Die Autoren danken Dr. Paul Witting und Frau Genevieve Fong für ihre Unterstützung bei der mRNA-Extraktion und PCR zu bestätigen, und die Garnett Passe und Rodney Williams Memorial Foundation für die Unterstützung.

Ethik Hinweise: Alle nachstehend beschriebenen Verfahren wurden von der University of Sydney Tierethikkommission genehmigt. 1. Tiere HINWEIS: 1 und 8-9 Monate alten Mäusen (C57BL / 6) aus dem Tier Resources Centre (Perth, Australien) erhalten. Die Mäuse wurden in der Bosch-Nager-Einrichtung an der Universität von Sydney untergebracht. <ol><li> Hausmäuse in Standardmäusekäfige auf einer 12/12 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus mit Zugang zu Futter und Wasser ad libitum. </li><li> Teilen Sie Mäusen in jeder Altersgruppe in der Nähe von Infrarot (NIR) behandelt oder scheinbehandelten (Kontroll-) Gruppen zum Vergleich. </li></ol> 2. nahes Infrarot (NIR) Bestrahlung und Sham-Behandlung <ol><li> Rasur der Haare am Kopf und Halsbereich der Maus mit einem elektrischen Rasierer so eng wie möglich, um schnelle Nachwachsen der Haare vor der Beendigung der Behandlungsregime zu verhindern. Um die pathogenfreien Zustand der Mäuse zu erhalten, verwenden Sie 70% EthanolInstrumente zwischen Rasieren Tiere und F10 Veterinärdesinfektionsmittel zwischen Tieren aus getrennten Käfigen reinigen. Tun Sie dies 2-3 Tage vor Beginn der Behandlung, damit Tiere nicht über abgewickelt. </li><li> Restrain Maus, indem das proximale Ende des Schwanzes und lassen Sie ihn in der Handfläche einer Hand oder Tisch entspannen, so dass Stress die zu falschen Ergebnissen führen könnte minimieren. </li><li> Halten Sie die NIR (670 nm) LED (Leuchtdiode) Gerät 1-2 cm von der exponierten (rasiert) Bereich und schalten Sie das Gerät für 90 Sekunden (Abbildung 1A). HINWEIS: Die Temperaturänderung als Ergebnis von 90 Sek Belichtung wurde mit &lt;0,2 ° C in 100 ml Wasser gemessen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2,2-2,3 für die Scheinbehandlung Gruppe von Tieren, aber lassen Sie das Gerät ausgeschaltet (Abbildung 1B). </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2,2-2,3 für den NIR-blockiert Behandlung Gruppe von Tieren, sondern decken Sie das Gerät mit Aluminiumfolie. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2,2-2,5 täglich um approximatE 24-Stunden-Intervallen an 5 aufeinander folgenden Tagen. </li><li> Entpacken Sie die vestibulären Sinnesepithel (3 Cristae und 1 utrikulären Makula) aus beiden Ohren am fünften Tag nach der Behandlung (siehe Abschnitt 3 unten). </li></ol> 3. Die Gewebeextraktion 20 <ol><li> Bereiten 300 ml einer Glycerinbasis künstliche cerebrospinale Flüssigkeit (ACSF), bestehend aus (in mM): 26 NaHCO 3, 11 Glucose, 250 Glycerin, 2,5 KCl, 1,2 NaH 2 PO 4, 1,2 MgCl 2, 2,5 CaCl 2. Vor der Zugabe von CaCl 2, Gas der Lösung mit Carbogen (95% O 2 und 5% CO 2), um einen pH von 7,4 herzustellen und vermeiden Calciumpräzipitation (Trübung). Kühlen Sie die Lösung in einen -80 ° C Gefrierschrank für 45 Minuten, so dass ein Eisbrei gebildet. </li><li> Bereiten Sie die RNA-Isolierung Lysepuffer in markierter Schraubverschluss Mikroröhrchen (stoppt das Knallen der Deckel bei Rohrdruckänderungen zwischen Einfrieren und Auftauen in flüssigem Stickstoff) nachden Anweisungen des Herstellers oder üblichen Laborpraxis. Haben flüssigem Stickstoff fertig in einem Aluminium Dewargefäß. HINWEIS: Verwenden Sie Schutzkleidung und eyeware beim Umgang mit flüssigem Stickstoff. Stellen Sie sicher, dass flüssiger Stickstoff befindet sich in einem gut belüfteten Raum verwendet, da das Volumen der Gasform ist etwa 700 mal so seiner flüssigen Form und können Ersticken verursachen. </li><li> Tief anaesthetize Mäuse mit Ketamin (400 mg / kg) über eine intraperitoneale Injektion. Lassen Sie die Hintergliedmaße Reflex vollständig als Hinweis darauf, dass Mäuse vollständig betäubt abklingen. </li><li> Enthaupten Mäusen mit scharfen Edelstahl Schere und einen Einschnitt entlang der sagittalen Haut des Schädels mit einer Rasierklinge (gerundet # 22). An dieser Stelle und in Schritte von 3,5 bis 3,9, halten das Schädeldach, Gehirn, und die zugrunde liegenden Vestibularapparat so kühl wie möglich durch die regelmäßige Anwendung der eiskalten ACSF über das Gewebe. </li><li> Mit dem spitzen Arm Standardmuster Schere einen small Einschnitt in den Schädel zu Lambda und entlang der Pfeilnaht geschnitten. </li><li> Schieben Sie den Arm von einem flachen Rongeure unter dem Scheitelbein hält die Klinge so nah wie möglich an der unteren Oberfläche des Knochens, ohne Ziehen des Gehirns. Sichern Sie und ziehen weg die Scheitelbein seitlich und das Hinterhauptbein hinten, bis das Gehirn ausgesetzt ist. </li><li> Verwenden Sie einen kleinen Spatel aus rostfreiem Stahl, und heben Sie das Gehirn weg von der vorderen und mittleren Schädelgrube, um die Gleichgewichtsnerv (CN VIII) aus. Durchschneiden den Nerv, um unnötige Spannung auf die primären afferenten Axone, die direkt innervieren die vestibulären Haarzellen zu verhindern. </li><li> Entfernen Sie das Gehirn in toto nach Durchtrennung des KN-VIII. </li><li> Beachten Sie die knöchernen Labyrinth mit der Cochlea und der peripheren vestibulären Organe in der mittleren Schädelgrube. Machen Sie zwei kleine Schnitte neben jeder knöchernen Labyrinth und Verbrauchsteuern die gesamte Struktur, indem Sie den vorderen Bogengangs und später ziehenVerbündeter. </li><li> Sofort tauchen exzidierten Labyrinthe in einer Sezieren Schale mit eiskaltem ACSF-Lösung (wie in Schritt 3.1 beschrieben), während kontinuierlich mit Carbogen Perfusion. </li><li> Unter einem Stereomikroskop, halten Sie durch das Labyrinth der Cochlea und befestigen Sie sie am Boden der Schale mit einer Pinzette. <ol><li> Verwenden Sie gerade feinen Pinzette, eine kleine Öffnung in der Knochen über der vorderen Bogengangs (SSC) Ampulle kratzen. </li><li> Vergrößern Sie vorsichtig diese Öffnung durch das Erreichen unmittelbar unter dem Knochen und schnippte nach außen weg von der Ampulle. Seien Sie vorsichtig, hier nicht schieben Pinzette in die Öffnung und Beschädigung des fragilen häutige Labyrinth unten. Fahren Sie auf diese Weise, bis der Utriculus, vorderen und seitlichen Ampullen alle ausgesetzt sind. Wenn möglich, entfernen Sie auch die hinteren Ampulle. </li></ol></li><li> Mit feinen Pinzette vorsichtig heben Sie den Utriculus und Ampullen aus dem knöchernen Labyrinth, bis sie vollständig gelöst sind. Wo es möglich ist, halten Sie siedurch die damit verbundenen Bogengänge um eine Beschädigung der Sinnesepithel. In einigen Fällen muss der proximale Teil des halbkreisförmigen membranöse Kanal mit Irisschere geschnitten, um die Ampullen aus dem Knochen zu lösen. </li><li> Sicher erfassen die Vestibularorgane zwischen der Spitze der Pinzette und Stelle in den Lysepuffer zuvor in Schritt 3.2 vorbereitet. Vorsichtig schwenken die Zange um im Puffer, um sicherzustellen, Vestibularorgane wurden aus der Zange abgelöst. Überprüfen Sie in diesem Fall, indem die Zange unter dem Stereomikroskop ist. <ol><li> Schrauben Sie den Deckel Mikrotubuli und frieren die Probe in flüssigem Stickstoff unmittelbar. </li></ol></li></ol> 4. RNA-Extraktion und RT-PCR <ol><li> Folgen Standardmethoden der Boten-RNA (mRNA) Extraktion gemäß den Anweisungen des Herstellers oder bevorzugte Laborprotokollen. HINWEIS: Ein handelsüblicher Kit, das Träger RNAs verwendet werden, um zu isolieren geringe Ausbeuten an mRNA wurde in diese verwendetProtokoll. Nieder Elutionsvolumina verwendet, um Endkonzentrationen von mRNA zu erhöhen. HINWEIS: Negative &quot;kein Enzym&quot; Kontrollen (NEC) und &quot;keine DNA-Template&quot; Kontrollen (NTC) müssen ebenfalls durchgeführt werden, um die Gültigkeit der beobachteten Effekte zu gewährleisten. </li><li> Anwenden von Standardverfahren der reversen Transkription von mRNA komplementäre DNA (cDNA) und die Amplifikation von Zielgenen 21-23. </li></ol>

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Die Autoren erklären, sie haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Die hier beschriebenen repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass kurze transkranielle Lieferung von NIR-Licht (90 sec / Tag für 5 Tage) ist ausreichend, um das Niveau der Antioxidantien Ausdruck in älteren Mäusen zu erhöhen, wenn mit scheinbehandelten Mäusen verglichen. Während abgegebene Wärme könnte eine Quelle der mitochondrialen und / oder neuronale Aktivierung darstellen, wie Ratte berichtet vestibulären Afferenzen 24 - unsere Messung von Wärme durch die NIR emittierten LED-Gerät war &lt;0,2 °...

Degressiven Leistung und anschließende Wasserfälle sind häufig, und leider oft kennzeichnenden Merkmale des natürlichen Alterungs 1. Die Auswirkungen dieser Rückgang ist sowohl physisch als auch sozial sein, und für ältere Menschen deutlich reduziert die Lebensqualität. Als Reaktion darauf haben physikalische Therapie und Rehabilitation im Mittelpunkt der Forschung im Bereich Wasserfälle gewesen, aber noch nicht mit der konsequenten Reduzierung der Prävalenz von wiederholten Stürzen in Verbindung gebracht. Zur gleichen Zeit, Arbeit untersucht Veränderungen im peripheren oder zentralen vestibulären Systems (die für das Gleichgewicht zu halten verantwortlich System) ist knapp, und mögliche therapeutische Strategien zugunsten solcher Systeme und die zugrunde liegenden Ursachen des Ungleichgewichts begrenzt. Jüngste Arbeiten auf altersbedingte neurodegenerative Erkrankungen einschließlich altersbedingter Makuladegeneration 2-4, Alzheimer-Krankheitsmodellen 5-8 und Parkinson 9-12 neuroprotektive Wirkungen si gezeigtenmple nicht-invasive Anwendung von Nahinfrarot (NIR). Ferner wird in dem Gleichgewichtsorgan, NIR verwendet wurde, um die Aktivität der vestibulären primären afferenten Neuronen in vitro 13 zu erhöhen. Während der Mechanismus der NIR-Licht ist nicht gut verstanden, haben die meisten Studien mit NIR vorgeschlagen, dass NIR stimuliert Mitochondrien Komplex IV (Cytochrom-c-Oxidase) 14-17 auf den Zellstoffwechsel zu erleichtern. In der vestibulären Sinnesepithel der subkutanen Platte vom Typ I Haarzellen dicht in Mitochondrien 18 und können als solche einen Wirkort für therapeutische NIR-Behandlung darstellen. Hier eine kurze, nicht-invasive Behandlung Regime transkraniell angewendet NIR, die verwendet werden können, um den Zellstoffwechsel zu messen (und implizit auch die Funktion der Mitochondrien) in der Maus vestibulären Sinnesepithel beschrieben. Ebenfalls diskutiert ist eine Vorbereitung des vestibulären Sinnesepithel und es wird gezeigt, dass NIR erhöht die Expression eines ubiquitous Antioxidans (Superoxiddismutase 1) im Riechepithel - früher gezeigt wichtig für Cochlea Haarzellüberleben 19 zu sein.

<table><tbody><tr><td>Quantum WARP 10</td><td>Quantum Devices</td><td>2070N030-A</td><td></td></tr><tr><td>Screw top microtubules</td><td>Quality Scientific Plastics</td><td>520-GRD-Q</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Parnell, Alexandria Australia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Standard pattern scissors</td><td>FST</td><td>14001-12</td><td></td></tr><tr><td>Carbon steel surgical blades #22</td><td>Livingstone</td><td>SBLDCL 22</td><td></td></tr><tr><td>Friedman-Pearson rongeurs</td><td>FST</td><td>16221-14</td><td></td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>A60S</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 SF forceps</td><td>FST</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Isolate II RNA Micro Kit</td><td>Bioline</td><td>BIO-52075</td><td></td></tr></tbody></table>

near infrared (nir) light increases expression of a marker of mitochondrial function in the mouse vestibular sensory epithelium

Strategien zur Dämpfung Rückgang der Abgleichfunktion mit zunehmendem Alter sind überwiegend konzentrierte sich auf physikalische Therapien einschließlich Balance Aufgaben und Bewegung. Allerdings sind diese Ansätze sich nicht auf die zugrunde liegenden Ursachen von Balance Rückgang. Verwendung von Mäusen wurde die Auswirkung von Licht im nahen Infrarot (NIR) auf den Stoffwechsel der Zellen in der vestibulären Sinnesepithel beurteilt. Die gesammelten Daten zeigen, dass diese einfache und sichere Intervention dieser gefährdeten Zellen vor den schädlichen Wirkungen der natürlichen Alterung schützen. mRNA wurde aus der isolierten peripheren vestibulären Sinnesepithel (crista ampullaris und utricular Makula) extrahiert und anschließend in einer cDNA-Bibliothek transkribiert. Diese Bibliothek wurde dann für die Expression von ubiquitären Antioxidans (SOD-1) sondiert. Antioxidans-Genexpression wurde dann verwendet, um den Zellstoffwechsel zu quantifizieren. Mit Hilfe der transkraniellen Lieferung von NIR bei jungen (4 Wochen) und älteren (8-9 Monate) Mäuse und eine kurze Behandlungsregime (90 sec / Tag für 5 days), diese Arbeit legt nahe, NIR allein kann ausreichen, um die Funktion der Mitochondrien im vestibulären Sinnesepithel verbessern. Da gibt es gegenwärtig keine verfügbaren, preiswert, nicht-invasive Therapieverfahren zur vestibulären Haarzellfunktion verbessern, die Anwendung von externen NIR-Strahlung stellt eine mögliche Strategie, um die Auswirkungen der Alterung auf den Zellstoffwechsel inder vestibulären Sinnesepithel entgegenzuwirken.

So vergleichen Sie die Auswirkungen der NIR-Behandlung bei jungen (4 Wochen) und älteren (8-9 Monate) Mäusen messen wir die Expression von antioxidativen Superoxid-Dismutase 1 (SOD-1) in junge (n = 16) und ältere (n = 20) Mäuse, die NIR-behandelten scheinbehandelten oder NIR-blockiert waren. Figur 2 zeigt eine signifikante Zunahme der β-Actin-normalisierten SOD-1-Expression von mehr als 2-fach in jungen NIR-behandelten Tieren im Vergleich zu jungen scheinbehandelten Tieren (p &lt;0,01) und junge NI...

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Near Infrared NIr Light Increases Expression of a Marker of Mitochondrial Function in the Mouse Vestibular Sensory Epithelium

Mitochondriale Dysfunktion ist ein Markenzeichen von Zellalterung. Dieser Aufsatz benutzt nicht-invasive nahen Infrarot (NIR) Behandlung die Mitochondrienfunktion im alternden Maus vestibulären Sinnesepithel verbessern.

Nahes Infrarot (NIR) Licht Erhöht Ausdruck einer Markierung der Funktion der Mitochondrien im Maus Vestibular Sinnesepithel

Strategies for attenuating decline in balance function with increasing age are predominantly focused on physical therapies including balance tasks and ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Near Infrared (NIr) Light Increases Expression of a Marker of Mitochondrial Function in the Mouse Vestibular Sensory Epithelium

9.9K Aufrufe.  University of Sydney.  Mitochondriale Dysfunktion ist ein Markenzeichen von Zellalterung. Dieser Aufsatz benutzt nicht-invasive nahen Infrarot (NIR) Behandlung die Mitochondrienfunktion im alternden Maus vestibulären Sinnesepithel verbessern. 

Serie: Near Infrared NIr Light Increases Expression of a Marker of Mitochondrial Function in the Mouse Vestibular Sensory Epithelium

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured neurons for extended durations1-3. This is now possible through the use of vital dyes and fluorescent proteins with which cytoskeletal components, organelles, and other structures in living cells can be labeled and then visualized via dynamic fluorescence microscopy. For example, in embryonic chicken sympathetic neurons, mitochondrial movement was characterized using the vital dye rhodamine 1234. In another study, mitochondria were visualized in rat forebrain neurons by transfection of mitochondrially targeted eYFP5. However, imaging of primary neurons over minutes, hours, or even days presents a number of issues. Foremost among these are: 1) maintenance of culture conditions such as temperature, humidity, and pH during long imaging sessions; 2) a strong, stable fluorescent signal to assure both the quality of acquired images and accurate measurement of signal intensity during image analysis; and 3) limiting exposure times during image acquisition to minimize photobleaching and avoid phototoxicity.
Here, we describe a protocol that permits the observation, visualization, and analysis of mitochondrial movement in cultured hippocampal neurons with high temporal resolution and under optimal life support conditions. We have constructed an affordable stage-top incubator that provides good temperature regulation and atmospheric gas flow, and also limits the degree of media evaporation, assuring stable pH and osmolarity. This incubator is connected, via inlet and outlet hoses, to a standard tissue culture incubator, which provides constant humidity levels and an atmosphere of 5-10% CO2/air. This design offers a cost-effective alternative to significantly more expensive microscope incubators that don't necessarily assure the viability of cells over many hours or even days. To visualize mitochondria, we infect cells with a lentivirus encoding a red fluorescent protein that is targeted to the mitochondrion. This assures a strong and persistent signal, which, in conjunction with the use of a stable xenon light source, allows us to limit exposure times during image acquisition and all but precludes photobleaching and phototoxicity. Two injection ports on the top of the stage-top incubator allow the acute administration of neurotransmitters and other reagents intended to modulate mitochondrial movement. In sum, lentivirus-mediated expression of an organelle-targeted red fluorescent protein and the combination of our stage-top incubator, a conventional inverted fluorescence microscope, CCD camera, and xenon light source allow us to acquire time-lapse images of mitochondrial transport in living neurons over longer durations than those possible in studies deploying conventional vital dyes and off-the-shelf life support systems.

We describe a protocol that allows imaging of mitochondria in living neurons via fluorescence microscopy over long durations. Imaging over extended periods is accomplished through lentivirus-mediated expression of a mitochondrially targeted fluorescent protein and use of an inexpensive stage-top incubator that was designed and built in our laboratory.

Neuromodulation und Mitochondriale Transport: Live Imaging in Hippocampus-Neuronen über lange Zeiträume

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Forschung

Neurowissenschaften

An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy

Understanding vestibular hair cells function under normal conditions, or how trauma, disease, and aging disrupt this function is a vital step in the development of preventative approaches and/or novel therapeutic strategies. However, the majority of studies looking at abnormal vestibular function have not been at the cellular level but focused primarily on behavioral assays of vestibular dysfunction such as gait analyses and vestibulo-ocular reflex performance. While this work has yielded valuable data about what happens when things go wrong, little information is gleaned regarding the underlying causes of dysfunction. Of the studies that focus on the cellular and subcellular processes that underlie vestibular function, most have relied on acutely isolated hair cells, devoid of their synaptic connections and supporting cell environment. Therefore, a major technical challenge has been access to the exquisitely sensitive vestibular hair cells in a preparation that is least disrupted, physiologically. Here we demonstrate a semi-intact preparation of the mouse vestibular sensory epithelium that retains the local micro-environment including hair cell/primary afferent complexes.

Analysis of vestibular hair cell function is complicated by their location deep within the hardest part of the skull, the petrous temporal bone. Most functional hair cell studies have used acutely isolated hair cells. Here we describe a semi-intact preparation of mouse vestibular epithelium for electrophysiological and two-photon microscopy studies.

Eine Isolierte Semi-intakt Vorbereitung der Maus Vestibuläre Sinnesepithel für Elektrophysiologie und hochauflösende Zwei-Photonen-Mikroskopie

Understanding vestibular hair cells function  under normal conditions, or how trauma, disease, and aging disrupt this  function is a vital step in the ...

In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

The rodent visual system encompasses retinal ganglion cells and their axons that form the optic nerve to enter thalamic and midbrain centers, and postsynaptic projections to the visual cortex. Based on its distinct anatomical structure and convenient accessibility, it has become the favored structure for studies on neuronal survival, axonal regeneration, and synaptic plasticity. Recent advancements in MR imaging have enabled the in vivo visualization of the retino-tectal part of this projection using manganese mediated contrast enhancement (MEMRI). Here, we present a MEMRI protocol for illustration of the visual projection in mice, by which resolutions of (200 &#181;m)3 can be achieved using common 3 Tesla scanners. We demonstrate how intravitreal injection of a single dosage of 15 nmol MnCl2 leads to a saturated enhancement of the intact projection within 24 hr. With exception of the retina, changes in signal intensity are independent of coincided visual stimulation or physiological aging. We further apply this technique to longitudinally monitor axonal degeneration in response to acute optic nerve injury, a paradigm by which Mn2+ transport completely arrests at the lesion site. Conversely, active Mn2+ transport is quantitatively proportionate to the viability, number, and electrical activity of axon fibers. For such an analysis, we exemplify Mn2+ transport kinetics along the visual path in a transgenic mouse model (NF-&#954;B p50KO) displaying spontaneous atrophy of sensory, including visual, projections. In these mice, MEMRI indicates reduced but not delayed Mn2+ transport as compared to wild type mice, thus revealing signs of structural and/or functional impairments by NF-&#954;B mutations.
In summary, MEMRI conveniently bridges in vivo assays and post mortem histology for the characterization of nerve fiber integrity and activity. It is highly useful for longitudinal studies on axonal degeneration and regeneration, and investigations of mutant mice for genuine or inducible phenotypes.

In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

This video illustrates a method, using a clinical 3 T scanner, for contrast-enhanced MR imaging of the na&#239;ve mouse visual projection and for repetitive and longitudinal in vivo studies of optic nerve degeneration associated with acute optic nerve crush injury and chronic optic nerve degeneration in knock-out mice (p50KO).

In-vivo-Imaging von Optic Nerve Fiber Integrität von Contrast-Enhanced MRI in Mäuse

The rodent visual system encompasses retinal ganglion cells and their axons that form the optic nerve to enter thalamic and midbrain centers, and ...

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a wide variety of disorders including metabolic diseases, premature aging syndromes, and neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD). Maintenance of mitochondrial health depends on mitochondrial biogenesis and the efficient clearance of dysfunctional mitochondria through mitophagy. Experimental methods to accurately detect autophagy/mitophagy, especially in animal models, have been challenging to develop. Recent progress towards the understanding of the molecular mechanisms of mitophagy has enabled the development of novel mitophagy detection techniques. Here, we introduce several versatile techniques to monitor mitophagy in human cells, Caenorhabditis elegans (e.g., Rosella and DCT-1/ LGG-1 strains), and mice (mt-Keima). A combination of these mitophagy detection techniques, including cross-species evaluation, will improve the accuracy of mitophagy measurements and lead to a better understanding of the role of mitophagy in health and disease.

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Mitophagy, the process of clearing damaged mitochondria, is necessary for mitochondrial homeostasis and health maintenance. This article presents some of the latest mitophagy detection methods in human cells, Caenorhabditis elegans, and mice.

In Vitro und In Vivo Nachweis von Mitophagy in menschlichen Zellen, C. Elegansund Mäuse

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...

Medizin

A Protocol for Transcranial Photobiomodulation Therapy in Mice

Transcranial photobiomodulation is a potential innovative noninvasive therapeutic approach for improving brain bioenergetics, brain function in a wide range of neurological and psychiatric disorders, and memory enhancement in age-related cognitive decline and neurodegenerative diseases. We describe a laboratory protocol for transcranial photobiomodulation therapy (PBMT) in mice. Aged BALB/c mice (18 months old) are treated with a 660 nm laser transcranially, once daily for 2 weeks. Laser transmittance data shows that approximately 1% of the incident red light on the scalp reaches a 1 mm depth from the cortical surface, penetrating the dorsal hippocampus. Treatment outcomes are assessed by two methods: a Barnes maze test, which is a hippocampus-dependent spatial learning and memory task evaluation, and measuring hippocampal ATP levels, which is used as a bioenergetics index. The results from the Barnes task show an enhancement of the spatial memory in laser-treated aged mice when compared with age-matched controls. Biochemical analysis after laser treatment indicates increased hippocampal ATP levels. We postulate that the enhancement of memory performance is potentially due to an improvement in hippocampal energy metabolism induced by the red laser treatment. The observations in mice could be extended to other animal models since this protocol could potentially be adapted to other species frequently used in translational neuroscience, such as rabbit, cat, dog, or monkey. Transcranial photobiomodulation is a safe and cost-effective modality which may be a promising therapeutic approach in age-related cognitive impairment.

Photobiomodulation therapy is an innovative noninvasive modality for the treatment of a wide range of neurological and psychiatric disorders and can also improve healthy brain function. This protocol includes a step-by-step guide to performing brain photobiomodulation in mice by transcranial light delivery, which can be adapted for use in other laboratory rodents.

Ein Protokoll für die transkranielle Photobiomodulation Therapie bei Mäusen

Transcranial photobiomodulation is a potential innovative noninvasive therapeutic approach for improving brain bioenergetics, brain function in a wide ...

Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator

Mitochondrial redox homeostasis is important for neuronal viability and function. Although mitochondria contain several redox systems, the highly abundant thiol-disulfide redox buffer glutathione is considered a central player in antioxidant defenses. Therefore, measuring the mitochondrial glutathione redox potential provides useful information about mitochondrial redox status and oxidative stress. Glutaredoxin1-roGFP2 (Grx1-roGFP2) is a genetically encoded, green fluorescent protein (GFP)-based ratiometric indicator of the glutathione redox potential that has two redox-state-sensitive excitation peaks at 400 nm and 490 nm with a single emission peak at 510 nm. This article describes how to perform confocal live microscopy of mitochondria-targeted Grx1-roGFP2 in primary hippocampal and cortical neurons. It describes how to assess steady-state mitochondrial glutathione redox potential (e.g., to compare disease states or long-term treatments) and how to measure redox changes upon acute treatments (using the excitotoxic drug N-methyl-D-aspartate (NMDA) as an example). In addition, the article presents co-imaging of Grx1-roGFP2 and the mitochondrial membrane potential indicator, tetramethylrhodamine, ethyl ester (TMRE), to demonstrate how Grx1-roGPF2 can be multiplexed with additional indicators for multiparametric analyses. This protocol provides a detailed description of how to (i) optimize confocal laser scanning microscope settings, (ii) apply drugs for stimulation followed by sensor calibration with diamide and dithiothreitol, and (iii) analyze data with ImageJ/FIJI.

This article describes a protocol to determine differences in basal redox state and redox responses to acute perturbations in primary hippocampal and cortical neurons using confocal live microscopy. The protocol can be applied to other cell types and microscopes with minimal modifications.

Live-Bildgebung des mitochondrialen Glutathion-Redox-Zustands in primären Neuronen unter Verwendung eines ratiometrischen Indikators

Mitochondrial redox homeostasis is important for neuronal viability and function. Although mitochondria contain several redox systems, the highly abundant ...

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode&#8217;s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.

Ein screenbaren<em&gt; In-vivo-</em&gt; Assay für Mitochondriale Modulatoren Verwendung transgener Bioluminescent<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and ...

Biologie

Measurement of Mitochondrial Membrane Potential In Vivo using a Genetically Encoded Voltage Indicator

Mitochondrial membrane potential (MMP, &#916;&#936;m) is critical for mitochondrial functions, including ATP synthesis, ion transport, reactive oxygen species (ROS) generation, and the import of proteins encoded by the nucleus. Existing methods for measuring &#916;&#936;m typically use lipophilic cation dyes, such as Rhodamine 800 and tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM), but these are limited by low specificity and are not well-suited for in vivo applications. To address these limitations, we have developed a novel protocol utilizing genetically encoded voltage indicators (GEVIs). Genetically encoded voltage indicators (GEVIs), which generate fluorescent signals in response to membrane potential changes, have demonstrated significant potential for monitoring plasma membrane and neuronal potentials. However, their application to mitochondrial membranes remains unexplored. Here, we developed protein-based mitochondrial-targeted GEVIs capable of detecting &#916;&#936;m fluctuations in cells and the motor cortex of living animals. The mitochondrial potential indicator (MPI)offers a non-invasive approach to study &#916;&#936;m dynamics in real-time, providing a method to investigate mitochondrial function under both normal and pathological conditions.

This protocol describes the application of mitochondria-targeted genetically encoded voltage indicators (GEVIs). These GEVIs offer a significant advantage over traditional mitochondrial membrane potential dyes by enabling specific, in vivo, and real-time monitoring of mitochondrial membrane potential.

Messung des mitochondrialen Membranpotentials in vivo mit Hilfe eines genetisch kodierten Spannungsindikators

Mitochondrial membrane potential (MMP, &#916;&#936;m) is critical for mitochondrial functions, including ATP synthesis, ion transport, reactive oxygen ...

Bildgebung von mitochondrialem Peroxid in lebenden Hefezellen mit mtHyper7

Imaging of mtHyPer7, a Ratiometric Biosensor for Mitochondrial Peroxide, in Living Yeast Cells

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, cancer, and normal aging. Here, an approach is described to assess mitochondrial function in living yeast cells at cellular and subcellular resolutions using a genetically encoded, minimally invasive, ratiometric biosensor. The biosensor, mitochondria-targeted HyPer7 (mtHyPer7), detects hydrogen peroxide (H2O2) in mitochondria. It consists of a mitochondrial signal sequence fused to a circularly permuted fluorescent protein and the H2O2-responsive domain of a bacterial OxyR protein. The biosensor is generated and integrated into the yeast genome using a CRISPR-Cas9 marker-free system, for&#160;more consistent expression compared to plasmid-borne constructs.
mtHyPer7 is quantitatively targeted to mitochondria, has no detectable effect on yeast growth rate or mitochondrial morphology, and provides a quantitative readout for mitochondrial H2O2 under normal growth conditions and upon exposure to oxidative stress. This protocol explains how to optimize imaging conditions using a spinning-disk confocal microscope system and perform quantitative analysis using freely available software. These tools make it possible to collect rich spatiotemporal information on mitochondria both within cells and among cells in a population. Moreover, the workflow described here can be used to validate other biosensors.

Autor im Rampenlicht: Advancing Mitochondrial Research - mtHyper7 Biosensor für die subzelluläre Analyse 

Hydrogen peroxide (H2O2) is both a source of oxidative damage and a signaling molecule. This protocol describes how to measure mitochondrial H2O2 using mitochondria-targeted HyPer7 (mtHyPer7), a genetically encoded ratiometric biosensor, in living yeast. It details how to optimize imaging conditions and perform quantitative cellular and subcellular analysis using freely available software.

Bildgebung von mtHyPer7, einem ratiometrischen Biosensor für mitochondriales Peroxid, in lebenden Hefezellen

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, ...

Nahes Infrarot (NIR) Licht Erhöht Ausdruck einer Markierung der Funktion der Mitochondrien im Maus Vestibular Sinnesepithel

Zusammenfassung

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Neuromodulation und Mitochondriale Transport: Live Imaging in Hippocampus-Neuronen über lange Zeiträume

Eine Isolierte Semi-intakt Vorbereitung der Maus Vestibuläre Sinnesepithel für Elektrophysiologie und hochauflösende Zwei-Photonen-Mikroskopie

In-vivo-Imaging von Optic Nerve Fiber Integrität von Contrast-Enhanced MRI in Mäuse

In Vitro und In Vivo Nachweis von Mitophagy in menschlichen Zellen, C. Elegansund Mäuse

Ein Protokoll für die transkranielle Photobiomodulation Therapie bei Mäusen

Live-Bildgebung des mitochondrialen Glutathion-Redox-Zustands in primären Neuronen unter Verwendung eines ratiometrischen Indikators

Ein screenbaren

Messung des mitochondrialen Membranpotentials in vivo mit Hilfe eines genetisch kodierten Spannungsindikators

Bildgebung von mtHyPer7, einem ratiometrischen Biosensor für mitochondriales Peroxid, in lebenden Hefezellen

Bildgebung von mtHyPer7, einem ratiometrischen Biosensor für mitochondriales Peroxid, in lebenden Hefezellen