Das übergeordnete Ziel des folgenden experimentellen Protokolls ist die Durchführung einer transkraniellen Photobiomodulationstherapie mit niedrigen Roten Laserspiegeln bei Mäusen. Dies wird durch den direkten Kontakt der Lasersonde auf den Mauskopf erreicht. In einem ersten Schritt, um die Laserlichtdurchlässigkeit zu bewerten, sezieren Sie das Hirngewebe vorsichtig aus dem Schädel heraus.
Und dann messen Sie die übertragene Lichtkraft durch den Schädel plus die Kopfhaut und eine Millimeter Scheibe des Gehirngewebes. Im Therapiebereich können Sie die Spitze der Lasersonde direkt auf der Kopfhaut am Bregma kontaktieren. Diese räumlichen Lern- und Gedächtnisfunktionen werden von Barnes Labyrinth-Aufgabe ausgewertet.
Anschließend werden hippocampale ATP-Werte durch die spektrophotometrische Methode bestimmt. Laserübertragungsdaten zeigen, dass etwa 1% des vorgängerischen Lichts auf der Kopfhautoberfläche einen Millimeter Tiefe von der kortikalen Oberfläche erreichte. Die Ergebnisse der Barnes-Labyrinth-Aufgabe zeigen eine Verbesserung des räumlichen Gedächtnisses bei den gealterten Mäusen nach zwei Wochen der transkraniellen roten Laserbehandlung.
Auch deuten die Ergebnisse auf einen erhöhten Hippocampus-ATP-Spiegel bei laserbehandelten gealterten Mäusen hin. Transkranielle Photobiomodulation ist ein nicht-invasiver therapeutischer Ansatz zur Behandlung einer Vielzahl von neurologischen und psychiatrischen Störungen und zur Verbesserung der gesunden Gehirnfunktion. Tatsächlich wird angenommen, dass die Photobiomodulationstherapie eine Photodissoziation des Stickstoffmonoxids aus der Cytochrom-c-Oxidase in den Mitochondrien verursacht.
Diese wiederum erhöhen den mitrochondrialen Elektronentransport, was letztlich zu einer Steigerung der ATP-Produktion führt. Diese Methode ist ein sicherer und kostengünstiger Lichtabgabeansatz, der durch Strahlung des Kopfes mit externen Lichtquellen wie Lasern und Leuchtdioden durchgeführt wird. Fast alle transkraniellen Photobiomodulationsverfahren werden mit rotem bis nahinfrarotem Licht bei wellenlänged von 600 bis 1100 Nanometer angewendet, eine Leistung von einem bis 500 Milliwatt und der Einflimmervon von einem bis 20 Joule pro Zentimeter Quadrat.
In einer tief anästhesierten Maus, sezieren Sie vorsichtig das Hirngewebe aus dem Schädel. Fixieren Sie zunächst das intakte Hirngewebe auf einem Agarose-Gel und bereiten Sie alle erforderlichen Materialien wie Natriumchlorid und Kleber vor. Dann eine dünne Schicht Kleber auf der Oberfläche des Vibratome-Montageblocks verteilen.
Befestigen Sie den Agarose-Block vorsichtig und passen Sie seine Position an. Passen Sie das Vibratom-Blatt leicht an die obere Oberfläche des Blocks an, und zeichnen Sie den Zählerwert auf. Füllen Sie den Vibramtank mit eiskalter normaler Herzlösung.
Passen Sie die Geschwindigkeit und Vibrationsfrequenz des Vibratom an, und ändern Sie den Zähler auf den entsprechenden Wert, um eine Scheibendicke von einem Millimeter zu erhalten. Schalten Sie das Vibratome ein und drücken Sie den Startknopf und schneiden Sie das Gehirn quer in eine Scheibe mit einer Dicke von einem Millimeter. Fügen Sie zunächst einen Tropfen Wasser auf die optische Glasoberfläche.
Dann legen Sie die Gehirnscheibe auf das Glas. Fügen Sie den Tropfen Wasser darauf, und legen Sie vorsichtig das zweite optische Glas. Beachten Sie, dass der Probe und den Glasgrenzen ein Tropfen Wasser hinzugefügt werden sollte, um Gewebetrocknung und auch Lichtstreuung von rauen Oberflächen zu verhindern.
Übertragen Sie Proben in das optische Labor. Richten Sie die optischen Geräte ein, und schalten Sie den Netzteil ein. Tragen Sie eine Schutzbrille, bevor Sie mit dem Lasergerät arbeiten.
Schalten Sie den Laser ein und lassen Sie den Strahl auf den Spiegel fokussieren, um den Strahl zum aktiven Bereich der Fotodiode zu führen. Platzieren Sie zunächst zwei leere optische Gläser auf der Oberfläche des Leistungsmessers, und lesen Sie die übertragene Lichtleistung vom Bildschirm aus. Entfernen Sie die leere Brille und legen Sie die Hirnprobe vorsichtig auf die Oberfläche des Leistungsmessers, und fokussieren Sie den Strahl auf den jeweiligen Bereich des Gewebes, und lesen Sie die übertragene Leistung.
Legen Sie dieses Mal ein leeres optisches Glas auf die Oberfläche des Leistungsmessers und lesen Sie die übertragene Lichtleistung. Entfernen Sie dann das Blankoglas und legen Sie ein optisches Glas mit frischem Schädel und skaliertem Gewebe auf die Oberfläche des Leistungsmessers. Konzentrieren Sie den Strahl auf das Bregma und lesen Sie die übertragene Leistung.
Schalten Sie schließlich das Lasergerät und den Netzteil aus. Der Therapieabschnitt des aktuellen Protokolls umfasst die Anwendung der Laserinstrumente der Klasse 3B und erfordert entsprechende Schulungs- und Sicherheitsrichtlinien. Um die Tiere an die neue Umgebung anzupassen, bringen Sie Mäuse aus ihren heimischen Käfigen ca. 20 Minuten vor Beginn der Behandlung in den Therapieraum.
Stecken Sie zunächst den Lasergerätestecker in einen elektrischen Protektor. Bedecken Sie die Spitze der Lasersonde mit einer transparenten Nylonfolie, um Kratzer an der Sondenoberfläche zu vermeiden. Schließen Sie die Lasersonde vorsichtig an den Kanal des Geräts an.
Tragen Sie eine Schutzbrille, bevor Sie mit dem Lasergerät arbeiten. Schalten Sie das Lasergerät ein und warten Sie einige Sekunden auf das Aufwärmen. Nachdem Sie das Laser Ready-Zeichen auf dem Gerätepanel beobachtet haben, passen Sie die Behandlungsparameter einschließlich Bestrahlungszeit und Betriebsmodus an.
Bestimmen Sie vor Beginn der Behandlung die durchschnittliche Laserleistung, indem Sie die Spitze der Sonde mit dem aktiven Bereich des Leistungsmessers am Gerät in Berührung kommen. Im aktuellen Protokoll wird die Lasersonde auf der Bregma-Zone platziert, die etwa drei Millimeter rostral zu einer Linie zwischen der vorderen Basis der Ohren gezeichnet ist. Um eine direkte Strahlung auf die Augen des Tieres zu vermeiden, legen Sie zunächst die Spitze der Lasersonde auf den Kopf, schalten Sie dann den Laser ein und halten Sie die Sonde bis zum Abschluss der Bestrahlung stabil.
Schalten Sie dann das Lasergerät aus, und trennen Sie die Sonde vom Gerät. Reinigen Sie am Ende des Verfahrens die Lasersonde mit einem geeigneten optischen Reiniger. Die räumliche Lern- und Gedächtnisaufgabe wird in einem Barnes-Labyrinth ausgeführt.
Legen Sie zuerst das Zeichen nicht an der Außenseite der Tür des Taskraums ein. Fügen Sie visuelle räumliche Hinweise an die Perimeterwände an. Positionieren Sie eine Videokamera über der Labyrinthplattform.
Reinigen Sie die Oberfläche der Labyrinthplattform mit 70% Ethanol, um unerwünschte geruchssüße Hinweise zu entfernen. Fügen Sie eine kleine Menge Bettwäsche aus dem Hauskäfig des Tieres in die Fluchtbox, um als olfaktorischer Hinweis zu dienen. Bevor Sie mit der Aufgabe beginnen, legen Sie jede Maus in den neuen Käfig und übertragen Sie den Käfig in den Barnes-Labyrinthraum.
Um sich daran zu gewöhnen, lassen Sie das Tier 30 Minuten vor der Aufgabe im Raum bleiben. Dann entfernen Sie die Maus aus ihrem Käfig und legen Sie das Tier vorsichtig in die Fluchtbox, und lassen Sie es dort für eine Minute bleiben. Nach einer Minute, entfernen Sie vorsichtig die Maus aus der Fluchtbox, legen Sie das Tier in die Mitte der Arena, und legen Sie die Startkammer darauf.
Nach zehn Sekunden heben Sie die Startkammer an und lassen Sie das Tier die Arena für drei Minuten erkunden. Bewegen Sie sich ruhig in den Computerbereich, tragen Sie Ohrenschützer und lösen Sie einen negativen akustischen Reiz aus, der aus einem lauten weißen Rauschen besteht. Beginnen Sie dann mit dem Videotaping und beobachten Sie das Verhalten des Tieres auf dem Computermonitor.
Beachten Sie, dass ein schwarzes Labyrinth zum Testen weißer Mäuse verwendet werden sollte. Auch sollte eine schwarze Matte unter dem Labyrinth in der Fall Tracking-System-Software verwendet werden soll. Richten Sie das Video-Tracking-Softwareprogramm ein und extrahieren Sie die Parameter, die von Interesse sind, aus den aufgenommenen Videos.
Für eine biochemische Bewertung sezieren Sie Hippocampus-Gewebe, homogenisieren Sie sie in einem Probenpuffer, zentrifugieren Sie es und bewerten Sie dann ihre ATP-Werte mit der spektrophotometrischen Methode. Die 660 Nanometer Laserlichtübertragung durch den Schädel plus Kopfhaut der gealterten Mäuse betrug etwa 16%Auch der Wert von etwa 10% wurde als Laserdurchlässigkeit durch eine ein Millimeter scheibe gealtertes Hirngewebe gemessen. Im Offenen Feldtest gab es keine statistisch signifikanten Unterschiede im Protokoll der motorischen Aktivität zwischen allen Versuchsgruppen.
Die Daten aus der Labyrinthaufgabe von Barnes zeigten, dass die Latenzzeiten der gealterten Kontrolltiere offensichtlich länger sind als die der jungen Kontrollgruppe am dritten und vierten Tag der Trainingseinheit. Die rote Laserbehandlung reduzierte jedoch die Latenzzeit am vierten Tag signifikant. In der Requisiten-Probesitzung verbringen gealterte Kontrolltiere deutlich kürzere Zeit im Zielquadranten als die Jungkontrolltiere.
Die laserbehandelten gealterten Mäuse verbrachten jedoch signifikant längere Zeit in den Zielquadranten als im Alter von Kontrollmäusen. Die Daten der Hippocampus-Bioenergetik zeigen einen Rückgang der ATP-Spiegel bei den gealterten Kontrolltieren. Andererseits erhöht die rote Laserbehandlung den durchschnittlichen ATP-Gehalt im Hippocampus der gealterten Mäuse deutlich.
Wir beschrieben das Protokoll für die Durchführung eines transkraniellen Photobiomudulationsverfahrens bei Mäusen. Unser Protokoll kann an alle anderen Labortiere angepasst werden, die häufig im bereichder Neurowissenschaften verwendet werden, wie Kaninchen, Hund, Affe, etc. Basierend auf unserer Untersuchung, niedrige Niveaus des roten Lichts kann Hippocampus-Störung im gealterten Gehirn durch die Steigerung der ATP-Produktion, die in einer verbesserten räumlichen Gedächtnisfunktion reflektiert wird erholen.
Bei dieser Methode, basierend darauf, welche Hirnregionen durch Pathologie beeinflusst werden, müssen mehrere physikalische und Behandlungsparameter, einschließlich Bestrahlungszeit, Behandlungsintervall, angewandte Ausstrahlung und Einflansch, optimal angepasst werden, um bessere Ergebnisse zu erzielen. Transkranielle Photobiomodulationstherapie wird als vielversprechender Ansatz zur Verbesserung des Hirnstoffwechsels und kognitive Verbesserung vorgeschlagen, die eine potenzielle Strategie für die altersbedingte kognitive Abnahme und neurodegenerative Erkrankungen sein könnte.
