie um die Oberfläche der Platte. Verwenden Labor Film, um die Platte zu versiegeln und lassen Sie es auf der Tischplatte für 2 Stunden ins Gleichgewicht. </li><li> Wenn 1,5 Stunden verstrichen ist, beginnt der Akklimatisierungsschritt des Assays, Schritt 2.2. </li></ol></li><li> Führen Sie die Fortbewegung Test: Testplatten <ol><li> Sorgfältig über 10 Würmer von jeder Versuchsgruppe zum Zentrum von einem Kupferring auf der Akklimatisierung Platte. Entfernen Sie alle Lebensmittel, die durch Kratzen leicht mit dem Wurm Pick auf dem Agar an dieser Stelle zu sehen ist. Variiert die Reihenfolge, in der die Versuchsgruppen werden auf den Platten in experimentellen Studien legen, so dass die gleichen Stämme werden auf den Platten in der gleichen Reihenfolge in den Studien legen. HINWEIS: Das Ziel ist es, die Tiere auf dem Teller mit minimalen Mengen von Lebensmitteln zu übertragen, denn wenn Lebensmittel auf dem Akklimatisierung Platte an der Testplatte übertragen die Würmer zu aggregieren um das Essen und die Wirkung des Medikaments auf die Fortbewegung wird verdeckt werden. </li><li> Achten Sie darauf, die Oberfläche des Agar mit dem Pick zu brechen, da dies ermöglicht es die Würmer zu graben und den Test zu unterbrechen. Die Würmer bei RT inkubieren für 30 Minuten. </li><li> Stellen Sie sicher, dass es eine entsprechende Abstand zwischen den Einweihungen jeder Platte. Ein erfahrener Experimentator 40 Tiere, 10 / ring für 4 Ringe in &lt;1,5 min bewegen, aber jedes Intervall von bis zu 2 Minuten ist akzeptabel. Der Standardtest hat Filme Aufnahme bei 10-12 min und 30 bis 32 Minuten der Exposition sowohl für 0 mM und 400 mM Ethanol. </li><li> Initiieren Sie die Akklimatisierung Platte für die 0 mM Belichtung und der Akklimatisierung Platte für die 400 mM Exposition ca. 2 min und 30 s auseinander, um für das Speichern der ersten Film-Datei, bevor der zweite Film müssen anfangen können. </li><li> Nach dem 30-Minuten Eingewöhnungszeit, übertragen Sie die Würmer aus den Akklimatisierung Platten zu den Testplatten. Übertragen Sie die Würmer zu den Testplatten (0 mM oder 400 mM Ethanol) in der gleichen Reihenfolge, dass sie auf die Akklimatisierung Platte gegeben, die Verfolgung des Zeitpunkts zwischen den Fertigstellungen jeder Platte. Verschließen Sie die Platte mit Labor Film, um den Verlust von Ethanol zu Verdampfung zu minimieren. </li><li> Use eine Schöpfbewegung mit einer dünnen Kanten abgeflacht Wurm Pick Würmer auf der Oberseite des abgeflachten Pick sammeln. Wird die Übertragung von Würmern aus dem ungesetzten Akklimatisierung Platte an der Testplatte ohne die Verwendung von Bakterien, die üblicherweise bei der Übertragung Würmer verwendet wird, da es hilft, die Schnecke zu der Aufnahme kleben. HINWEIS: Die Geschwindigkeit, mit denen die Tiere in diesem Schritt transferiert ist sehr wichtig, weil die ersten Würmer auf der Platte länger als die letzten Würmer zu der Platte zugegeben, um Ethanol ausgesetzt werden, und früheren Zeitpunkten können einige zeitabhängige Wirkung. Dies ist der Hauptgrund für die dreh Stämme werden auf einer Platte zuerst über Experimentwiederholungen gesetzt. </li></ol></li><li> Führen Locomotion Assay: Die Dreharbeiten <ol><li> Mikroskop verwenden / Kamera-Kombination, die für die gleichzeitige Darstellung aller vier Ringe in dem Sichtfeld (ca. 42x42 mm 2 Quadrat), ermöglicht, wie einem Mikroskopobjektiv 0,5x, 0,8x Vergrößerung und einer Kamera mit einer Auflösung von 2048x2048 7,481; m Pixel-CCD. </li><li> Verwenden Sie gleichmäßige Ausleuchtung über das Sichtfeld, das in der Objekterkennung in der Intensitätsschwelle Schritt unterstützt (siehe unten). A 3 &quot;x3&quot; Hintergrundbeleuchtung funktioniert gut. </li><li> Bild die Würmer auf einer Platte positioniert Medienseite nach oben (Deckel nach unten), der Kontrast, die bei der Verwendung der Hintergrundbeleuchtung im Vergleich zu einem herkömmlichen Mikroskop Durchlichtquelle verloren wird erzeugt. </li><li> Bereiten Sie die Bildanalyse-Software, um Zeitraffer-Filme der sich bewegenden Würmern zu erfassen. Legen Sie die Software zur Erfassung 12-Bit-Graustufenbilder alle 1 Sek, als 2-min (120 Rahmen) Film. Um die Größe der Ausgabedatei zu reduzieren, doch behielt er ausreichende Bildauflösung, mit einem 2x2 Binning-Modus zu 1024x1024 Pixel Bilder zu fassen. </li><li> Notieren Sie sich die Filme. Beginnen der Aufzeichnung eines 120-Rahmens Film der ersten Platte (0 mM Ethanol) 10 min nach der letzten Würmer wurden auf dieser Platte angeordnet. Speichern Sie die Videodatei. </li><li> Notieren Sie sich die zweite Platte (400 mM Ethanol). Wiederholen Sie diesen Vorgang fürbeide Platten ab 30 Minuten nach der letzten Würmer wurden auf der ersten Platte (0 mM Ethanol) platziert, um die 30 bis 32 min Zeitpunkten für jedes Engagement mit ein. HINWEIS: Lassen Sie ausreichend Zeit, um die Bilddateien nach jeder Aufnahme-Session, bevor die Aufnahme beginnt die nächste Platte zu analysierende speichern. </li><li> Für Zukunftssicherheit der archivierten Filme und, damit diese Filme zu öffnen und von anderen öffentlichen Bereich Open-Source-Bildbearbeitungssoftware-Programmen wie ImageJ 28 analysiert werden, wandeln eine Kopie jeder Film in 8-Bit 256 Graustufen TIFF-Dateien. HINWEIS: Die hier beschriebene Bildanalyse-Software ein proprietäres Dateiformat verwendet. </li></ol></li><li> Die Analyse der Filme mit ImagePro Software. <ol><li> Einmal erfasst, analysiert die Filme mit Hilfe von Image-Pro Plus-Software oder den Gegenwert. HINWEIS: Eine Vielzahl von anderen Objekt-Tracking-Software zur Verfügung, die verwendet wurde, um mehrere C erfolgreich verfolgen elegans zu einem Zeitpunkt 29 und solchenSoftware könnte einem angemessenen Ersatz für die hier beschriebene, da die Objektidentifikation Schritte auf ähnlichen Prinzipien. Das beschriebene Verfahren bezieht sich auf Image-Pro Plus-Software-Versionen von 6,0 bis 6,3 und 7,0, neuere Versionen von Image-Pro Plus-Software kann geringfügige Unterschiede haben. </li><li> Analysieren Sie Filme in 2-min (120 Rahmen) Segmenten. Erstens, einen Filter auf die Bilder, um den Hintergrund glätten und verbessern Sie den Kontrast der Wurm Objekte. Wählen Sie den Filter wie folgt: Menü&gt; Prozess&gt; Filter&gt; Zubehör&gt; Flatten: Parameter: Hintergrund = Dunkel; Verfügen Breite = 20 Pix. </li><li> Re-speichern Sie die Filme nach dem Filterschritt, sondern auch in der Originalfilm in seiner ungefiltert zu erhalten. <ol><li> Analysieren der Fortbewegung eines Tiere in jeder Ring getrennt mit einem kreisförmigen Bereich von Interesse (ROI), der angeordnet ist und bemessen ist, um mit dem Kupferring überlappt. Identifizieren und verfolgen die Würmer mit dem Menü&gt; Messen&gt; Track Objects ... Befehl; Dadurch wird das Tracking-Data Tabellenfenster. Der Button-Tracking-Optionen können bestimmte Titel ausgeschlossen werden und zu experimentellen Artefakte begrenzen. </li></ol></li><li> Unter dem Reiter Auto Tracking, verwenden Sie die folgenden Parameter: Spur-Parameter: Geschwindigkeits-Grenzwert (Suchradius) = 400 &amp; mgr; m / Rahmen, Beschleunigungsbegrenzung = Auto, Mindestgesamtstreckenlänge = 400 &amp; mgr; m Wiegende Bewegung type = chaotisch; Objekte in Spuren Parameter: Lassen Teilspuren = yes, Mindestlänge = 21 Frames, Kamera Vorhersage Tiefe = 1 Frame. </li><li> Um die Verfolgung einzuleiten, klicken Sie auf Suche Alle Titel automatisch funktionieren um das Dialogfeld Count / Größe Optionen und das Dialogfeld Verfolgung aufzurufen. Wählen Sie die Option Manuell für die Intensitätsbereichsauswahl im Dialogfeld Count / Größe, die die wichtige Schwelle Schritt, der die Graustufen-Intensität der Wurm Pixel verwendet, um einen Wurm Objekt zur Analyse hervorheben und die helleren Hintergrund Pixel ignorieren bietet. <ol><li> Stellen Sie die Intensität Schwelle sliders (eine, die obere Grenze gesetzt, ein, um die untere Grenze gesetzt), um einen inklusiven Bereich, die alle dunklen Objekten unterstreicht erstellen. Ein Bereich von 0-1,500 auf einer Skala von 0-4,095 ist ein guter Ausgangspunkt für die Feinabstimmung. </li><li> Anwenden einer Filtergröße von Objekten, die größer und kleiner als eine einzige Schnecke Objekt, wie dem Kupferring und Schutt auf den Platten aus. Stellen Sie zwei Größenparameter dazu, die Größen für den individuellen Würmer decken in einer Vielzahl von Körperhaltungen mit der Maßnahme zu tun&gt; Wählen Messungen Menüpunkt im Dialogfeld Count / Größe angezeigt werden. (Bereich Bereich: 28,000-120,000 um 2 und Perimeter Bereich: 600-2,500 um). </li><li> Wenn ein Mutantenstamm ist wesentlich kleiner oder größer als andere Tiere auf dem Teller zu analysieren, erweitern den Bereich der Filtereinstellungen für die Objekterkennung, um die verschiedenen Größen der Stämme, bevor die Verfolgung von Tieren unterzubringen, so dass Einstellungen nicht geändert werden müssen Mitte der Analyse. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Füllen Sie das Tracking-Prozess, indem Sie auf Weiter im Dialogfeld Verfolgung. Visuell vergleichen die Ausgangsspuren mit dem Fortschritt der einzelnen Wurm in dem Film, um zu gewährleisten, dass jeder Wurm vertreten ist, es sei denn es gibt einen triftigen Grund, basierend auf den automatischen Filtereinstellungen, um sie auszuschließen. Spuren, die durch die Anwesenheit von nicht-bestätigten Schnecken Objekte, die die Größe Filterkriterien erfüllt hergestellt wurden manuell zu löschen. </li><li> Verwenden Sie die Software, um die Geschwindigkeit eines jeden Wurm zwischen den einzelnen Bildern berechnen (zurückgelegte Strecke für den Schwerpunkt eines Objekts pro 1 Sekunde zwischen den Rahmen) und zeigt die Durchschnittsgeschwindigkeit für jede Spur und die Durchschnittsgeschwindigkeit über alle Spuren für die Bevölkerung von Würmern in der Kupferring. Betrachten Sie diese endgültige Durchschnitt n = 1 in Bezug auf die experimentellen Studien sein. Exportieren Sie die Daten in ein Tabellenkalkulationsprogramm für statistische Auswertungen und Datenarchivierung. </li><li> Nachdem die Daten für das erste Ring auf der Platte aufgezeichnet wurden, bewegen Sie den ROI auf die nächste Ring undwiederholen Sie den Tracking-Prozess, ohne Änderung der Parameter. </li><li> Berechnen Sie die relative Geschwindigkeit der Fortbewegung durch: </li><li> Relativgeschwindigkeit (%) = behandelt (400 mM) Geschwindigkeit / unbehandelt (0 mM) Geschwindigkeit x 100. HINWEIS: Verschiedene genetische Manipulationen verändern oft die basale Fortbewegungsgeschwindigkeit der Tiere. Um die Wirkung von Ethanol auf die Fortbewegungsgeschwindigkeit von Tieren zu bestimmen und in der Lage, diese Effekte in verschiedenen Genotypen oder Bedingungen zu vergleichen, die Berechnung einer Relativgeschwindigkeit. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Die einfache Neurobiologie und genetische Werkzeuge zur Verfügung, in C. elegans machen die Schnecke ein ausgezeichnetes Modell, in dem die molekularen Grundlagen der Auswirkungen von Ethanol auf Eigenschaften zu untersuchen. Hier beschreiben wir einen Assay, der verwendet wurde, um mehrere molekulare und Umweltmediatoren der akuten Verhaltensreaktion zu Ethanol 8,10,20,24,25 identifizieren. Diese Methode erlaubt die Differenzierung und der gleichzeitigen Prüfung von zwei verschiedenen Ethanol Ansp...

Alcohol use disorders (AUD) are widespread and produce serious health, social, and economic problems. In humans, the susceptibility to developing an AUD is heavily influenced by both genetics and the environment1,2. A strong physiological predictor of abuse liability is the initial level of response (LR) to alcohol (ethanol) that is exhibited by na&#239;ve drinkers3-5. This LR phenotype is influenced by genetics and non-genetic components6. Determining the molecular mechanisms that influence the LR to ethanol is an important goal of the study of ethanol response behaviors.
The nematode, Caenorhabditis elegans, has been increasingly used as a model for studying the effects of ethanol on behavior7-9. There is strong molecular conservation in the machinery of nervous system function between worms and mammals, and several genes that have been shown to influence the LR to ethanol in worms have been shown to influence LR to ethanol in mammals10-16, and have been implicated in abuse liability in humans17-19. 
Ethanol intoxicates worms, which is reflected in a decrease in their locomotion speed. Several different laboratories have developed behavioral assays that differ in several ways, for example, the locomotion behavior that they study (crawling versus swimming11,12,14,20,21) or in the composition of the solutions in which the assays are performed (nematode growth medium versus Dent&#8217;s saline20,22). Interestingly, these diverse assays have yielded somewhat different dose response profiles for the effects of ethanol. These results have pointed to important differences in the underlying behaviors of crawling and swimming9,23, as well as a role for the environmental variable osmolarity in ethanol responses20, and have highlighted the importance of describing experimental detail of the various assays.
An assay to measure the acute effects of ethanol on crawling behavior is presented here. This assay has been used extensively to study the genetic and environmental influences on the LR to ethanol8,10,20,24,25. The mammalian LR phenotype is a composite of at least two components, initial sensitivity to ethanol and acute functional tolerance to ethanol26,27. In worms, the LR phenotype has been shown to be separable into these two components through the use of this behavioral assay. The influences of genetic and environmental manipulations on both phenotypes can be examined using this single assay. Importantly, these two phenotypes are genetically separable.

<table><tbody><tr><td>C. elegans strains</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 x 15 mm Petri plates, triple vented</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628161</td><td>Other plate brands will suffice.</td></tr><tr><td>NGM agar</td><td>Various</td><td></td><td>NaCl (3 g/L), agar (17 g/L), peptone (2.5 g/L), 1 ml cholesterol (5 mg/ml in ethanol), 1 ml (1 M) MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 1 ml (1 M) CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 25 ml (1 M) KPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, pH=6, 975 ml H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Various</td><td></td><td>&lt;I&gt;e.g.&lt;/I&gt;, Fisher Scientific #10300</td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C Incubator</td><td>Various</td><td></td><td>For drying agar</td></tr><tr><td>Digital balance</td><td>Various</td><td></td><td>For determining plate weights and agar volume</td></tr><tr><td>Copper rings</td><td>Plumbmaster</td><td>STK#35583 (48 cap thread gasket)</td><td>1.6 cm inner diameter, 1.8 cm outer diameter copper rings</td></tr><tr><td>100% ethanol</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>QImaging</td><td>RET-4000R-F-M-12</td><td>This camera has a large field of view.</td></tr><tr><td>Stereomicroscope with C-mount and 0.5X objective</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td>Discontinued model, M60 is current equivalent.</td></tr><tr><td>Light source</td><td>Schott</td><td>A08923</td><td>3&amp;rdquo;x3&amp;rdquo;&amp;nbsp; backlight for even illumination across the field of view</td></tr><tr><td>Imaging and tracking software</td><td>Media Cybernetics</td><td>ImagePro-Plus v6.0-6.3</td><td>Newer versions of the software have tracking functions.</td></tr></tbody></table>

an assay for measuring the effects of ethanol on the locomotion speed of caenorhabditis elegans

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the development of more effective treatments is the relative lack of understanding of the molecular underpinnings of the effects of ethanol on behavior. The nematode, Caenorhabditis elegans (C.&#160;elegans), provides a useful model in which to generate and test hypotheses about the molecular effects of ethanol. Here, we describe an assay that has been developed and used to examine the roles of particular genes and environmental factors in behavioral responses to ethanol, in which locomotion is the behavioral output. Ethanol dose-dependently causes an acute depression of crawling on an agar surface. The effects are dynamic; animals exposed to a high concentration demonstrate an initial strong depression of crawling, referred to here as initial sensitivity, and then partially recover locomotion speed despite the continued presence of the drug. This ethanol-induced behavioral plasticity is referred to here as the development of acute functional tolerance. This assay has been used to demonstrate that these two phenotypes are distinct and genetically separable. The straightforward locomotion assay described here is suitable for examining the effects of both genetic and environmental manipulations on these acute behavioral responses to ethanol in C.&#160;elegans.

Repräsentative Daten (Figur 1) aus mehreren verschiedenen Genotypen und ihrer gepaarten Bedienelemente vorgestellt 8,24; Daten wurden speziell ausgewählt, dass Highlight Unterschiede in den untersuch Tiere. Der Grad der Wirkung bei 10 Minuten der Exposition wird als die anfängliche Empfindlichkeit einer Dehnung, die auf der linken Achse in 1B-G dargestellt ist. Mutanten-Stämme mit einer Relativgeschwindigkeit größer als die Kontrolle bei 10 min werden als Ethanol bestä...

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An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

C. elegans is a useful model for studying the effects of ethanol on behavior. We present a behavioral assay that quantifies the effects of ethanol on the locomotion speed of crawling worms; both initial sensitivity and the development of acute functional tolerance to ethanol can be measured with this assay.

Ein Test zur Messung der Wirkung von Ethanol auf die Fortbewegungsgeschwindigkeit der<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the ...

an-assay-for-measuring-effects-ethanol-on-locomotion-speed

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

8.6K Aufrufe.  Virginia Commonwealth University. C. elegans is a useful model for studying the effects of ethanol on behavior. We present a behavioral assay that quantifies the effects of ethanol on the locomotion speed of crawling worms; both initial sensitivity and the development of acute functional tolerance to ethanol can be measured with this assay. 

Serie: An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

A Simple Way to Measure Ethanol Sensitivity in Flies

Low doses of ethanol cause flies to become hyperactive, while high doses are sedating. The sensitivity to ethanol-induced sedation of a given fly strain is correlated with that strain s ethanol preference, and therefore sedation is a highly relevant measure to study the genetics of alcohol responses and drinking. We demonstrate a simple way to expose flies to ethanol and measure its intoxicating effects. The assay we describe can determine acute sensitivity, as well as ethanol tolerance induced by repeat exposure. It does not require a technically involved setup, and can therefore be applied in any laboratory with basic fly culture tools.

A simple assay to measure the sedating effects of ethanol on Drosophila flies, based on the loss of righting reflex, is described.

Ein einfacher Weg zu Ethanol Empfindlichkeit in Flies Measure

Low doses of ethanol cause flies to become hyperactive, while high doses are sedating. The sensitivity to ethanol-induced sedation of a given fly strain ...

Forschung

Neurowissenschaften

Measuring Caenorhabditis elegans Sensitivity to the Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole

At the neuromuscular junction (NMJ), the binding of the excitatory neurotransmitter acetylcholine (ACh) to postsynaptic receptors leads to muscle contraction. As in vertebrate skeletal muscle, cholinergic signaling in the body wall muscles of the model organism Caenorhabditis elegans is required for locomotion. Exposure to levamisole, a pharmacological agonist of one class of ACh receptors on the body wall muscles, causes time-dependent paralysis of wild-type animals. Altered sensitivity to levamisole suggests defects in signaling at the NMJ or muscle function. Here, a protocol for a liquid levamisole assay performed on C. elegans grown in 24-well plates is presented. Vigorous swimming of the animals in liquid allows for the assessment and quantitation of levamisole-induced paralysis in hundreds of worms over a one-hour time period without requiring physical manipulation. This procedure can be used with both wild-type and mutants that have altered sensitivity to levamisole to demonstrate the functional consequences of altered signaling at the NMJ.

Measuring Caenorhabditis elegans Sensitivity to the Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole

The present protocol describes an assay to determine response to levamisole, a pharmacological agonist of one class of Caenorhabditis elegans acetylcholine receptors. In this liquid levamisole swim assay, researchers visually observe and quantitate the time-dependent paralysis of animals cultivated in 24-well plates.

Messung der Empfindlichkeit von Caenorhabditis elegans gegenüber dem Acetylcholinrezeptoragonisten Levamisol

At the neuromuscular junction (NMJ), the binding of the excitatory neurotransmitter acetylcholine (ACh) to postsynaptic receptors leads to muscle ...

Genetik

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C. elegans genome includes potential antipsychotic drug (APD) targets conserved in humans, including genes encoding proteins required for neurotransmitter synthesis and for synaptic structure and function. APD exposure produces developmental delay and/or lethality in nematodes in a concentration-dependent manner. These phenotypes are caused, in part, by APD-induced inhibition of pharyngeal pumping1,2. Thus, the developmental phenotype has a neuromuscular basis, making it useful for pharmacogenetic studies of neuroleptics. Here we demonstrate detailed procedures for testing APD effects on nematode development and pharyngeal pumping. For the developmental assay, synchronized embryos are placed on nematode growth medium (NGM) plates containing APDs, and the stages of developing animals are then scored daily. For the pharyngeal pumping rate assay, staged young adult animals are tested on NGM plates containing APDs. The number of pharyngeal pumps per unit time is recorded, and the pumping rate is calculated. These assays can be used for studying many other types of small molecules or even large molecules.

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Approaches for testing the effects of antipsychotic drugs (APDs) in Caenorhabditis elegans are demonstrated. Assays are described for testing drug effects on development and viability and on pharyngeal pumping rate. These methods are also applicable for pharmacogenetic experiments with drug classes other than APDs.

Methoden zur Untersuchung der Wirkmechanismen von Psychopharmaka in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

High-Throughput Method for Measuring Alcohol Sedation Time of Individual Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster provides an excellent model to study the genetic underpinnings of alcohol sensitivity. In contrast to studies in human populations, the Drosophila model allows strict control over genetic background, and virtually unlimited numbers of individuals of the same genotype can be reared rapidly under well-controlled environmental conditions without regulatory restrictions and at relatively low cost. Flies exposed to ethanol undergo physiological and behavioral changes that resemble human alcohol intoxication, including loss of postural control, sedation, and development of tolerance. Here, we describe a simple, low-cost, high-throughput assay for assessing alcohol sedation sensitivity in large numbers of single flies. The assay is based on video recording of single flies introduced without anesthesia in 24-well cell culture plates in a set-up that enables synchronous initiation of alcohol exposure. The system enables a single person to collect individual ethanol sedation data on as many as 2,000 flies within an 8 h work period. The assay can, in principle, be extended to assess the effects of exposure to any volatile substance and applied to measure effects of acute toxicity of volatiles on other insects, including other fly species.

High-Throughput Method for Measuring Alcohol Sedation Time of Individual Drosophila melanogaster

Current methods to measure alcohol sensitivity in Drosophila are designed to test groups of flies. We present a simple, low-cost, high-throughput assay for assessing alcohol sedation sensitivity in large numbers of single flies. The method does not require specialized tools and can be performed in any laboratory using common materials.

Hochdurchsatzmethode zur Messung der Alkoholsedationszeit einzelner Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster provides an excellent model to study the genetic underpinnings of alcohol sensitivity. In contrast to studies in human ...

Verhalten

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of diverse human diseases. Worms are particularly well-suited for high-throughput genetic and drug screens to gain deeper insight into therapeutic targets and therapies by exploiting their fast development cycle, large brood size, short lifespan, microscopic transparency, low maintenance costs, robust suite of genomic tools, mutant repositories, and experimental methodologies to interrogate both in vivo and ex vivo physiology. Worm locomotor activity represents a particularly relevant phenotype that is frequently impaired in mitochondrial disease, which is highly heterogeneous in causes and manifestations but collectively shares an impaired capacity to produce cellular energy. While a suite of different methodologies may be used to interrogate worm behavior, these vary greatly in experimental costs, complexity, and utility for genomic or drug high-throughput screens. Here, the relative throughput, advantages, and limitations of 16 different activity analysis methodologies were compared that quantify nematode locomotion, thrashing, pharyngeal pumping, and/or chemotaxis in single worms or worm populations of C. elegans at different stages, ages, and experimental durations. Detailed protocols were demonstrated for two semi-automated methods to quantify nematode locomotor activity that represent novel applications of available software tools, namely, ZebraLab (a medium-throughput approach) and WormScan (a high-throughput approach). Data from applying these methods demonstrated similar degrees of reduced animal activity occurred at the L4 larval stage, and progressed in day 1 adults, in mitochondrial complex I disease (gas-1(fc21)) mutant worms relative to wild-type (N2 Bristol) C. elegans. This data validates the utility for these novel applications of using the ZebraLab or WormScan software tools to quantify worm locomotor activity efficiently and objectively, with variable capacity to support high-throughput drug screening on worm behavior in preclinical animal models of mitochondrial disease.

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

This study presents protocols for two semi-automated locomotor activity analysis approaches in C. elegans complex I disease gas-1(fc21) worms, namely, ZebraLab (a medium-throughput assay) and WormScan (a high-throughput assay) and provide comparative analysis among a wide array of research methods to quantify nematode behavior and integrated neuromuscular function.

Vergleichende Analyse experimenteller Methoden zur Quantifizierung der Tieraktivität bei Caenorhabditis elegans Modellen der mitochondrialen Erkrankung

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of ...

An Inexpensive, Scalable Behavioral Assay for Measuring Ethanol Sedation Sensitivity and Rapid Tolerance in Drosophila

Alcohol use disorder (AUD) is a serious health challenge. Despite a large hereditary component to AUD, few genes have been unambiguously implicated in their etiology. The fruit fly, Drosophila melanogaster, is a powerful model for exploring molecular-genetic mechanisms underlying alcohol-related behaviors and therefore holds great promise for identifying and understanding the function of genes that influence AUD. The use of the Drosophila model for these types of studies depends on the availability of assays that reliably measure behavioral responses to ethanol. This report describes an assay suitable for assessing ethanol sensitivity and rapid tolerance in flies. Ethanol sensitivity measured in this assay is influenced by the volume and concentration of ethanol used, a variety of previously reported genetic manipulations, and also the length of time the flies are housed without food immediately prior to testing. In contrast, ethanol sensitivity measured in this assay is not affected by the vigor of fly handling, sex of the flies, and supplementation of growth medium with antibiotics or live yeast. Three different methods for quantitating ethanol sensitivity are described, all leading to essentially indistinguishable ethanol sensitivity results. The scalable nature of this assay, combined with its overall simplicity to set-up and relatively low expense, make it suitable for small and large scale genetic analysis of ethanol sensitivity and rapid tolerance in Drosophila.

An Inexpensive, Scalable Behavioral Assay for Measuring Ethanol Sedation Sensitivity and Rapid Tolerance in Drosophila

Straightforward assays for measuring ethanol sensitivity and rapid tolerance in Drosophila facilitate the use of this model organism for investigating these important ethanol-related behaviors. Here, a relatively simple, scalable assay for measuring ethanol sensitivity and rapid tolerance in flies is described.

Eine preiswerte, skalierbare Behavioral Assay zur Messung von Ethanol Sedierung Empfindlichkeit und Rapid Toleranz in<em&gt; Drosophila</em

Alcohol use disorder (AUD) is a serious health challenge. Despite a large hereditary component to AUD, few genes have been unambiguously implicated in ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans Chemotaxis-Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Biologie

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

Messung der Auswirkungen von Bakterien auf<em&gt; C. Elegans</em&gt; Verhalten Mit einem Ei Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

Touch Habituation Assay: A Method to Study Non-Associative Learning in C. elegans

Source: Mersha, M. D., et al. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/video/56771/long-term-behavioral-reproductive-consequences-embryonic-exposure-to">Long-term Behavioral and Reproductive Consequences of Embryonic Exposure to Low-dose Toxicants.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video introduces the touch habituation assay, a C. elegans behavioral method of assessing mechanosensation and quantifying time to habituation.

Touch Habituation Assay: Eine Methode zur Untersuchung des nicht-assoziativen Lernens bei C. elegans

Source: Mersha, M. D., et al. Long-term Behavioral and Reproductive Consequences of Embryonic Exposure to Low-dose Toxicants. J. Vis. Exp. (2018).
This ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Caenorhabditis elegans (Fadenwurm)

Electrotaxis Assay: A Method to Observe Locomotion in C. elegans

Source: Tong, J,&#160;et al. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/video/50226/microfluidic-based-electrotaxis-for-on-demand-quantitative-analysis">Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of&#160;Caenorhabditis elegans&#39; Locomotion.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2013).
Researchers can trigger on-demand movement in C. elegans by applying an electric field that worms sense and respond to.&#160; This video introduces electrotactic behavior and shows a sample protocol that is done in a microfluidic device.

Elektrotaxis-Assay: Eine Methode zur Beobachtung der Fortbewegung bei C. elegans

Source: Tong, J,&#160;et al. Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of&#160;Caenorhabditis elegans&#39; Locomotion.&#160;J. ...

Ein Test zur Messung der Wirkung von Ethanol auf die Fortbewegungsgeschwindigkeit der

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