Die Autoren möchten danke Yuliya Naumchuk (Loyola University Chicago) und Agne Žiniauskaitė (Experimentica GmbH), für hervorragende technische und videographische Unterstützung. Dr. Kaja Forschungsprogramm wird von Dr. John P. und Therese E. Mulcahy dotierte Professur für Augenheilkunde an der Loyola University Chicago unterstützt.

Alle Tiere wurden gemäß der ARVO-Erklärung für die Verwendung von Tieren in Ophthalmic und Vision Research und der EG-Richtlinie 86/609/EWG für Tierversuche, unter Verwendung von Protokollen genehmigt und überwacht durch das Tier Experiment Board of Finland behandelt.
(1) Laser-induced Maus CNV Modell 5
<ol><li>Die Augen des Tieres makroskopisch für alle mögliche Abweichungen zu überprüfen.</li>
	<li>Wiegen Sie die Maus.</li>
	<li>Berechnen Sie und bereiten Sie einen angemessenen Betrag von Anästhetika zu bedienen, bezogen auf das Gewicht des Tieres, z. B. eine Mischung aus Medetomidine (1 mg/kg), Ketamin (75 mg/kg) und destilliertes Wasser (0,9 % NaCl-Lösung) in einem Verhältnis von 1:1.5:2.5 oder Ketamin (40-75 mg/kg), Xylazin (5 mg/kg) und destilliertes Wasser (0,9 % NaCl-Lösung) in einem Verhältnis von 5:1 1:2.; Spritzen Sie für eine 20 g Maus 0,1 mL der Mischung.</li>
	<li>Intraperitoneal injizieren Sie Betäubungsmittel.</li>
	<li>Legen Sie Maus zurück in den Käfig und warten Sie, bis Tier betäubt ist. Bestätigen Sie, dass die Maus durch Mangel an einem Pedal Reflex richtig betäubt ist.</li>
	<li>Den Einsatz von Laser-Sicherheit persönlicher Schutzausrüstung zu gewährleisten.</li>
	<li>Aktivieren Sie eine Spaltlampe und einem 532 nm Diodenlaser.</li>
	<li>Entfernen Sie die Maus aus dem Käfig und auf das Heizkissen.</li>
	<li>Geben Sie einen Tropfen Tropicamid für Pupillen Dilatation. Warten Sie ca. 3-5 min für Pupillen Dilatation voll (3 mm).</li>
	<li>Platzieren Sie den Mauszeiger auf der Bühne an der Spaltlampe.</li>
	<li>Legen Sie einen Tropfen des Opthalmic liquid Gel auf ein Deckglas, Applanate der Hornhaut.</li>
	<li>Richten Sie das Maus-Auge mit dem Sehnerv Kopf in der Mitte.</li>
	<li>Legen Sie die Laserleistung auf 100 mW, die Dauer bis 100 ms und die Punktgröße bis 50 µm.</li>
	<li>Den Laserstrahl auf das retinale Pigmentepithel (RPE) konzentrieren.</li>
	<li>Machen Sie drei Laserschüsse in einem Auge Netzhautgefäße idealerweise auf die 4, 8 und 12:00 Positionen rund um den Sehnerv bzw. zu vermeiden. Den Fundus des Auges zu inspizieren, nachdem alle Aufnahmen für Abwesenheit von retinalen Blutungen laser. Der kontralaterale Auge dient als Kontrolle nicht gelasert.</li>
	<li>Entsorgen Sie die Deckglas und Ort Maus wieder auf das Heizkissen.</li>
	<li>Ein Tropfen von PEG Gel Tropfen auf beide Augen auftragen.</li>
</ol>2. SD-OCT 6,7
<ol><li>Platzieren Sie den Mauszeiger in das Nagetier Ausrichtung Stadium, und immobilisieren Sie den Kopf zu.</li>
	<li>Richten Sie das Objektiv von der SD-OCT-System (z. B.Bioptigen/Leica Envisu R2200) vor das Auge für die in-Vivo Bildgebung mit X - und Y-Stage Controller.</li>
	<li>SD-OCT Scans überprüfen, bricht der Bruch Membran durchführen: Sobald die SD-OCT das ganze Auge scannt, manuell verschieben die Betreff-Zeile auf den gelaserten Seiten. Bricht der Bruch Membran sollte in gelaserten Bereichen deutlich sichtbar sein (siehe Abbildung 1).</li>
</ol>(3) Fluorescein Angiographie 7,8,9
<ol><li>Entfernen Sie Maus mit dem Halter zu, und legen Sie es auf das FA-System (z.B.Heidelberg Spectralis HRA2).</li>
	<li>Fokus auf Laser brennen Bereichen des Augenhintergrundes des Auges mit Infrarot-Reflexionsvermögen-Modus mit dem Kopf des Sehnervs mitten in das Sichtfenster.</li>
	<li>Injizieren Sie 0,1 mL 5 % Fluorescein Natrium-Salz für eine 20 g-Maus, subkutan oder intraperitoneal.</li>
	<li>Im Mittelpunkt der Aderhaut Ebene.</li>
	<li>Nehmen Sie ein Bild von der Aderhaut Fokus-Ebene.</li>
	<li>Neuausrichtung auf die Netzhaut Ebene und nehmen Sie ein Bild.</li>
	<li>Warten Sie, bis 30 s und wiederholen Sie Schritte 3.4-3.6.</li>
	<li>Entfernen Sie die Maus aus der Halterung, und legen Sie es auf das Heizkissen.</li>
	<li>Umgekehrte Anästhesie durch α2-Antagonist für Medetomidine, Atipamezol (0,5 mg/kg, i.p.) oder warten Sie auf tierische Erholung aus der Narkose.</li>
	<li>Wiederholen Sie in Vivo SD-OCT und FA Bildgebung bei narkotisierten Tieren an den weiteren Tagen 5, 10 und 14.</li>
</ol>(4) CNV Verschneidung
<ol><li>Grad der Beschädigung der Bruch Membran aus OCT-Bildern und Aderhaut FA-Aufnahmen unmittelbar nach dem Lasern am Tag 0 wie folgt: 0 - Bruch Membran nicht beschädigt 1 - erfolgreiche Beschädigung der Bruch Membran</li>
	<li>Grade das Vorhandensein von CNV von gelaserten stellen, die Leckage wie durch den Vergleich der Dynamik von Fluorescein-Signal in einer Reihe von retinalen FA Bilder wie folgt festgestellt: 0 - normaler Auftritt der Netzhaut 0,5 - schwache Anfärbung der Leckage 1.0 - undichte CNV-Bereiche Hinweis: Verwenden der OCT-Bildgebung für zusätzliche Bestätigung der CNV oder fragwürdige FA wo würde das Vorhandensein intraretinalen Flüssigkeitsansammlungen im OCT Bilder vorschlagen CNV Verschneidung.</li>
</ol>5. die Netzhautdicke Messungen
<ol><li>Verwenden Sie eine automatische Segmentierung-Software zur Messung der Netzhautdicke. Sicherzustellen, dass die Netzhaut Gesamtdicke als die Dicke der alle Schichten von Nervenfaserschicht RPE (gesunde Messstellen) oder einer imaginären Verbindungslinie RPE rund um den Ort des Schadens (gelaserten Seiten) gilt (siehe auch Abbildung 7).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dobi, E. T., Puliafito, C. A., Destro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+of+experimental+choroidal+neovascularization+in+the+rat.">A new model of experimental choroidal neovascularization in the rat.</a> Arch. Ophthalmol. Chic. Ill 1960. 107, 264-269 (1989).</li><li>Tobe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+neovascularization+in+mice+with+overexpression+of+vascular+endothelial+growth+factor+in+photoreceptors.">Evolution of neovascularization in mice with overexpression of vascular endothelial growth factor in photoreceptors.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39, 180-188 (1998).</li><li>Seo, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+inhibition+of+retinal+and+choroidal+neovascularization+by+oral+administration+of+a+kinase+inhibitor.">Dramatic inhibition of retinal and choroidal neovascularization by oral administration of a kinase inhibitor.</a> Am. J. Pathol. 154, 1743-1753 (1999).</li><li>Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+choroidal+and+retinal+neovascularization.">Animal models of choroidal and retinal neovascularization.</a> Prog. Retin. Eye Res. 29, 500-519 (2010).</li><li>Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mouse+Model+for+Laser-induced+Choroidal+Neovascularization.">A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization.</a> J Vis Exp. (106), e53502 (2015).</li><li>Giani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+evaluation+of+laser-induced+choroidal+neovascularization+using+spectral-domain+optical+coherence+tomography.">In vivo evaluation of laser-induced choroidal neovascularization using spectral-domain optical coherence tomography.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 3880-3887 (2011).</li><li>Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+an+Image-Guided+Laser-Induced+Choroidal+Neovascularization+Model+in+Mice.">Optimization of an Image-Guided Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model in Mice.</a> PloS One. 10, e0132643 (2015).</li><li>Sheets, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotectin+D1+attenuates+laser-induced+choroidal+neovascularization+in+mouse.">Neuroprotectin D1 attenuates laser-induced choroidal neovascularization in mouse.</a> Mol. Vis. 16, 320-329 (2010).</li><li>Hoerster, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+and+ex-vivo+characterization+of+laser-induced+choroidal+neovascularization+variability+in+mice.">In-vivo and ex-vivo characterization of laser-induced choroidal neovascularization variability in mice.</a> Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. Albrecht Von Graefes Arch. Klin. Exp. Ophthalmol. 250, 1579-1586 (2012).</li><li>Sulaiman, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Optical+Coherence+Tomography+Quantification+Method+for+Choroidal+Neovascularization.">A Simple Optical Coherence Tomography Quantification Method for Choroidal Neovascularization.</a> J. Ocul. Pharmacol. Ther. Off. J. Assoc. Ocul. Pharmacol. Ther. Off. J. Assoc. Ocul. Pharmacol. 31, 447-454 (2015).</li></ol>

Der Autor Symantas Ragauskas, Ph.d. ist ein Mitarbeiter (wissenschaftlicher Mitarbeiter) und Gesellschafter der Experimentica GmbH, die Angebote Recherchediensten beschäftigen die präklinische CNV-Modell in diesem Artikel verwendeten Vertrag.
Die Autorin Eva Kielczewski ist ein Mitarbeiter (Forschung Anwendungstechniker, OCT) von Leica Microsystems, die in diesem Artikel verwendeten SD-OCT-Systeme produziert.
Der Autor Joseph Vance ist ein Mitarbeiter (NA OCT Sales Director) von Leica Microsystems, die in diesem Artikel verwendeten SD-OCT-Systeme produziert. Joseph Vance ist auch Präsident und managing Director von Perspektive, LLC.
Der Autor Simon Kaja, Ph.d. ist Berater Chief Scientific Officer und Gesellschafter der Experimentica GmbH, eine präklinische Vertrag Forschungseinrichtung, die Angebote Vertrag Recherchedienste, inkl. der präklinische CNV-Modell in diesem Artikel verwendet. Simon Kaja, Ph.d. ist auch CEO von K & P Scientific, LLC, einer consulting-Firma, Biowissenschaften und dient als Dr. John P. und Therese E. Mulcahy ausgestattet Professor für Augenheilkunde an der Loyola University Chicago, Stritch School of Medicine. Die Bedingungen dieser Vereinbarung haben überprüft und genehmigt von Loyola University Chicago im Einklang mit seinen Interessenkonflikt Politik wurde.
Der Autor Giedrius Kalesnykas, Ph.d. ist ein Mitarbeiter (CEO) und Gesellschafter der Experimentica GmbH, die Angebote Recherchediensten beschäftigen die präklinische CNV-Modell in diesem Artikel verwendeten Vertrag.

Multimodale Bildgebung bietet wertvolle Werkzeuge für CNV Pathologie Bewertung. Hier präsentierten wir eine bildgebende Protokoll bestehend aus FA, SD-OCT und automatische Segmentierung für die schnelle, reproduzierbare und zuverlässige Bewertung der CNV Pathologie. Ein Bruch des Bruchs Membran nach Laser Verwaltung bestätigt wurde. Darüber hinaus erlaubt die Verwendung von SD-OCT in diesem Stadium auch sofortige Visualisierung der möglichen intraretinalen und subretinalen Blutungen, die die Interpretation der Erg...

Der erste erfolgreiche Versuch, die Pathologie der menschlichen CNV bei Nagetieren zu imitieren wurde vor fast drei Jahrzehnten mit einer Krypton-Laser in Long-Evans Ratten1demonstriert. Danach wurde ein Krypton-Laser verwendet, um Bruch Membran in den beliebtesten Maus-Stamm C57BL/6J2,3,4zu brechen. Die Erfolgsquote der CNV Induktion wurde mit FA und histologischen Flecke verifiziert. Eine rasante Entwicklung der nicht-invasive bildgebende Verfahren wie OCT, förderte das Wachstum im Bereich der Nager präklinischen Modellen. Die Möglichkeit, morphologische Veränderungen in der Netzhaut zu mehreren Zeitpunkten auf den gleichen Auge deutlich überwachen trägt zur Verringerung von Tierversuchen und steigert die Effizienz in experimentellen Studien. Histologische Auswertung der CNV Läsionen ist relativ einfach und erfordert Kennzeichnung von abnormen Gefäßwachstum auf dem Gelände des Laser-Verwaltung, Bildaufnahme und Fläche/Volumen Schätzung mit einer Bildanalyse-Software. Im Gegensatz dazu stellen in Vivo bildgebender Verfahren komplexere Analysen der CNV Pathologie und seine Auslegung.
Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache und relativ schnelle Methode, um Grade Induktion, Progression und Regression von CNV mit FA, SD-OCT, und die automatische Segmentierung Methode in der Maus Laser-induzierte CNV Modell.

<table><tbody><tr><td>Medetomidine (commercial name Domitor)</td><td>Orion</td><td>Vnr 01 56 02</td><td>Anesthesia</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Intervet</td><td>Vnr 51 14 85</td><td>Anesthesia</td></tr><tr><td>0,9% NaCl</td><td>B Braun</td><td>357 0340</td><td>Anesthesia</td></tr><tr><td>Xylazine (commercial name Rompun vet)</td><td>Bayer</td><td>vnr 14 89 99</td><td>Anesthesia</td></tr><tr><td>Tropicamide</td><td>Santen</td><td>Vnr 04 12 36</td><td>Mydriatic agent</td></tr><tr><td>Viscotears</td><td>Alcon</td><td>Vnr 44 54 81</td><td>Lubricant</td></tr><tr><td>Systane</td><td>Alcon</td><td>&amp;nbsp;-</td><td>Lubricant</td></tr><tr><td>5% Fluorescein sodium salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6377-100G</td><td>Fluoresent agent</td></tr><tr><td>Atipamezole (commercial name Antisedan)</td><td>Orion</td><td>Vnr 47 19 53</td><td>Anesthesia</td></tr></tbody></table>

in vivo multimodal imaging and analysis of mouse laser-induced choroidal neovascularization model

Laserinduzierte choroidale Neovaskularisation (CNV) ist ein etabliertes Modell die feuchte Form der altersbedingten Makula-Degeneration (AMD) zu imitieren. Wir wollen in diesem Protokoll führen den Leser nicht einfach durch die Überlegungen der Generierung von Laser-induzierte Läsionen auslösen neovaskulären Prozesse, sondern auf die mächtigen Informationen, die Multimodal längs- beigezogen werden kann konzentrieren in-vivo Bildgebung in der Folgezeit.
Die Laser-induzierte Maus CNV Modell wurde durch eine Diode Laser Verwaltung generiert. Multimodale in Vivo bildgebenden Verfahren wurden verwendet, um CNV Induktion, Progression und Regression zu überwachen. Erste, spectral-Domain optische Kohärenztomographie (SD-OCT) erfolgte unmittelbar nach der Laserung um zu überprüfen, eine Pause von Bruch Membran. Nachfolgende in-Vivo Bildgebung mit Fluorescein-Angiographie (FA) bestätigt erfolgreiche Beschädigung der Bruch Membran aus seriellen Bildern auf der Aderhaut Ebene erworben. Longitudinal Follow-up von CNV Verbreitung und Regression auf 5, 10 und 14 Tage nach dem Lasern erfolgte mittels SD-OCT und FA. Einfache und zuverlässige Einstufung des undichten CNV Leasions von FA Bilder präsentiert. Automatische Segmentierung zur Messung der Netzhaut Gesamtdicke, kombiniert mit manueller Kaliber Anwendung zur Messung der Netzhautdicke CNV Standorten ermöglichen objektive Bewertung der Anwesenheit von Ödemen. Schließlich wird die histologischen Überprüfung der CNV mit Isolectin GS-IB4 Flecken auf choroidale Flatmounts durchgeführt. Die Färbung ist thresholded und Isolectin-positiven Bereich mit ImageJ berechnet wird.
Dieses Protokoll eignet sich besonders in Therapeutika Studien erfordern hohen Durchsatz wie Screening von CNV Pathologie, da es schnell, multimodale erlaubt und zuverlässige Klassifizierung von CNV Pathologie und Netzhaut Ödem. Hoher Auflösung SD-OCT ermöglicht darüber hinaus die Aufnahme von anderen pathologischen Merkmale wie die Ansammlung von subretinalen oder intraretinalen Flüssigkeit. Diese Methode bietet jedoch keine Möglichkeit um CNV-Volumen-Analyse von SD-OCT Bilder zu automatisieren, die manuell durchgeführt werden.

Eine Blase oder subretinalen Blutungen sofort nach dem Lasern ist nicht immer sichtbar. SD-OCT ist daher besonders wichtig, um Schäden der Bruch Membran zu überprüfen. Abbildung 1 zeigt ein Beispiel der OCT-Bildgebung zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Laser-Verabreichung.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56173/56173fig1.jpg"> Abbildung 1</stro...

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In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

In Vivo Multimodale Bildgebung und Analyse der laserinduzierten choroidale Neovaskularisation Mausmodell

Hier präsentieren wir Ihnen die Nützlichkeit der längs in-Vivo Bildgebung bei der Nachbereitung der morphologischen Veränderungen der laserinduzierten choroidale Neovaskularisation bei Mäusen.

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this ...

in-vivo-multimodal-imaging-analysis-mouse-laser-induced-choroidal

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

9.0K Aufrufe.  Experimentica Ltd.. Hier präsentieren wir Ihnen die Nützlichkeit der längs in-Vivo Bildgebung bei der Nachbereitung der morphologischen Veränderungen der laserinduzierten choroidale Neovaskularisation bei Mäusen.

Serie: In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

A Laser-induced Mouse Model of Chronic Ocular Hypertension to Characterize Visual Defects

Glaucoma, frequently associated with elevated intraocular pressure (IOP), is one of the leading causes of blindness. We sought to establish a mouse model of ocular hypertension to mimic human high-tension glaucoma. Here laser illumination is applied to the corneal limbus to photocoagulate the aqueous outflow, inducing angle closure. The changes of IOP are monitored using a rebound tonometer before and after the laser treatment. An optomotor behavioral test is used to measure corresponding changes in visual capacity. The representative result from one mouse which developed sustained IOP elevation after laser illumination is shown. A decreased visual acuity and contrast sensitivity is observed in this ocular hypertensive mouse. Together, our study introduces a valuable model system to investigate neuronal degeneration and the underlying molecular mechanisms in glaucomatous mice.

Chronic ocular hypertension is induced using laser photocoagulation of the trabecular meshwork in mouse eyes. The intraocular pressure (IOP) is elevated for several months after laser treatment. The decrease of visual acuity and contrast sensitivity of experimental animals are monitored using the optomotor test.

Ein Laser-induzierten Maus-Modell der chronischen Ocular Hypertension zu Sehfehler Charakterisierung

Glaucoma, frequently associated with elevated intraocular pressure (IOP), is one of the leading causes of blindness. We sought to establish a mouse model ...

Forschung

Medizin

Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography

Establishing experimental choroidal melanoma models is challenging in terms of the ability to induce tumors at the correct localization. In addition, difficulties in observing posterior choroidal melanoma in vivo limit tumor location and growth evaluation in real-time. The approach described here optimizes techniques for establishing choroidal melanoma in mice via a multi-step sub-choroidal B16LS9 cell injection procedure. To enable precision in injecting into the small dimensions of the mouse uvea, the complete procedure is performed under a microscope. First, a conjunctival peritomy is formed in the dorsal-temporal area of the eye. Then, a tract into the sub-choroidal space is created by inserting a needle through the exposed sclera. This is followed by the insertion of a blunt needle into the tract and the injection of melanoma cells into the choroid. Immediately after injection, noninvasive optical coherence tomography (OCT) imaging is utilized to determine tumor location and progress. Retinal detachment is evaluated as a predictor of tumor site and size. The presented method enables the reproducible induction of choroid-localized melanoma in mice and the live imaging of tumor growth evaluation. As such, it provides a valuable tool for studying intraocular tumors.

Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography

The present protocol describes the implantation and evaluation of melanoma in the murine choroid utilizing optical coherence tomography.

Implantation und Beurteilung des Melanoms in der Aderhaut der Maus mittels optischer Kohärenztomographie

Establishing experimental choroidal melanoma models is challenging in terms of the ability to induce tumors at the correct localization. In addition, ...

Krebsforschung

A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization

The mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) model has been a crucial mainstay model for neovascular age-related macular degeneration (AMD) research. By administering targeted laser injury to the RPE and Bruch&#8217;s membrane, the procedure induces angiogenesis, modeling the hallmark pathology observed in neovascular AMD. 
First developed in non-human primates, the laser-induced CNV model has come to be implemented into many other species, the most recent of which being the mouse. Mouse experiments are advantageously more cost-effective, experiments can be executed on a much faster timeline, and they allow the use of various transgenic models. The miniature size of the mouse eye, however, poses a particular challenge when performing the procedure. Manipulation of the eye to visualize the retina requires practice of fine dexterity skills as well as simultaneous hand-eye-foot coordination to operate the laser. However, once mastered, the model can be applied to study many aspects of neovascular AMD such as molecular mechanisms, the effect of genetic manipulations, and drug treatment effects. 
The laser-induced CNV model, though useful, is not a perfect model of the disease. The wild-type mouse eye is otherwise healthy, and the chorio-retinal environment does not mimic the pathologic changes in human AMD. Furthermore, injury-induced angiogenesis does not reflect the same pathways as angiogenesis occurring in an age-related and chronic disease state as in AMD.
Despite its shortcomings, the laser-induced CNV model is one of the best methods currently available to study the debilitating pathology of neovascular AMD. Its implementation has led to a deeper understanding of the pathogenesis of AMD, as well as contributing to the development of many of the AMD therapies currently available.

Here, we present the mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) protocol, an experimental model that re-creates the vascular hallmarks of neovascular age-related macular degeneration (AMD). Once mastered, it can reliably and effectively induce CNV as a model system to test various experimental measures.

Ein Mausmodell für Laser-induzierten CNV

The mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) model has been a crucial mainstay model for neovascular age-related macular degeneration (AMD) ...

A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva

Conventional histological analysis and cell culture systems are insufficient to simulate in vivo physiological and pathological dynamics completely. Multiphoton microscopy (MPM) has become one of the most popular imaging modalities for biomedical study at cellular levels in vivo, advantages include high resolution, deep tissue penetration and minimal phototoxicity. We have designed an MPM imaging platform with a customized mouse eye holder and a stereotaxic stage for imaging ocular surface in vivo. Dual fluorescent protein reporter mouse enables visualization of cell nuclei, cell membranes, nerve fibers, and capillaries within the ocular surface. In addition to multiphoton fluorescence signals, acquiring second harmonic generation (SHG) simultaneously allows for the characterization of collagenous stromal architecture. This platform can be employed for intravital imaging with accurate positioning across the entire ocular surface, including cornea and conjunctiva.

Presented here is a multiphoton microscopic platform for live mouse ocular surface imaging. Fluorescent transgenic mouse enables the visualization of cell nuclei, cell membranes, nerve fibers and capillaries within the ocular surface. Non-linear second harmonic generation signals derived from collagenous structures provide label-free imaging for stromal architectures.

Eine benutzerdefinierte Multiphotonen-Mikroskopie-Plattform für Live-Bildgebung von Maus-Cornea und Konjunktiva

Conventional histological analysis and cell culture systems are insufficient to simulate in vivo physiological and pathological dynamics completely. ...

Biotechnik

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the present protocol, mice expressing green fluorescent protein (gfp) under the promoter of Cx3cr1 (BALB/c-Cx3cr1gfp/gfp) were used to image microglia cells in vivo in the retina. Microglia are resident macrophages of the retina and have been implicated in several retinal diseases1,2,3,4,5,6. This protocol provides a detailed approach for generation of retinal B-scans, with SD-OCT, and imaging of microglia cell distribution in Cx3cr1gfp/gfp mice with SLO in vivo, using an ophthalmic imaging platform system. The protocol can be used in several reporter mouse lines. However, there are some limitations to the protocol presented here. First, both SLO and SD-OCT, when used in the high-resolution mode, collect data with high axial resolution but the lateral resolution is lower (3.5 &#181;m and 6 &#181;m, respectively). Moreover, the focus and saturation level in SLO is highly dependent on parameter selection and correct alignment of the eye. Additionally, using devices designed for human patients in mice is challenging due to the higher total optical power of the mouse eye compared to the human eye; this can lead to lateral magnification inaccuracies7, which are also dependent on the magnification by the mouse lens among others. However, despite that the axial scan position is dependent upon lateral magnification, the axial SD-OCT measurements are accurate8.

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

This protocol describes how high-resolution imaging techniques such as spectral domain optical coherence tomography and scanning laser ophthalmoscopy can be utilized in small rodents, using an ophthalmic imaging platform system, to obtain information on retinal thickness and microglial cell distribution, respectively.

In Vivo Darstellung der Cx3cr1GLP/Gfp Reporter Mäuse mit Spectral-Domain optische Kohärenztomographie und Scanning Laser Ophthalmoskopie

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the ...

Digestion of Whole Mouse Eyes for Multi-Parameter Flow Cytometric Analysis of Mononuclear Phagocytes

The innate immune system plays important roles in ocular pathophysiology including uveitis, diabetic retinopathy, and age-related macular degeneration. Innate immune cells, specifically mononuclear phagocytes, express overlapping cell surface markers, which makes identifying these populations a challenge. Multi-parameter flow cytometry allows for the simultaneous, quantitative analysis of multiple cell surface markers in order to differentiate monocytes, macrophages, microglia, and dendritic cells in mouse eyes. This protocol describes the enucleation of whole mouse eyes, ocular dissection, digestion into a single cell suspension, and staining of the single cell suspension for myeloid cell markers. Additionally, we explain the proper methods for determining voltages using single color controls and for delineating positive gates using fluorescence minus one controls. The major limitation of multi-parameter flow cytometry is the absence of tissue architecture. This limitation can be overcome by multi-parameter flow cytometry of individual ocular compartments or complimentary immunofluorescence staining. However, immunofluorescence is limited by its lack of quantitative analysis and reduced number of fluorophores on most microscopes. We describe the use of multi-parametric flow cytometry to provide highly quantitative analysis of mononuclear phagocytes in laser-induced choroidal neovascularization. Additionally, multi-parameter flow cytometry can be used for the identification of macrophage subsets, fate mapping, and cell sorting for transcriptomic or proteomic studies.

This protocol provides a method to digest whole eyes into a single cell suspension for the purpose of multi-parameter flow cytometric analysis in order to identify specific ocular mononuclear phagocytic populations, including monocytes, microglia, macrophages, and dendritic cells.

Verdauung von Ganzmausaugen für multiparameterflow Cytometric Analysis of Mononuclear Phagozyten

The innate immune system plays important roles in ocular pathophysiology including uveitis, diabetic retinopathy, and age-related macular degeneration. ...

Immunologie und Infektion

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

Transpupille Zwei-Photonen-In-vivo-Bildgebung der Netzhaut der Maus

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

Neurowissenschaften

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To properly leverage this greater translatability, there is a need to devise reproducible methods of drawing quantitative data from these images. Optical coherence tomography (OCT) imaging can resolve retinal histology at micrometer resolution and reveal functional differences in vascular blood flow. Here, we delineate noninvasive vascular readouts that we use to characterize pathological damage post vascular insult in an optimized mouse model of retinal vein occlusion (RVO). These readouts include live imaging analysis of retinal morphology, disorganization of retinal inner layers (DRIL) measure of capillary ischemia, and fluorescein angiography measures of retinal edema and vascular density. These techniques correspond directly to those used to examine patients with retinal disease in the clinic. Standardizing these methods enables direct and reproducible comparison of animal models with clinical phenotypes of ophthalmic disease, increasing the translational power of vascular injury models.

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

Here, we present three data analysis protocols for fluorescein angiography (FA) and optical coherence tomography (OCT) images in the study of Retinal Vein Occlusion (RVO).

Im lebenden Organismus Gefäßverletzungsanzeigen in der Netzhaut der Maus zur Förderung der Reproduzierbarkeit

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To ...

Multiphoton Intravital Imaging for Monitoring Leukocyte Recruitment during Arteriogenesis in a Murine Hindlimb Model

Arteriogenesis strongly depends on leukocyte and platelet recruitment to the perivascular space of growing collateral vessels. The standard approach for analyzing collateral arteries and leukocytes in arteriogenesis is ex vivo (immuno-) histological methodology. However, this technique does not allow the measurement of dynamic processes such as blood flow, shear stress, cell-cell interactions, and particle velocity. This paper presents a protocol to monitor in vivo processes in growing collateral arteries during arteriogenesis utilizing intravital imaging. The method described here is a reliable tool for dynamics measurement and offers a high-contrast analysis with minimal photo-cytotoxicity, provided by multiphoton excitation microscopy. Prior to analyzing growing collateral arteries, arteriogenesis was induced in the adductor muscle of mice by unilateral ligation of the femoral artery.
After the ligation, the preexisting collateral arteries started to grow due to increased shear stress. Twenty-four hours after surgery, the skin and subcutaneous fat above the collateral arteries were removed, constructing a pocket for further analyses. To visualize blood flow and immune cells during in vivo imaging, CD41-fluorescein isothiocyanate (FITC) (platelets) and CD45-phycoerythrin (PE) (leukocytes) antibodies were injected intravenously (i.v.) via a catheter placed in the tail vein of a mouse. This article introduces intravital multiphoton imaging as an alternative or in vivo complementation to the commonly used static ex vivo (immuno-) histological analyses to study processes relevant for arteriogenesis. In summary, this paper describes a novel and dynamic in vivo method to investigate immune cell trafficking, blood flow, and shear stress in a hindlimb model of arteriogenesis, which enhances evaluation possibilities notably.

The recruitment of leukocytes and platelets constitutes an essential component necessary for the effective growth of collateral arteries during arteriogenesis. Multiphoton microscopy is an efficient tool for tracking cell dynamics with high spatio-temporal resolution in vivo and less photo-toxicity to study leukocyte recruitment and extravasation during arteriogenesis.

Multiphotonen-Intravital-Bildgebung zur Überwachung der Leukozytenrekrutierung während der Arteriogenese in einem murinen Hintergliedmaßenmodell

Arteriogenesis strongly depends on leukocyte and platelet recruitment to the perivascular space of growing collateral vessels. The standard approach for ...

Image-Guided Optical Coherence Tomography to Assess Structural Changes in Rodent Retinas

Ocular diseases, such as age-related macular degeneration, glaucoma, retinitis pigmentosa, and uveitis, are always accompanied by retinal structural changes. These diseases affecting the fundus always exhibit typical abnormalities in certain cell types in the retina, including photoreceptor cells, retinal ganglion cells, cells in the retinal blood vessels, and cells in the choroidal vascular cells. Noninvasive, highly efficient, and adaptable imaging techniques are required for both clinical practice and basic research. Image-guided optical coherence tomography (OCT) satisfies these requirements because it combines fundus photography and high-resolution OCT, providing an accurate diagnosis of tiny lesions as well as important changes in the retinal architecture. This study details the procedures of data collection and data analysis for image-guided OCT and demonstrates its application in rodent models of choroidal neovascularization (CNV), optic nerve crush (ONC), light-induced retinal degeneration, and experimental autoimmune uveitis (EAU). This technique helps researchers in the eye field to identify rodent retinal structural changes conveniently, reliably, and tractably.

The protocol presented here details the procedures of data collection and data analysis for image-guided optical coherence tomography (OCT) and demonstrates its application in multiple rodent models of ocular diseases.

Ocular diseases, such as age-related macular degeneration, glaucoma, retinitis pigmentosa, and uveitis, are always accompanied by retinal structural ...