Die Autoren möchten sich die Mitglieder des Dowling Labor (Aaron Reifler, Trent Waugh, Angela Busta und William Telfer), die zur Entwicklung der Technik und der Herstellung des Manuskripts beigetragen haben. Diese Arbeit wurde von der Taubman-Institut, der Abteilung für Pädiatrie an der University of Michigan, und zum Teil aus Zuschüssen von der Gesellschaft für Muskeldystrophie (JJD MDA186999) und den National Institutes of Health (JJD 1K08AR054835) finanziert.

1. Herstellung von Poly-L-Lysin beschichtete Deckgläser (Dauer: 1 h) Deckbeschichtung ermöglicht eine schnelle Einschwingzeit myofiber und Haftung. Dies kann während der Dissoziationsstufe der myofiber Trennung (Schritt 2 unten) durchgeführt werden. <ol><li> Schneiden und Parafilm auf dem Boden einer 60 mm Petrischale (alle Marken). </li><li> Zeigen Mikroskop Deckglas rutscht (12 mm Durchmesser) auf Parafilm in einer 60-mm-Gewebekulturschale oder sie einzeln in einzelnen Wells der 24-Well-Platten. </li></ol> Anmerkung 1: Diese kleine, runde Deckgläser helfen, myofiber Zahlen konzentrieren und reduzieren überschüssige Antikörper Nutzung. Hinweis 2: Andere Größe Deck funktionieren wird, jedoch werden die Volumina der Reagenzien und Embryonen verwendet werden, müssen entsprechend angepasst werden. <ol start="3"><li> Pipette 50-200 ul Poly-L-Lysin-Lösung (0,01%) auf jedem Deckglas in der Petrischale. </li><li> Lassen Sie die Deckgläser zu sitzen mindestens eine hour bei 37 ° C. Längere Inkubationen nicht negativ beeinflussen Ergebnisse. </li><li> Entfernen Poly-L-Lysin-Lösung aus dem Deckglas und zweimal waschen mit einem Minimum von 100 ul 1x PBS. </li><li> Deck ermöglichen zu trocknen. </li><li> Die Deckgläser sind nun bereit für Muskelfasern. </li></ol> Hinweis 3: Um die Sterilität zu gewährleisten, kann die Beschichtung in einer Haube und autoklaviert Deckgläschen durchgeführt werden. Anmerkung 4: Halten Sie die 60 mm Petrischale mit Parafilm auf der Unterseite. Dieses Setup wird während myofiber Beschichtungs-und Immunmarkierung (später Stufen) verwendet werden. Alternative 1: Statt der Deckbeschichtung unmittelbar vor der Anwendung kann eine beschichtete Deck Lager verwendet werden. Eine 60 mm-Petrischale, die ein Minimum von 2 ml Poly-L-Lysin kann bei 4 ° C mit zahlreichen Deck gespeichert werden. Bei dieser Alternative beginnen Sie mit Schritt 1,5 bis die Deckgläser für Muskelfasern zu verarbeiten. Alternative 2: Wir haben auch Decklack in Poly-L-Ornithin. Tseiner ist arbeitsintensiv, aber ist nützlich für längerfristige Kultivierung da Poly-L-Ornithin-beschichteten Deckgläsern können UV behandelt sein. Mit UV-Behandlung und sorgfältige steriler Technik Live Muskelfasern können in der Regel in der Kultur 4-7 Tage aufrecht erhalten werden. 2. Die Dissoziation von Zebrafischembryonen und Oberflächen von Muskelfasern (Dauer: 1 bis 3 Std.) Hinweis: Die Standard-Protokoll gilt besten bis 3 dpf (Tage nach der Befruchtung) Embryonen. <ol><li> Übertragen Zebrafischembryonen in ein Standard 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen und entfernen Sie so viel überschüssige Wasser Fische wie möglich. Typischerweise können 10-20 Embryos pro Rohr, wenn auch weniger eingesetzt werden. Verwendung von mehr als 20-25 Embryonen führt oft zu einer Herstellung von übermäßiger Dichte. <ol><li> Chorion vor der Dissoziation entfernen, manuell mit Nr. 5 Pinzette. Alternativ wird chemische Chorion Entfernung mit 10-15 min Pronase Behandlung erreicht. Typischerweise wird die vorherige Entfernung der Chorion nur notwendig, wenn vor der Bestätigung des MUTant Phänotyp oder Morphologie erforderlich ist, oder bei der Verwendung Bühnen, auf denen Embryonen werden natürlich von ihren Chorion geschlüpft. </li></ol></li><li> In 900 ul der CO 2-unabhängigen Medien an der Röhre, die die Embryonen. </li><li> 100 l Collagenase Typ II, Endkonzentration 3,125 mg / ml (Auf Collagenase-Lösung mit 31,25 mg / ml in 1x PBS), um die Dissoziation zu beginnen. Collagenase IV auch zur Spaltung verwendet werden. </li><li> Drehen Embryonen auf einem Orbitalschüttler und verreiben alle 30 min bei RT mit einem Pipetman P1000 für das Verreiben. </li></ol> Hinweis 2: Embryo Dissoziation sorgfältig zu überwachen; über oder unter Dissoziation (vor allem über) sind die häufigsten Gründe für die Protokoll-Fehler. Zeiten für die Verdauung wird je nach Intensität der Verreibung, die Anzahl der Embryonen pro Röhrchen und Alter des Embryos variieren. Es ist auch oft weniger (im Vergleich zu Wildtypen) für Embryonen aus der Skelettmuskulatur Mutanten. Anmerkung3: Durchschnittlich Verdauungszeit pro Embryoalter: 1 dpf = 1 h, 2 dpf = 1,5 h, 3 dpf = 2 h und 4 dpf = 2-2,5 Stunden. <ol start="5"><li> Stoppen Sie die Verdauung, wenn keine ganze Embryonen sind sichtbar, aber feste Stücke sind noch sichtbar - das ist wichtig, overdigestion verhindern. </li><li> Zentrifugenröhrchen mit dissoziierten Embryonen bei 0,8 bis 2,3 g für 3-5 min auf Pellet-Zellen. </li><li> Überstand entfernen von pelletierten Zellen und waschen 2x mit CO 2 unabhängige Medien. </li><li> Add frischen CO 2 unabhängige Medien, um Zellen zu resuspendieren. 1 ml wird typischerweise für Preps von 10-20 Embryonen verwendet. Die Lautstärke kann auf Basis Embryo Anzahl skaliert werden. </li><li> Mit einer Pipette P1000, vorbei Embryo Suspension durch ein 70-um-Filter. Dies hilft, entfernen Sie unerwünschte Ablagerungen aus dem prep. </li></ol> Anmerkung 4: Embryo Suspension kann ein zweites Mal durch ein 40-um-Filter gefiltert, um weiter zu entfernen unerwünschte Ablagerungen werden. Von einem Doppelfiltration, ist die Wiederherstellung approximLICH 800 ul von einem Ausgangsvolumen von 1 ml. <ol start="10"><li> Füllen Sie ungefähr 50-100 ul myofiber Suspension in jede Poly-L-Lysin beschichteten Deckglas. </li></ol> Anmerkung 5: Führen Sie den Schritt 2.9 in die Petrischalen mit Parafilm auf dem Boden, die zuvor vorbereitet. Der Parafilm hält die Aussetzung myofiber Verlaufen die beschichtete Deckgläser. Halten Petrischalen abgedeckt, um Verdunstung zu verhindern. <ol start="11"><li> Lassen Muskelfasern auf ca. 1 Stunde auf die beschichtete Deckgläser bei Raumtemperatur zu regeln. </li></ol> Anmerkung 6: Muskelfasern beginnen, innerhalb von 5-10 min zu begleichen. Doch für gute myofiber Anhang, mindestens 1 h (02.01 h) wird empfohlen. Zulassen von Muskelfasern, für längere begleichen werden nicht schaden, die prep. Für längere Inkubationen (inkl. Übernachtung), können Antibiotika zu den Medien geben. Mit Antibiotika und steriler Technik lebenden Kulturen typischerweise für 1-2 Tage gehalten. <ol start="12"><li> Live-myofibers kann an dieser Stelle beobachtet werden. Muskelfasern aus Embryonen 2 dpf und wird später als Rillen und längliche Zellen (Fig. 1) zu sehen. An diesem Punkt sind nun bereit für die Live-Muskelfasern Analyse oder zur Immunmarkierung. </li></ol> Anmerkung 7: Die Skelettmuskulatur von 1 dpf Embryonen nicht als Lang und deutlich quergestreiften Fasern plattieren. Stattdessen sind groß myoballs sichtbar. Zusätzlich wird während der Pelletierung Phase Post-Dissoziation (Schritt 2.6), 1 dpf myoballs müssen für ein Minimum von 8 min bei 5.000 g zentrifugiert, um ein Pellet zu erreichen. Für die Analyse von Embryonen in diesem Stadium, ist es empfehlenswert, den transgenen Linie EGFP speziell im Skelettmuskel 23 zu verwenden. Dies wird Identifikation von Zellen aus Muskel Herkunft im Vergleich zu anderen Quellen zu ermöglichen. 3. Fluoreszenz-Immunfärbung von Dissoziierte Zebrafisch Muskelfasern (Dauer: ca. 1 Tag) 3.1. Immunomarkierung <ol><li> Einen Teil entfernenMedien von Muskelfasern auf die beschichtete Deckglas geklebt </li><li> Fix Zellen mit 4% Paraformaldehyd oder Methanol. Für PFA, ½ Volumen der Medien entfernen und ersetzen mit der gleichen Menge an PFA. Fix für 10 min bei RT, dann entfernen Gesamtvolumen, ersetzen mit 50-100 ul PFA, und befestigen Sie für weitere 10 min. Alkoholfixierung, eiskaltem Methanol oder Aceton bei 4 ° C für 10 min oder 5 min aufgebracht werden, auf. </li><li> Muskelfasern mindestens 3-5x mit 1x PBS oder 1x PBS plus 0,1% Tween waschen. Durchschnittliche Waschvolumen beträgt 50-100 ul pro Deckglas. </li><li> In Blocklösung zu Muskelfasern (Arbeits Lager) und Inkubation von 20-60 min bei Raumtemperatur. Blockierungslösung wird je nach den primären und sekundären Antikörper variieren. Die beiden häufigsten im Labor verwendet werden, sind (1) 1 × PBS, 2 mg / ml BSA, 1% Schafserum, 0,25% Triton X-100 final und (2) 0,2% Triton X-100, 2 mg / ml (0,2 % BSA) und 5% Schaf / Ziegenserum. </li><li> Blockierlösung entfernen und hinzufügen primären Antikörper entweder b verdünntVerriegelungslösung oder PBS. Muskelfasern über Nacht Inkubation bei 4 ° C. Stellen Sie sicher, dass Sie entweder Parafilm oder wickeln Sie sie in Frischhaltefolie die Petrischale mit den myofiber belasteten Deckgläser mit einem Antikörper beschichtet. Kleine Stücke von angefeuchteten Papiertuch kann hinzugefügt werden, um eine befeuchtete Kammer zu erzeugen. </li><li> Entfernen primären Antikörper aus Deckgläser Deckgläser und waschen 3-5x für 5 min mit PBS oder Blocking-Lösung. </li><li> In sekundären Antikörper in geeigneter Konzentration in 1x PBS oder Blockierungslösung für 1-2 h bei RT verdünnt. </li><li> Sekundärantikörper entfernen und waschen Muskelfasern 3-5x in PBS für jeweils 5 min bei RT. </li></ol> 3.2. Montagedeck <ol start="9"><li> 1-2 Tropfen Antifade Reagenz auf einen Objektträger. </li><li> Sorgfältig Abholung der beschichteten und immunolabled Deckglas mit einer Pinzette und Ort (Muskelfasern nach unten) das Deckglas auf der Antifade Reagenz auf dem Objektträger. </li></ol> Anmerkung 1: Die Beachtung der Ausrichtung der coated Deck ist kritisch. <ol start="11"><li> Legen 1-2 Kimwipes auf eine harte feste Oberfläche. Invertieren Sie schnell den Schlitten mit den beschichteten Deckgläser auf der Antifade Reagenz ruht und legen Sie es (Deckglas nach unten) auf der Kimwipes. </li><li> Wenden Sie leichten Druck auf die Ecken des Mikroskop-Objektträger, um überschüssige Antifade entfernen und eine gute Abdichtung zu bilden zwischen dem Schieber und Deckglas </li><li> Veröffentlichung der verbleibende, für 5-10 min bei RT trocknen Antifade, dann die Muskelfasern sind bereit, Bild (2A und B) oder bei 4 ° C </li></ol> 4. Live Cell Calcium Imaging Mit GCaMP3 Lebendzellexperimenten auf Muskelfasern vor der Fixierung (nach Schritt 2.10) durchgeführt werden. Das folgende Protokoll beschreibt die Live-Darstellung in Muskelfasern exprimieren GCaMP3 24, eine genetisch kodierte Kalzium-Indikator, der Skelettmuskel-spezifischen Zebrafisch-α-Aktin-Promotor (PSKM) 23 ausgedrückt. AlternativDieses Verfahren kann leicht angepasst werden, um Calcium-Indikator-Farbstoffe, wie Fura-2 verwendet werden. <ol><li> Inject Embryonen mit PSKM: GCaMP3 bauen an der 1-2 Zell-Stadium </li><li> Bei 3 dpf, sammeln und bereiten Larven Muskelfasern wie in den Abschnitten 1 und 2 beschrieben. Muskelfasern zu ermöglichen für ein Minimum von 1 Stunde zu halten. Für diese Technik bereitet Deckgläschen in 24-Well-Platten erforderlich. </li><li> Überschüssiges Material vorsichtig entfernen, und 300 ml frisches CO 2 unabhängige Medien bei RT. </li><li> Beachten Zellen unter einem inversen Mikroskop. GCaMP3 positive Muskelfasern sollte unter grünen Fluoreszenz sichtbar sein. </li><li> Richten Sie die Kamera für die Aufnahme, wenn gewünscht. </li><li> Bereiten Sie eine 30 mM Koffein-Lösung in CO 2 unabhängige Medien. Um Zellen zu stimulieren, sanft Pipette 300 ul von Koffein-Lösung in die gut unter Vergrößerung. Innerhalb von 5-10 sec, soll GCaMP positiven Muskelfasern Koffein mit einem schnellen Anstieg der Fluoreszenz (Fig. 3) zu reagieren. Myofibten kann auch schrumpfen. Zu beachten ist, induziert Koffein Calcium-Freisetzung aus den Retikulum speichert 25. Andere Mittel, wie KCl 26 und Ryanodin-4, verwendet werden, um induzierbare Calciumfreisetzung zu untersuchen. </li></ol>

<ol>
	<li>Dulhunty, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitation-contraction+coupling+from+the+1950s+into+the+new+millennium.">Excitation-contraction coupling from the 1950s into the new millennium.</a> Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 33, 763-772 (2006).</li><li>Bannister, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+the+myoplasmic+gap:+recent+developments+in+skeletal+muscle+excitation-contraction+coupling.">Bridging the myoplasmic gap: recent developments in skeletal muscle excitation-contraction coupling.</a> J. Muscle Res. Cell Motil. 28, 275-283 (2007).</li><li>Ohno, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+defects+and+disorders+at+the+neuromuscular+junction.">Genetic defects and disorders at the neuromuscular junction.</a> Brain Nerve. 63, 669-678 (2011).</li><li>Lanner, J. T., Georgiou, D. K., Joshi, A. D., Hamilton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ryanodine+receptors:+structure,+expression,+molecular+details,+and+function+in+calcium+release.">Ryanodine receptors: structure, expression, molecular details, and function in calcium release.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, (2010).</li><li>Dolphin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+channel+diversity:+multiple+roles+of+calcium+channel+subunits.">Calcium channel diversity: multiple roles of calcium channel subunits.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 19, 237-244 (2009).</li><li>Sparrow, J. C., Schock, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+initial+steps+of+myofibril+assembly:+integrins+pave+the+way.">The initial steps of myofibril assembly: integrins pave the way.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 293-298 (2009).</li><li>Lapidos, K. A., Kakkar, R., McNally, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dystrophin+glycoprotein+complex:+signaling+strength+and+integrity+for+the+sarcolemma.">The dystrophin glycoprotein complex: signaling strength and integrity for the sarcolemma.</a> Circ. Res. 94, 1023-1031 (2004).</li><li>Bassett, D., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+zebrafish+model+of+muscular+dystrophy.">Identification of a zebrafish model of muscular dystrophy.</a> Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 31, 537-540 (2004).</li><li>Barresi, R., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystroglycan:+from+biosynthesis+to+pathogenesis+of+human+disease.">Dystroglycan: from biosynthesis to pathogenesis of human disease.</a> J. Cell Sci. 119, 199-207 (2006).</li><li>Emery, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+frequencies+of+inherited+neuromuscular+diseases-a+world+survey.">Population frequencies of inherited neuromuscular diseases-a world survey.</a> Neuromuscul. Disord. 1, 19-29 (1991).</li><li>Nance, J. R., Dowling, J. J., Gibbs, E. M., Bonnemann, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+myopathies:+an+update.">Congenital myopathies: an update.</a> Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 12, 165-174 (2012).</li><li>Bassett, D. I., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+model+for+muscular+dystrophy+and+congenital+myopathy.">The zebrafish as a model for muscular dystrophy and congenital myopathy.</a> Hum. Mol. Genet. 12, 265-270 (2003).</li><li>Dooley, K., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+a+model+system+for+the+study+of+human+disease.">Zebrafish: a model system for the study of human disease.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 10, 252-256 (2000).</li><li>Dowling, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+myotubularin+function+results+in+T-tubule+disorganization+in+zebrafish+and+human+myotubular+myopathy.">Loss of myotubularin function results in T-tubule disorganization in zebrafish and human myotubular myopathy.</a> PLoS Genet. 5, (2009).</li><li>Dowling, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+successful+antioxidant+treatment+in+models+of+RYR1-related+myopathy.">Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy.</a> Brain. 135, 1115-1127 (2012).</li><li>Kawahara, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+in+a+zebrafish+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 5331-5336 (2011).</li><li>Detrich, H. W., Westerfield, M., M, L. I., Zon, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+the+Zebrafish+system.">Overview of the Zebrafish system.</a> Methods Cell Biol. 59, 3-10 (1999).</li><li>Nixon, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+for+caveolin-associated+muscle+disease;+caveolin-3+is+required+for+myofibril+organization+and+muscle+cell+patterning.">Zebrafish as a model for caveolin-associated muscle disease; caveolin-3 is required for myofibril organization and muscle cell patterning.</a> Hum. Mol. Genet. 14, 1727-1743 (2005).</li><li>Schredelseker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta+1a+subunit+is+essential+for+the+assembly+of+dihydropyridine-receptor+arrays+in+skeletal+muscle.">The beta 1a subunit is essential for the assembly of dihydropyridine-receptor arrays in skeletal muscle.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 17219-17224 (2005).</li><li>Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=neb:+a+zebrafish+model+of+nemaline+myopathy+due+to+nebulin+mutation.">neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation.</a> Dis. Model Mech. 5, 389-396 (2012).</li><li>Dowling, J. J., Low, S. E., Busta, A. S., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+MTMR14+is+required+for+excitation-contraction+coupling,+developmental+motor+function+and+the+regulation+of+autophagy.">Zebrafish MTMR14 is required for excitation-contraction coupling, developmental motor function and the regulation of autophagy.</a> Hum. Mol. Genet. 19, 2668-2681 (2010).</li><li>Schredelseker, J., Dayal, A., Schwerte, T., Franzini-Armstrong, C., Grabner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proper+restoration+of+excitation-contraction+coupling+in+the+dihydropyridine+receptor+beta1-null+zebrafish+relaxed+is+an+exclusive+function+of+the+beta1a+subunit.">Proper restoration of excitation-contraction coupling in the dihydropyridine receptor beta1-null zebrafish relaxed is an exclusive function of the beta1a subunit.</a> J. Biol. Chem. 284, 1242-1251 (2009).</li><li>Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+generation+of+transgenic+zebrafish+which+reliably+express+GFP+in+whole+muscles+or+the+whole+body+by+using+promoters+of+zebrafish+origin.">High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin.</a> Dev. Biol. 192, 289-299 (1997).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).</li><li>Zhou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-sense+mutations+in+the+dihydropyridine+receptor+beta1+gene,+CACNB1,+paralyze+zebrafish+relaxed+mutants.">Non-sense mutations in the dihydropyridine receptor beta1 gene, CACNB1, paralyze zebrafish relaxed mutants.</a> Cell Calcium. 39, 227-236 (2006).</li><li>Dora, K. A., Doyle, M. P., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevation+of+intracellular+calcium+in+smooth+muscle+causes+endothelial+cell+generation+of+NO+in+arterioles.">Elevation of intracellular calcium in smooth muscle causes endothelial cell generation of NO in arterioles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 6529-6534 (1997).</li><li>Hirata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=accordion,+a+zebrafish+behavioral+mutant,+has+a+muscle+relaxation+defect+due+to+a+mutation+in+the+ATPase+Ca2++pump+SERCA1.">accordion, a zebrafish behavioral mutant, has a muscle relaxation defect due to a mutation in the ATPase Ca2+ pump SERCA1.</a> Development. 131, 5457-5468 (2004).</li><li>van Eeden, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+affecting+somite+formation+and+patterning+in+the+zebrafish,+Danio+rerio.">Mutations affecting somite formation and patterning in the zebrafish, Danio rerio.</a> Development. 123, 153-164 (1996).</li><li>Gupta, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+dag1+mutant:+a+novel+genetic+model+for+dystroglycanopathies.">The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies.</a> Hum. Mol. Genet. 20, 1712-1725 (2011).</li><li>Leuranguer, V., Papadopoulos, S., Beam, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+calcium+channel+beta1a+subunits+in+triad+junctions+in+skeletal+muscle.">Organization of calcium channel beta1a subunits in triad junctions in skeletal muscle.</a> J. Biol. Chem. 281, 3521-3527 (2006).</li><li>Capote, J., Bolanos, P., Schuhmeier, R. P., Melzer, W., Caputo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+transients+in+developing+mouse+skeletal+muscle+fibres.">Calcium transients in developing mouse skeletal muscle fibres.</a> J. Physiol. 564, 451-464 (2005).</li><li>Adams, B. A., Tanabe, T., Mikami, A., Numa, S., Beam, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intramembrane+charge+movement+restored+in+dysgenic+skeletal+muscle+by+injection+of+dihydropyridine+receptor+cDNAs.">Intramembrane charge movement restored in dysgenic skeletal muscle by injection of dihydropyridine receptor cDNAs.</a> Nature. 346, (1990).</li><li>Sakowski, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+to+study+motor+neurons+from+zebrafish+embryos+and+larvae+in+culture.">A novel approach to study motor neurons from zebrafish embryos and larvae in culture.</a> J. Neurosci. Methods. 205, 277-282 (2012).</li><li>Nakano, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+GPI-anchored+proteins+is+essential+for+surface+expression+of+sodium+channels+in+zebrafish+Rohon-Beard+neurons+to+respond+to+mechanosensory+stimulation.">Biogenesis of GPI-anchored proteins is essential for surface expression of sodium channels in zebrafish Rohon-Beard neurons to respond to mechanosensory stimulation.</a> Development. 137, 1689-1698 (2010).</li><li>Davidson, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+deletion+of+lysine+7+expands+the+clinical,+histopathological+and+genetic+spectrum+of+TPM2-related+myopathies.">Novel deletion of lysine 7 expands the clinical, histopathological and genetic spectrum of TPM2-related myopathies.</a> Brain. 136, 508-521 (2013).</li><li>Schredelseker, J., Shrivastav, M., Dayal, A., Grabner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-Ca2+-conducting+Ca2++channels+in+fish+skeletal+muscle+excitation-contraction+coupling.">Non-Ca2+-conducting Ca2+ channels in fish skeletal muscle excitation-contraction coupling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5658-5663 (2010).</li></ol>

Die Autoren erklären, keine widerstreitenden Interessen.

Zebrafische sind ein leistungsfähiges Wirbeltier-Modellsystem für die Untersuchung der Muskelentwicklung und Funktion in vivo 25,27,28. Sie haben auch gezeigt, als ein wertvolles Gut für die Modellierung menschlichen Muskelerkrankungen 14,15,20,29. Während große Schritte unternommen wurden, um die Nutzung und Anwendung der Zebrafisch für die Untersuchung der Muskelfunktion und Muskelerkrankungen voranzubringen, gibt es eine ständige kritische Notwendigkeit, Werkzeuge, die mehr in di...

Die Skelettmuskulatur ist ein hoch spezialisiertes Gewebe für die Erzeugung der für die Motilität notwendig Kontraktionskräfte verantwortlich. Die Kontraktion wird durch einen Prozess wie Erregung und Kontraktion (EG) Kupplung, die elektrische Signale an Calcium-Freisetzung aus intrazellulären Speichern 1,2 wandelt bekannt initiiert. Intrazelluläre Calcium-Freisetzung aktiviert die Sarkomer zu verkürzen und zu erzeugen Kraft. Die vielen spezifischen Komponenten der molekularen Maschinen für die Vermittlung der neuromuskulären Synapse Getriebe 3 EG-Kupplung 4,5, und Aktin-Myosin-abhängigen Kontraktionen 6 verantwortlich weiterhin die anhaltende Gegenstand intensiver Forschung. Darüber hinaus Proteine, die die Muskelmembran während der Kontraktion 7,8 und dieser mittelbaren Signalisierung zwischen der myofiber und der extrazellulären Matrix 7,9 stabilisieren wurden identifiziert und untersucht im Detail. Mutationen in mehreren Genen, die für ein Muskelstrukturnd Funktion haben als Ursachen der menschlichen Skelettmuskelerkrankungen identifiziert ( <a href="http://www.musclegenetable.org/" target="_blank">http://www.musclegenetable.org/</a> ). Diese Krankheiten, allgemein als Skelett Myopathien und Muskeldystrophien, basierend auf klinischen und histopathologischen Merkmalen klassifiziert, werden mit Muskelschwäche, lebenslange Behinderung und frühe Sterblichkeit 10,11 verbunden. Der Zebrafisch hat sich als ein hervorragendes System zur Modellierung und Untersuchung der menschlichen Skelettmuskelerkrankungen 8,12,13 sein. Es wurde eingesetzt, um neue Gen-Mutationen 8 validieren, definieren neue Aspekte der Krankheit Pathophysiologie 14,15, zu erkennen und neue Therapieansätze 15,16. Die Leistung des Zebrafisches zur Untersuchung menschlicher Muskelerkrankung bezieht sich auf die große Anzahl von Nachkommen, die rasche Entwicklung der Muskelstruktur und-funktion, die optische Klarheit des Zebrafischembryos, und der Leichtigkeit der genetischen und pharmakologischen Manipulation der EntwicklungszebraFisch 17. Wir und andere 12,18,19 haben vor kurzem eine einfache Technik für die schnelle und effiziente Isolierung von Muskelfasern aus dem Zebrafisch-Entwicklung entwickelt. Diese Methode wurde die Prüfung von Muskelfasern näher, als durch ganze Embryo Analyse zur Verfügung gestellt werden aktiviert. Die Technik hat sich für die Charakterisierung von Protein subzelluläre Lokalisation 20 als auch für die Identifizierung von wichtigen histopathologischen Merkmale als Teil der Validierungsstudien in neu entwickelten Krankheitsmodelle 21 genutzt. Darüber hinaus können isolierte Muskelfasern zusätzlich für Live-Bildgebung und für elektrophysiologische Studien 22, Techniken, die für die Abfrage der Schlüsselaspekte der Muskelfunktion ermöglichen verwendet werden. Das spezifische Protokoll für myofiber Isolierung sowie zwei Beispiele für nachfolgende analytische Experimente ist in den übrigen Teilen des Manuskripts detailliert.

<table><tbody><tr><td>24-well culture plate</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Invitrogen Gibco</td><td>70011</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Independent medium</td><td>Invitrogen Gibco</td><td>18045</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type II</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004186</td><td>Lot 41H12764</td></tr><tr><td>Collagenase Type IV</td><td>Worthington Biochemical</td><td>L5004188</td><td></td></tr><tr><td>8% Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>157-8</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Sheep serum</td><td>Sigma</td><td>S3772</td><td></td></tr><tr><td>Goat serum</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips</td><td>Fischerbrand</td><td>12-545-82 12CIR-1D</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;mu;m Filter</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m Filter</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold antifade reagent</td><td>Invitrogen</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Anti-&amp;alpha;-Actinin antibody</td><td>Sigma</td><td>A5044</td><td></td></tr><tr><td>Anti-RYR antibody</td><td>Abcam</td><td>34C</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor antibody</td><td>Invitrogen</td><td>A-21425</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Petri dish</td><td>Fischerbrand</td><td>0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Ornithine</td><td>Sigma</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slide</td><td>Fischerbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Caffeine</td><td>Sigma</td><td>C0750</td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of embryonic and larval zebrafish skeletal myofibers from dissociated preparations

Der Zebrafisch hat sich als ein wertvolles Modellsystem für die Erforschung der Skelettmuskelfunktion und für das Studium der menschlichen Muskelerkrankungen sein. Trotz der vielen Vorteile, die durch in vivo-Analyse von Skelettmuskel im Zebrafisch angeboten, die Visualisierung der komplexen und fein strukturierten Protein Milieu für die Muskelfunktion verantwortlich, insbesondere im gesamten Embryos, kann problematisch sein. Dieses Hindernis ergibt sich aus der geringen Größe des Zebrafisch-Skelettmuskel (60 um) und der noch geringeren Größe des Sarkomers. Hier beschreiben wir und zeigen, eine einfache und schnelle Methode zur Isolierung von Skelett Muskelfasern von Zebrafisch-Embryonen und Larven. Wir berücksichtigen auch Protokolle, die Postvorbereitungstechniken für die Analyse von Muskel-Aufbau und Funktion zu veranschaulichen. Insbesondere haben wir ausführlich die anschließende immunzytochemische Lokalisation von Skelettmuskelproteine ​​und die qualitative Analyse der Calcium-Freisetzung stimuliert via Live-Zelle Kalzium-Imaging. Insgesamt ist dieses VideoArtikel bietet eine unkomplizierte und effiziente Methode für die Isolierung und Charakterisierung von Zebrafisch-Skelett-Muskelfasern, eine Technik, die eine Leitung für unzählige nachfolgende Studien der Muskelstruktur und-Funktion bietet.

Fluoreszenz-Immunmarkierung von Muskelfasern (Fig. 2) Bilder, die erwarteten Fluoreszenzmarkierungsmuster von Muskelfasern immun nach erfolgreicher Isolierung und Beschichtung. Die Muskelfasern wurden mit entweder Anti-Ryanodin-Rezeptor (1:100) (2A) oder anti-α-Actinin (1:100) (2B) Antikörpern markiert worden sind, und zeigen die Immunfärbung der Triade und der Z-Bande auf. Sekundäre Antikörper waren Alexa Fluor 555 (1:500). Bi...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations at JoVE.com

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

Zebrafische sind ein Schwellensystem zur Modellierung menschlichen Erkrankungen der Skelettmuskulatur. Wir beschreiben eine schnelle und effiziente Methode, um Skelettmuskel Muskelfasern aus embryonalen Zebrafisch-Larven und zu isolieren. Dieses Verfahren ergibt eine hohe Dichte myofiber Vorbereitung für Untersuchung von einzelnen Skelettmuskelfasermorphologie, Protein subzelluläre Lokalisierung und Muskelphysiologie.

Analyse der embryonalen Zebrafisch-Larven-und Skelett Muskelfasern aus Dissoziierte Vorbereitungen

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

analysis-embryonic-larval-zebrafish-skeletal-myofibers-from

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

11.6K Aufrufe.  University of Michigan.  Zebrafische sind ein Schwellensystem zur Modellierung menschlichen Erkrankungen der Skelettmuskulatur. Wir beschreiben eine schnelle und effiziente Methode, um Skelettmuskel Muskelfasern aus embryonalen Zebrafisch-Larven und zu isolieren. Dieses Verfahren ergibt eine hohe Dichte myofiber Vorbereitung für Untersuchung von einzelnen Skelettmuskelfasermorphologie, Protein subzelluläre Lokalisierung und Muskelphysiologie. 

Serie: Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Analyse von Zebrafisch-Larven Skelettmuskel Integrität mit Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Using Touch-evoked Response and Locomotion Assays to Assess Muscle Performance and Function in Zebrafish

Zebrafish muscle development is highly conserved with mammalian systems making them an excellent model to study muscle function and disease. Many myopathies affecting skeletal muscle function can be quickly and easily assessed in zebrafish over the first few days of embryogenesis. By 24 hr post-fertilization (hpf), wildtype zebrafish spontaneously contract their tail muscles and by 48 hpf, zebrafish exhibit controlled swimming behaviors. Reduction in the frequency of, or other alterations in, these movements may indicate a skeletal muscle dysfunction. To analyze swimming behavior and assess muscle performance in early zebrafish development, we utilize both touch-evoked escape response and locomotion assays.
Touch-evoked escape response assays can be used to assess muscle performance during short burst movements resulting from contraction of fast-twitch muscle fibers. In response to an external stimulus, which in this case is a tap on the head, wildtype zebrafish at 2 days post-fertilization (dpf) typically exhibit a powerful burst swim, accompanied by sharp turns. Our method quantifies skeletal muscle function by measuring the maximum acceleration during a burst swimming motion, the acceleration being directly proportional to the force produced by muscle contraction.
In contrast, locomotion assays during early zebrafish larval development are used to assess muscle performance during sustained periods of muscle activity. Using a tracking system to monitor swimming behavior, we obtain an automated calculation of the frequency of activity and distance in 6-day old zebrafish, reflective of their skeletal muscle function. Measurements of swimming performance are valuable for phenotypic assessment of disease models and high-throughput screening of mutations or chemical treatments affecting skeletal muscle function.

Zebrafish are an excellent model to study muscle function and disease. During early embryogenesis zebrafish begin regular muscle contractions producing rhythmic swimming behavior, which is altered when the muscle is disrupted. Here we describe a touch-evoked response and locomotion assay to examine swimming performance as a measure of muscle function.

Mit Touch-evozierte Reaktion und Locomotion Assays zur Beurteilung der Muskelleistung und Funktion in Zebrabärbling

Zebrafish muscle development is highly conserved with mammalian systems making them an excellent model to study muscle function and disease. Many ...

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical strain. Skeletal joints are subjected to dynamic mechanical loading. Finite element analysis (FEA) is a computational method, frequently used in engineering that can predict how a material or structure will respond to mechanical input. By dividing a whole system (in this case the zebrafish jaw skeleton) into a mesh of smaller 'finite elements', FEA can be used to calculate the mechanical response of the structure to external loads. The results can be visualized in many ways including as a 'heat map' showing the position of maximum and minimum principal strains (a positive principal strain indicates tension while a negative indicates compression. The maximum and minimum refer the largest and smallest strain). These can be used to identify which regions of the jaw and therefore which cells are likely to be under particularly high tensional or compressional loads during jaw movement and can therefore be used to identify relationships between mechanical strain and cell behavior. This protocol describes the steps to generate Finite Element models from confocal image data on the musculoskeletal system, using the zebrafish lower jaw as a practical example. The protocol leads the reader through a series of steps: 1) staining of the musculoskeletal components, 2) imaging the musculoskeletal components, 3) building a 3 dimensional (3D) surface, 4) generating a mesh of Finite Elements, 5) solving the FEA and finally 6) validating the results by comparison to real displacements seen in movements of the fish jaw.

Finite Element Analysis is a frequently used tool to investigate the mechanical performance of structures under load. Here we apply its use to modeling the biomechanics of the zebrafish jaw.

Der Aufbau Finite-Elemente-Modelle zu Zebrabärbling Jaw Biomechanik Untersuchen

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

Examining Muscle Regeneration in Zebrafish Models of Muscle Disease

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, the muscle stem cell is activated and undergoes cell proliferation to generate a pool of myoblasts, which subsequently differentiate to form new muscle fibers. In many muscle wasting conditions, including muscular dystrophy and ageing, this process is impaired resulting in the inability of muscle to regenerate. The process of muscle regeneration in zebrafish is highly conserved with mammalian systems providing an excellent system to study muscle stem cell function and regeneration, in muscle wasting conditions such as muscular dystrophy. Here, we present a method to examine muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease. The first step involves the use of a genotyping platform that allows the determination of the genotype of the larvae prior to eliciting an injury. Having determined the genotype, the muscle is injured using a needle stab, following which polarizing light microscopy is used to determine the extent of muscle regeneration. We therefore provide a high throughput pipeline which allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

Skeletal muscle regeneration is driven by tissue resident muscle stem cells, which are impaired in many muscle diseases such as muscular dystrophy, and this results in the inability of muscle to regenerate. Here, we describe a protocol that allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

Untersuchung der Muskelregeneration in Zebrafischmodellen von Muskelerkrankungen

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, ...

Real Time and Repeated Measurement of Skeletal Muscle Growth in Individual Live Zebrafish Subjected to Altered Electrical Activity

A number of methods can be used to visualize individual cells throughout the body of live embryonic, larval or juvenile zebrafish. We show that live fish with fluorescently-marked plasma membranes can be scanned in a confocal laser scanning microscope in order to determine the volume of muscle tissue and the number of muscle fibers present. Efficient approaches for the measurement of cell number and size in live animals over time are described and validated against more arduous segmentation methods. Methods are described that permit the control of muscle electrical, and thus contractile, activity. Loss of skeletal muscle contractile activity greatly reduced muscle growth. In larvae, a protocol is described that allows reintroduction of patterned electrical-evoked contractile activity. The described methods minimize the effect of inter-individual variability and will permit analysis of the effect of electrical, genetic, drug, or environmental stimuli on a variety of cellular and physiological growth parameters in the context of the living organism. Long-term follow-up of the measured effects of a defined early-life intervention on individuals can subsequently be performed.

Optical clarity is a major advantage for cell biological and physiological work in zebrafish. Robust methods for measurement of cell growth in individual animals are described that permit novel insights into how growth of skeletal muscle and neighboring tissues are integrated with whole body growth.

Echtzeit- und wiederholte Messung des Skelettmuskelwachstums bei einzelnen lebenden Zebrafischen, die einer veränderten elektrischen Aktivität ausgesetzt sind

A number of methods can be used to visualize individual cells throughout the body of live embryonic, larval or juvenile zebrafish. We show that live fish ...

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology and genetics 1,2. About 100-200 embryos are readily available every week from a single pair of adult fish. The transparent embryos that develop ex utero make them ideal for assessing cardiac defects 3. The expression of any gene can be manipulated via morpholino technology or RNA injection 4. Moreover, forward genetic screens have already generated a list of mutants that affect different perspectives of cardiogenesis 5. 
Whole mount immunostaining is an important technique in this animal model to reveal the expression pattern of the targeted protein to a particular tissue 6. However, high resolution images that can reveal cellular or subcellular structures have been difficult, mainly due to the physical location of the heart and the poor penetration of the antibodies. 
 Here, we present a method to address these bottlenecks by dissecting heart first and then conducting the staining process on the surface of a microscope slide. To prevent the loss of small heart samples and to facilitate solution handling, we restricted the heart samples within a circle on the surface of the microscope slides drawn by an immEdge pen. After the staining, the fluorescence signals can be directly observed by a compound microscope. 
Our new method significantly improves the penetration for antibodies, since a heart from an embryonic fish only consists of few cell layers. High quality images from intact hearts can be obtained within a much reduced procession time for zebrafish embryos aged from day 2 to day 6. Our method can be potentially extended to stain other organs dissected from either zebrafish or other small animals.

A rapid way to conduct immunostaining of zebrafish embryonic heart is described. Compared to the whole mount immunostaining approach, this method dramatically increases the penetration of the antibodies, which allows obtaining high resolution images that reveal cellular/subcellular structures in the heart within a much reduced processing time.

Immunfärbung von Dissected Zebrafisch embryonale Herz

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology ...

Biologie

Semi-automated Analysis of Mouse Skeletal Muscle Morphology and Fiber-type Composition

For years, distinctions between skeletal muscle fiber types were best visualized by myosin-ATPase staining. More recently, immunohistochemical staining of myosin heavy chain (MyHC) isoforms has emerged as a finer discriminator of fiber-type. Type I, type IIA, type IIX and type IIB fibers can now be identified with precision based on their MyHC profile; however, manual analysis of these data can be slow and down-right tedious. In this regard, rapid, accurate assessment of fiber-type composition and morphology is a very desirable tool. Here, we present a protocol for state-of-the-art immunohistochemical staining of MyHCs in frozen sections obtained from mouse hindlimb muscle in concert with a novel semi-automated algorithm that accelerates analysis of fiber-type and fiber morphology. As expected, the soleus muscle displayed staining for type I and type IIA fibers, but not for type IIX or type IIB fibers. On the other hand, the tibialis anterior muscle was composed predominantly of type IIX and type IIB fibers, a small fraction of type IIA fibers and little or no type I fibers. Several image transformations were used to generate probability maps for the purpose of measuring different aspects of fiber morphology (i.e., cross-sectional area (CSA), maximal and minimal Feret diameter). The values obtained for these parameters were then compared with manually-obtained values. No significant differences were observed between either mode of analysis with regards to CSA, maximal or minimal Feret diameter (all p &#62; 0.05), indicating the accuracy of our method. Thus, our immunostaining analysis protocol may be applied to the investigation of effects on muscle composition in many models of aging and myopathy.

Immunohistochemical staining of myosin heavy chain isoforms has emerged as the state-of-the-art discriminator of skeletal muscle fiber-type (i.e., type I, type IIA, type IIX, type IIB). Here, we present a staining protocol along with a novel semi-automated algorithm that facilitates rapid assessment of fiber-type and fiber morphology.

Semi-automatische Analyse von Maus Skelettmuskulatur Morphologie und Fasertyp Zusammensetzung

For years, distinctions between skeletal muscle fiber types were best visualized by myosin-ATPase staining. More recently, immunohistochemical staining of ...

Medizin

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional measures of muscle health. In this video article, we demonstrate a method to measure force generation during contraction of zebrafish larval trunk muscle. Force measurements are accomplished by placing an anesthetized larva into a chamber filled with a salt solution. The anterior end of the larva is tied to a force transducer and the posterior end of the larva is tied to a length controller. An isometric twitch contraction is elicited by electric field stimulation and the force response is recorded for analysis. Force generation during contraction provides a measure of overall muscle health and specifically provides a measure of muscle function. Although we describe this technique for use with wild-type larvae, this method can be used with genetically modified larvae or with larvae treated with drugs or toxicants, to characterize muscle disease models and evaluate treatments, or to study muscle development, injury, or chemical toxicity.

Force measurements can be used to demonstrate changes in muscle function due to development, injury, disease, treatment or chemical toxicity. In this video, we demonstrate a method to measure force during a maximal contraction of zebrafish larval trunk muscle.

Kraftmessung während der Kontraktion zu Muscle Funktion in Zebrafisch-Larven bewerten

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular dystrophies1-3, congenital myopathies4,5, and disruptions in sarcomeric assembly6,7, due to high genomic and structural conservation with mammals8. Muscular disorganization and locomotive impairment can be quickly assessed in the zebrafish over the first few days post-fertilization. Two assays to help characterize skeletal muscle defects in zebrafish are birefringence (structural) and touch-evoked escape response (behavioral).
Birefringence is a physical property in which light is rotated as it passes through ordered matter, such as the pseudo-crystalline array of muscle sarcomeres9. It is a simple, noninvasive approach to assess muscle integrity in translucent zebrafish larvae early in development. Wild-type zebrafish with highly organized skeletal muscle appear very bright amidst a dark background when visualized between two polarized light filters, whereas muscle mutants have birefringence patterns specific to the primary muscular disorder they model. Zebrafish modeling muscular dystrophies, diseases characterized by myofiber degeneration followed by repeated rounds of regeneration, exhibit degenerative dark patches in skeletal muscle under polarized light. Nondystrophic myopathies are not associated with necrosis or regenerative changes, but result in disorganized myofibers and skeletal muscle weakness. Myopathic zebrafish typically show an overall reduction in birefringence, reflecting the disorganization of sarcomeres.
The touch-evoked escape assay involves observing an embryo&#39;s swimming behavior in response to tactile stimulation10-12. In comparison to wild-type larvae, mutant larvae frequently display a weak escape contraction, followed by slow swimming or other type of impaired motion that fails to propel the larvae more than a short distance12. The advantage of these assays is that disease progression in the same fish type can be monitored in vivo for several days, and that large numbers of fish can be analyzed in a short time relative to higher vertebrates.

The zebrafish is now an established and powerful tool for modeling muscular dystrophies, congenital myopathies, and related neuromuscular diseases. Birefringence and touch-evoked escape behavior are two common noninvasive assays used to determine the degree of muscular disorganization and locomotive impairment of zebrafish embryos during early development.

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the zebrafish cardiovascular tissues have been limiting in studying their electrophysiological properties. Previous methods have been described for dissection of zebrafish hearts and isolation of ventricular cardiac myocytes. However, the isolation of zebrafish atrial and vascular myocytes for electrophysiological characterization was not detailed. This work describes new and modified enzymatic protocols that routinely provide isolated juvenile and adult zebrafish ventricular and atrial cardiomyocytes, as well as vascular smooth muscle (VSM) cells from the bulbous arteriosus, suitable for patch-clamp experiments. There has been no literary evidence of electrophysiological studies on zebrafish cardiovascular tissues isolated at embryonic and larval stages of development. Partial dissociation techniques that allow patch-clamp experiments on individual cells from larval and embryonic hearts are demonstrated.

The present protocol describes the acute isolation of viable cardiac and vascular smooth muscle cells from adult, juvenile, larval, and embryonic zebrafish (Danio rerio), suitable for electrophysiological studies.

Isolierung von kardialen und vaskulären glatten Muskelzellen aus adulten, juvenilen, Larven und embryonalen Zebrafischen für elektrophysiologische Studien

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...