LHB wurde von der Wellcome Trust Dynamische Zell PhD-Programm finanziert werden; KAR wurde von MRC Projektförderung MR / L002566 / 1 (vergeben EJR und CLH) gefördert und CLH wurde von ARUK Zuschuss 19479. finanziert Wir würden auch die Wolfson Bioimaging Einrichtung für die Bildgebung Beratung danken.

Alle Schritte innerhalb des Protokolls folgen der University of Bristol Tierpflege und Tierschutz-Richtlinien und die des britischen Innenministeriums. 1. Visualisierung von Muskel-Skelett-Anatomie HINWEIS: Um die Form der Skelettelemente visualisieren, Muskel zu quantifizieren und die genaue Platzierung der Muskelansätze, immunostain (Abschnitt 1.1) Fisch im entsprechenden Alter für Skelett-Myosin (die Muskel zeigt) zu identifizieren und Typ-II-Kollagen (zu visualisieren Knorpel). Alternativ visualisieren die Muskel - Skelett - Anatomie transgenen fluoreszierenden Reporterlinien wie die Kollagen a1 Reporter COL2A1 mit: mCherry 13,14 Knorpel und die langsame Myosin schwere Kette Reporter smyhc sichtbar zu machen: 15 GFP die Position der Muskelansätze (Abschnitt 1.2) zu visualisieren. Alternative Linien, die Knorpel und Muskeln markieren könnte genauso gut funktionieren. <ol><li> Fluoreszierende Immunostaining <ol><li> Fix Larve in überschüssigem 4% Paraformaldehyd (PFA) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) für 1 Stunde. Waschen in PBS mit 0,1% Tween 20 (PBT) und entwässern jeweils in 50% Methanol (MeOH) in PBT und 100% MeOH für 5 min. Achtung: PFA ist giftig und sollte in Übereinstimmung mit dem Material Sicherheitsdatenblatt behandelt werden. HINWEIS: Larve kann in 100% Methanol gelagert werden, bis sie benötigt. </li><li> Rehydrate Larve in 50% MeOH in PBT für 5 min. Waschen in PBT für 5 min. </li><li> Permeabilisierung Larve in 0,25% Trypsin in PBT auf Eis für 5-6 min. in 4x PBT Waschen für jeweils 5 Minuten. </li><li> Block für 2-3 h in 5% Serum in PBT. </li><li> Inkubieren Larve in der empfohlenen Verdünnung von Kaninchen-Anti-Typ-2-Kollagen und Maus-anti-Myosin-Antikörper in 5% Serum in PBT für 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C. HINWEIS: Die empfohlene Verdünnungsbereich ist in der Regel auf dem Blatt Antikörper Daten. Wählen Antikörper, die gegen verschiedene Arten angehoben sind miteinander und auch diffemieten, um das Gewebe. </li><li> Waschen Sie Larve 6x für 15 Minuten in PBT. </li><li> Block für 1-2 h in 5% Serum in PBT. </li><li> Inkubieren in Sekundärantikörper im Dunkeln. Verwenden fluoreszenzmarkierten Anti-Maus (550) und Anti-Kaninchen (488) Sekundärantikörper bei einer geeigneten Verdünnung in 5% Serum und PBT für den spezifischen Antikörper. </li><li> Wasch 6X für jeweils 10 Minuten in PBT und Bild auf einem Mikroskop 10X konfokalen so schnell wie möglich. </li></ol></li><li> Imaging Muskel - Skelett - Geometrie <ol><li> Montieren Sie die Larven ventral auf einem Deckglas in lauwarmem 0,3-0,5% mit niedrigem Schmelzpunkt (LMP) Agarose in Danieau-Lösung 16. HINWEIS: Transgene Fische müssen in 0,02% MS222 (Tricaine Methansulfonat, pH 7) vor der Montage und während der Bildgebung sediert werden. </li><li> Nehmen Sie eine konfokale Bildstapel aus der Region von Interesse mit dem 10fach Objektivlinse und das etwa 2,5-fache Digitalzoom. Bereiten Sie Bilder des grünen und roten Kanal mit der 488 nm und 561 nm-Laser sind. Bild mit einer 512 x 512 Pixel Auflösung mit einem Intervall zwischen z-Ebene von 1,3 um und 3 Linie Durchschnitt. Der resultierende Stapel wird von etwa 100 z Scheiben umfassen. </li><li> Exportieren Sie die Daten als TIFF-Serie. Maximale Projektionen der Muskel und des Knorpels Elemente aus einer 5dpf Zebrabärbling Larven sind in Abbildung 1 dargestellt. </li></ol></li></ol> 2. Erstellen eines 3D-Oberflächen <ol style="margin-left: 40px;"><li> Wählen Sie einen repräsentativen Datensatz für jeden Zeitpunkt auf 3, 4 und 5 dpf (wählen Sie nach Visualisierung mehrerer Proben). </li><li> Öffnen Sie 3-dimensionalen TIFF-Stapel und wählen Sie alle Kanäle in der Analyse-Software. Rechtsklick auf den Knorpel Kanal und wählen Sie die Bildfilter und Glättung: Gaussian (2B). </li><li> In Projektansicht rechts auf gefilterte Bild klicken und wählen Sie &quot;Bildsegmentierung&quot; und dann &quot;bearbeiten neues Label &#39;. Erstellen Sie ein neues Etikett für jedes Material, das heißt, Knorpel und junkt. Wählen Sie den Knorpelbereich des Bildes (2C, weißes Signal, lila Umriss) mit dem Zauberstab - Werkzeug. Verwenden Sie das Pinsel-Werkzeug Lärm von den Umrissen zu entfernen. HINWEIS: Wenn Zauberstab-Werkzeug, klicken Sie auf &quot;Alle Scheiben &#39;. </li><li> Wählen Sie den Verbindungsbereich mit dem Pinsel - Werkzeug und weisen auf eine gemeinsame Komponente (2C, blau umrandet) </li><li> Glatte mehrere Scheiben auf einmal durch die Segmentierung im oberen Menü und glatt Auswahl von Etiketten. Rechtsklick auf das Bild und wählen Sie erzeugen Oberfläche eine 3D - Oberfläche des Bauteils (2D) machen zu erzeugen. </li><li> Klicken Sie auf die Oberfläche und Speichern von Daten als hmascii Datei für den Import in kämmenden Software. </li></ol> 3. Berechnung der Muskelkräfte zu sein, in dem FE-Modell <ol style="margin-left: 40px;"><li> Zählen Sie die Anzahl der Muskelfasern von konfokalen Bildern von smyhc: GFP transgenen Zebrabärbling (1A, Pfeilspitze, 1C) und messen Sie den Durchmessereter der Fasern ihre Querschnittsfläche (&amp; pgr; r 2) zu berechnen. </li><li> Identifizieren geeigneter Kraft pro Flächeneinheit Muskel aus der Literatur. Die maximale Muskelkraft erzeugt pro Flächeneinheit für Larven Zebrabärbling Skelettmuskulatur (40 nN / &amp; mgr; m 2) wurden 17 verwendet. </li><li> Berechnen der Kräfte für jeden anatomischen Muskelgruppe durch die Anzahl der Fasern und deren Multiplikation Fläche durch die Kraft pro Flächeneinheit. Siehe Tabelle 1. </li></ol> 4. Erstellen eines Netz <ol style="margin-left: 40px;"><li> Importieren Sie das 3D-Modell erzeugt in Abschnitt 2 (siehe oben) in ein Softwarepaket der Lage, eine Finite-Elemente-Netz zu erzeugen. </li><li> Generieren A2D Maschen des Knorpel- und Gelenkoberflächen durch die Schrumpffolie Werkzeug unter dem 2D-Menü. Wählen Sie eine entsprechende Elementgröße. Hinweis: Verwenden Sie eine Elementgröße zwischen 1,5-2,5. Falls erforderlich, erzeugen eine Reihe von unterschiedlich großen 2D-Oberflächennetze 3D-Mesh-Optimierung durchzuführen (§ 4.4). </li><li> Führen Sie Mesh Qualitätskontrollen unter den gefundenen &#39;2D&gt; Tools&gt; Überprüfen Sie Elemente&#39; Panel für duplizierte Elemente, Einfügungen und Durchdringungen im Netz zu überprüfen. Fix Diederwinkeln durch das Dienstprogramm Registerkarte in Modellbaum verwenden. </li><li> Generieren Sie ein 3D-Netz aus den 2D-Oberflächennetzen unterschiedlicher Elementgröße mit Hilfe der 3D&gt; Tetramesh subpanel. HINWEIS: Vergleichen Sie die Ergebnisse verschiedener Maschengrößen und wählen Sie das FE-Modell mit der Größe niedrigsten Netz, das nach einer weiteren Simulationen konvergiert und keine Funktionsdefinition beeinträchtigen. Das Beispiel in Figur 3 enthält 1.500.000 tetraedrischen Elemente für den Unterkiefer Knorpeln und hatte eine 2D Elementgröße von 2,0. </li><li> Verwandeln Sie das Netz so Kiefermodell nach konfokalen Stapel zu skalieren ist mit der Geometrie&gt; Entfernung subpanel. HINWEIS: Sicherstellen, dass die Knorpel und Gelenkkomponenten sind in dem Modell verbunden durch ein Mischmodell zu exportieren oder durch Bindern. </li></ol> 5. Finite-Elemente-Model Baumaschinen <ol><li> Mit kommerziellen Finite-Elemente (FE) Software eine FE-Modell. Mit Hilfe der 3D-Muskeln und Knorpel markierte konfokalen Stapel erzeugt in Abschnitt 1 als Leitfaden, weisen Knoten, die zu Muskelansatzpunkte entsprechen. Erstellen Sie einen Vektor zwischen zwei Knoten , die den Ursprung und die Einfügung eines jeden Muskel (Abbildung 3). </li><li> Erstellen Sie eine Last Sammler des Typs &#39;Geschichte&#39; a &#39;C-Last&#39; zu gelten für jeden Muskel. Geben Sie den Betrag in Newton (berechnet in Schritt 3.3) und weisen Sie den zugehörigen Vektor. 3 sind die Befestigungspunkte für die Adduktoren mandibulae (AM) zeigt, Winkelmesser hyoideus (PH) und intermandibularis (IM). HINWEIS: Für diese Kiefermuskeln, Kraft maximale Kontraktions zwischen Ursprung und Ansatz so, dass nur 50% der jeweiligen Last verteilt wird an jedem Standort angewendet wird. </li><li> Weisen Sie entsprechende elastische isotropen Materialeigenschaften, wie durch die Literatur bestimmt. Young-Modul für die Knorpelund die Interzone in diesem Modell waren 1,1 MPa und 0,25 MPa bzw. und das Poisson-Verhältnis betrug 0,25 für beide 18,19. </li><li> Erstellen Sie eine Last Sammler des Typs &#39;Grenze&#39; anfänglichen Beschränkungen für das Modell anzuwenden. Gehen Sie auf die Registerkarte Analyse&gt; Constraints und im schaffen subpanel, wählen Sie die Knoten auf dem Modell, das Sie möchten, zu beschränken. Wählen Sie die Freiheitsgrade (DOF) diese Grenze Bewegung des Modells auf die beste Annäherung seiner natürlichen Bewegungsbereich. HINWEIS: Das Modell in Figur 3 wurde in allen Bewegungsachsen begrenzt (DOF: 1, 2, 3 für x, y und z, jeweils) am ceratohyal es im Raum zu verankern , an einem mittleren Punkt in dem Modell und in der Achse y und z an dem Punkt , wo die palatoquadrate zum Rest des Schädels Zebrabärbling verbindet (Abbildung 3, Tabelle 1). Das Modell muss in allen drei DOF in mindestens einem Knoten eingeschränkt werden. </li><li> Erstellen Sie ein &#39;Load Schritt&#39;, für jede Art von Bewegung, die Sie möchten simulaßen ( das heißt, Öffnen, Schließen), unter der Analysemenü und wählen Sie alle relevanten Lasten (hergestellt in Abschnitt 5.2) und Beschränkungen (hergestellt in Abschnitt 5.4) , um diese Bewegung zu simulieren. Wählen Sie &#39;Static&#39; aus dem Dropdown-Menü, wenn es erscheint. </li><li> Exportmodell einschließlich der Masche, Lasten, Randbedingungen und Materialeigenschaften in einem geeigneten Dateiformat, in diesem Fall &quot;.inp&quot; Format. </li><li> Lastmodell in FE-Analyse-Software. Erstellen Sie einen Job für das Modell ausführen mit dem Job-Modul. </li><li> Analysieren Ausgang für Spannung, Dehnung, Verschiebung usw. in der Ergebnisse Tab und Visualisierung Menü (Abbildung 4 und 5). </li></ol> 6. Validierung von Jaw Deformation / Displacement Entfernungen <ol><li> Wählen Sie 3-6 Tg (Col2a1aBAC: mCherry) transgenen Zebrafisch. </li><li> betäuben leicht die Larven mit 0,02% MS222, bis sie nicht mehr zu reagieren, aber ihre Herzen zu berühren schlagen immer noch. </li><li> Montierendie Larven seitlich (während narkotisierten) auf Deckgläsern in lauwarmem 1% LMP-Agarose (hergestellt in Danieau-Lösung). </li><li> Entfernen Sie die Agarose aus um den Kopf und Kiefer mit einer Pinzette. </li><li> Spülen Sie frische Danieau-Lösung (ohne MS222) über den Kopf der Larve zu entfernen Anästhesie mit einer Pasteur-Pipette, bis die normale Mundbewegungen wieder aufnehmen. </li><li> Verwenden Sie Film-Capture-Software Hellfeld High-Speed-Videos von Mundbewegungen zu nehmen. Nehmen Sie Filme von rund einer Minute Dauer auf dem höchsten Framerate, oder ausreichend mehrere Zyklen von Maulöffnung aufzunehmen. </li><li> Wählen Sie Frames, die den Kiefer offen zu seiner maximalen Verschiebung zeigen. Messen Sie den Abstand zwischen der vorderen Spitze des Meckel-Knorpel und Oberkiefer (Spitze des ethmoid Platte) in &amp; mgr; m. </li><li> Berechnen Sie die mittlere Verschiebung von mehreren Fischlarven. </li><li> Auszug Verschiebungsdaten aus dem Modell. Verwenden Sie die mittlere Verschiebung in 6.8 berechneten Modell Verschiebung Verhalten zu überprüfen ( <strong&gt; 4). Wenn das Modell abweicht von den erwarteten, führen Sensitivitätsanalyse durch sequentielles Materialeigenschaften und Muskelbelastungen zu verändern. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren. Einige Daten in den 3-5 wurde von J.Biomech nachgedruckt, 48 (12), Brunt et al., Finite - Elemente - Modellierung prognostiziert Veränderungen in gemeinsamen Form und das Verhalten der Zelle durch den Verlust von Muskelzerrung in Kieferentwicklung, 3112-22. 2015 mit Genehmigung von Elsevier 15.

Finite - Elemente - Modelle wurden verwendet , um die Bereiche der Skelettelemente zu beziehen , die unter Belastung mit denen unterzieht die Knochenbildung sind 10, sowie die Bereiche unter Belastung während endochondral Verknöcherung und Joint Morphogenese 8,12,21 abzubilden. Andere Studien konnten auch theoretische Wachstumsmodelle anwenden Veränderungen 11,12 während die gemeinsame Entwicklung zu replizieren. Hier zeigen wir das Protokoll für den Aufbau von FE - Modellen für ein relativ einfaches System, der Zebrabärbling Backe 20. Im Gegensatz zu alternativen Methoden der Rohbilder für die FE - Modelle sammeln, wie beispielsweise CT - Abtastung 22, konfokale Bildgebung transgener Linien oder immunhistochemisch Zebrabärbling ermöglicht mehrere Gewebe untersucht werden. Es kann daher liefern direkte Informationen über Muskelbefestigungspunkte in Bezug auf Knorpel. Unter wirbel Modelle sind Zebrabärbling besonders zugänglich für genetische und pharmakologische Manipulation. Die Erzeugung von FE-Modellen für Zebrabärblingcraniofacial Knorpel eröffnet nun die Möglichkeit einer weiteren Untersuchung der Wechselwirkung zwischen Biomechanik und Genetik in gemeinsamen Morphogenese auf. Es gibt eine Reihe von kritischen Schritte in den Prozess ein FE-Modell erzeugt wird; Die erste ist eine genaue dreidimensionale Darstellung des Systems zu erzeugen. Dies erfordert Bildgebung bei ausreichend hoher Auflösung zu deutlich Grenzen definieren. Beachten Sie, dass auch bei Bildgebung mit hoher Auflösung eine gute Oberfläche zu machen, muss dieser einige Regionen glätten kann. Ein weiterer wichtiger Schritt ist die Definition, die korrekte Platzierung der Last und korrekte Einschränkungen. Ein unzureichend eingeschränkt Modell scheitern wird und eine falsche Platzierung der Lasten zu lösen abnorme Bewegung verursachen. Einige Verarbeitung der Rohdaten (Figur 2) ist notwendig , da eine Oberfläche aus den Rohdaten erzeugt würde schwierig sein Mesh (2B). Wir gefiltert , um die Daten , die ein Gauß - Filter (Abbildung 2C </strong&gt;) und führten wir einige manuelle Glätten der Kurven, um eine Reihe von sauberen Konturen zu erzeugen, die in einer 3D-Oberfläche umgewandelt werden können. Zu viel Glättung kann eine &quot;geschmolzen&quot; Oberfläche erzeugen, die viele ihrer Funktionen verloren hat. die richtige Elementgröße zu wählen, ist ein iterativer Prozess als zu klein Wahl eines Elementgröße ein Netz zu groß schafft, die sehr rechenintensiv ist. Allerdings wird zu groß, ein Element der Wahl der Größe erzeugen ein Netz, das die richtige Form der Struktur zu rekapitulieren ausfällt. Die richtige Masche hatte das kleinste Element Größe, die die richtige Form des Kiefers erfasst und konvergierte auf eine korrekte Lösung, überprüften die Backenbewegung verwenden. Es kann auch erforderlich sein, um die Materialeigenschaften oder Lastberechnungen zu ändern, um besser die korrekte Verschiebung emulieren, wie unterschiedlichen Alters und Arten werden im Wesentlichen unterschiedliche Eigenschaften haben. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass es immer Einschränkungen auf ein hypothetisches Modell und einssumptions gemacht FE-Modelle laufen. Wenn nur eine oder eine kleine Anzahl von Proben Modellierung ist es wichtig, sicherzustellen, dass eine repräsentative Probe, wie es gewählt wird, sind wahrscheinlich kleine Variationen zwischen Individuen. Da nur enthalten waren einige der Backenelemente und Muskeln, das Modell ist eine vereinfachte Version des Zebrabärbling craniofacial Muskel-Skelett-Systems. Daher mussten Einschränkungen positioniert werden, um zu erklären, wo die modellierten Backenelemente mit dem Rest des Schädels in Verbindung bringen würde und das Modell wurde künstlich im Zentrum gezwungen es in &quot;Raum&quot; zu beheben. Diese künstliche Einschränkung Auswirkungen nicht auf die Interpretation aus den Modellen als ceratohyal gezogen selbst nicht analysiert. Die Einbeziehung von mehr der kraniofazialen Struktur, vor allem andere Maulöffnung Muskeln wie die sternohyals und der ihr beigefügten Knorpel 23, könnte zum Modell hinzugefügt, aber Einschränkungen umfassen die Fähigkeit der größeren Modelle in der Finite - Elemente - Software auszuführen. s = &quot;jove_content&quot;&gt; Eine weitere Einschränkung besteht darin , dass wir nicht Bandinsertion modelliert, obwohl dies durch die Insertion von Federn 8 erreicht werden konnten. Eine andere Annahme in diesem Fall war, dass das Modell linear verhalten würde. Die Größen der Stämme auf die Modelle waren vergleichbar mit denen , die in der veröffentlichten Modelle und auf in - vitro - Zellen 10,24, mit Stämmen unter 3500 und über -5.000 μɛ abgesehen von Zwang und Muskelansatzpunkte sein. Daher wurden die Stämme in den jeweiligen Regionen des Modells innerhalb eines Bereichs akzeptabel für ein lineares Modell angesehen. Cartilage verhält sich nicht ganz als lineares Material und hat zuvor als poroelastischer Material modelliert, die 25 Analyse des Fluid Verhalten im Modell aktiviert. Verbreiten der Muskelansatzpunkte unter einer Gruppe von lokalen Knoten würde die Spitzenkräfte verteilen und genauer den Muskelansatz für bestimmte Muskeln darstellen. ent &quot;&gt; Verwendung von FE ermöglicht eine Bewertung der auf einer Struktur wirkenden Dehnungen und Spannungen. Als Technik häufig in vielen biowissenschaftlichen Disziplinen einschließlich der Orthopädie, Paläontologie und in jüngerer Zeit die Entwicklungsbiologie verwendet wird. Hier beschreiben wir, wie FES für die Zebrabärbling bauen Unterkiefer. in Zukunft könnten diese Modelle auf der ganzen Kiefer aussehen erweitert werden, einschließlich des Gaumens. Ähnliche Techniken verwendet werden könnten, spinal Biomechanik in Fischen, die bisher meist durch kinematische Mittel untersucht worden sind, zu modellieren.

Finite - Elemente (FE) Modellierung ist ein Engineering - Technik , die rechnerisch berechnen kann und ordnen Sie die Größe und Lage der Stämme auf einer Struktur wirken 1. Das Modell besteht aus der 3D-Struktur, die von einem Netz von &quot;Finite Elemente&quot; dargestellt, und das Endergebnis der Analyse wird durch eine Anzahl von Faktoren ab, einschließlich der Struktur und der Anzahl der Elemente in dem Gitter, die Größe und die Position der mechanischen geregelt Lasten und die Materialeigenschaften. Materialeigenschaften beschreiben bestimmte Aspekte des Verhaltens eines Materials unter einer bestimmten Art der Last; Elastizitätsmodul (E) beschreibt die Elastizität des Materials, während das Poisson-Verhältnis des proportionalen Abnahme der Breite des Materials zu seiner Länge beschreibt, wenn eine Probe gestreckt wird. FE-Modellierung verwendet werden, um eine Vielzahl von Variablen auf dem Modell unter Berücksichtigung der einzigartigen Eingangsdaten über die Struktur einschließlich Verschiebung, Stress, Druck und Dehnung wirkend zu berechnen &#39;; S Form, Lage und Größe der Lasten und die spezifischen Materialeigenschaften. FE - Modellierung wird in der Technik 2 und zunehmend auch für orthopädische 3 und paläontologische Anwendungen 4 weit verbreitet. In der Entwicklung sind als Anregung in vielen Zellen zu biomechanischen Kräfte bekannt wirken zu aktivieren Zellantworten 5-8 und es ist nützlich , sowohl die relativen Positionen und Grßen der mechanische Reize innerhalb der Entwicklungsorgansysteme vorherzusagen, wurde jedoch noch FE Modellierung wenig gebraucht für Zebrabärblingentwicklung. Sowohl Knorpel und Knochen wurden mechanosensitive Materialien erwiesen. Beispielsweise in vitro Kompression gefunden wurde chondrogene Wege zu aktivieren, während die Spannung für die Knochenbildung 9 notwendig erwiesen hat. FE-Analyse (FEA) wurde ausgebeutet Stämme wirken auf biologische Proben zu modellieren, einschließlich derjenigen, auf die Skelettelemente während Knochen wirkenden formationen 10. Andere Entwicklungsanwendungen umfassen seine Verwendung die Form eines gemeinsamen vorherzusagen , nachdem es 11,12 theoretischen biomechanischen Kräften ausgesetzt wurde und das Muster der Stämme 8 vorhanden während Küken Kniegelenk Morphogenese zu zeigen. Dieses Protokoll wird auf die gemeinsame Nutzung der Erfahrungen soll der Erzeugung von 3-dimensionalen Oberflächen, Netze und Finite-Elemente-Modelle von konfokalen Bildern, mit denen die Mechanik der Entwicklung von Geweben zu verstehen. Wir zeigen Ihnen auch Möglichkeiten, die FE - Modelle Validierung obwohl echte gemeinsame Verschiebungsinformation in vivo zu erfassen. Während wir die Zebrabärbling Kiefer als ein Beispiel die gleichen Techniken verwenden könnte auf jedem kleinen biologischen System verwendet werden, für die 3D-Informationen über die Struktur des Muskel-Skelett-System kann durch konfokale oder Multiphotonen-Imaging erhalten werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="937">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Coll2</td>
			<td style="width:237px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab34712</td>
			<td style="width:365px;">Type II collagen antibody - stains all cartilage</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">A4.1025 / MF20</td>
			<td style="width:237px;">Developmental studies hybridoma bank</td>
			<td style="width:119px;">A4.1025</td>
			<td>Skeletal mysoin antibody - marks all skeletal muscle&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Low melt agarose</td>
			<td style="width:237px;">Sigma&#160;</td>
			<td>A9414-5G</td>
			<td>For mounting zebrafish</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MS222 (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate )</td>
			<td style="width:237px;">Sigma</td>
			<td>E10521-10G</td>
			<td>To make anaesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin</td>
			<td style="width:237px;">Fisher</td>
			<td>T/3760/48</td>
			<td>sample permeablilisation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dylight 488Mouse IgG</td>
			<td style="width:237px;">Thermofisher</td>
			<td align="right" style="width:119px;">35502</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dylight 550 Rabbit IgG</td>
			<td style="width:237px;">Thermofisher&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">84541</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SP8/SP5 or SPE confocal</td>
			<td style="width:237px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For imaging&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;LAS Leica capture software&#160;</td>
			<td style="width:237px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Aviso (version 7.0.0)</td>
			<td style="width:237px;">FEI Visualization Science Group</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>3D image analysis software (Section 2)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Hypermesh part of the Hyperworks package (version 10)</td>
			<td style="width:237px;">Altair Engineering</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>FE model generating software (Section 4-5)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Abaqus (version 6.14)</td>
			<td style="width:237px;">SIMULIA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>FE analysis software (Section 5.7-5.8)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

building finite element models to investigate zebrafish jaw biomechanics

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical strain. Skeletal joints are subjected to dynamic mechanical loading. Finite element analysis (FEA) is a computational method, frequently used in engineering that can predict how a material or structure will respond to mechanical input. By dividing a whole system (in this case the zebrafish jaw skeleton) into a mesh of smaller 'finite elements', FEA can be used to calculate the mechanical response of the structure to external loads. The results can be visualized in many ways including as a 'heat map' showing the position of maximum and minimum principal strains (a positive principal strain indicates tension while a negative indicates compression. The maximum and minimum refer the largest and smallest strain). These can be used to identify which regions of the jaw and therefore which cells are likely to be under particularly high tensional or compressional loads during jaw movement and can therefore be used to identify relationships between mechanical strain and cell behavior. This protocol describes the steps to generate Finite Element models from confocal image data on the musculoskeletal system, using the zebrafish lower jaw as a practical example. The protocol leads the reader through a series of steps: 1) staining of the musculoskeletal components, 2) imaging the musculoskeletal components, 3) building a 3 dimensional (3D) surface, 4) generating a mesh of Finite Elements, 5) solving the FEA and finally 6) validating the results by comparison to real displacements seen in movements of the fish jaw.

Immunofärbung für Muskel (1A) und des Knorpels (1B) bzw. Abbildungs transgener Reportern (1C) kann die 3D - Struktur des Kiefers visualisiert werden, zusammen mit der zugeordneten Muskulatur. Durch Bildgebung mit einer hohen Auflösung war es möglich , ein Modell zu erstellen , die sowohl die dreidimensionale Form des Kiefers (Abbildung 2) und die Lage und Anordnung der Lasten (3) erfasst. Unter Verwendung in vivo Verschiebungen hoher Geschwindigkeit Video - Capture (Abbildung 4) durch verifiziert wir , dass der Bereich der Bewegung in dem Modell in einem realistischen Bereich war. Die FE - Modelle einmal laufen können eine Reihe von Daten anzuzeigen, wie Stress (5A), minimale und maximale Hauptdehnung (- K 5B) verwendet werden. Diese Ergebnisse sind drei-dim<html> ensional so kann das Modell feine Muster Detail (5E, 5I) zu sehen , der vergrößert werden soll relevante Ansichten (5F, 5G, 5J, 5K) und digital geschnitten (5E &#39;, 5E&#39; &#39;, 5I&#39;, 5I zu erhalten gedreht &#39;&#39;) zu zeigen , wie die Muster von Spannung, Dehnung oder Druckänderung während des gesamten Modells. Es ist auch möglich, quantitative Daten aus dem Modell zu extrahieren (nicht gezeigt). Durch das Modell zu überprüfen und mit den genauesten Materialeigenschaften, Lasten und Netz Form der FE-Modell verwendet werden, um die bestmögliche Schätzung der mechanischen Umgebung zu erkunden, indem Zellen in diesem Fenster der Entwicklung erlebt. Die Ergebnisse des Modells kann direkt auf Veränderungen in Zellverhalten und die Genexpression 20 verglichen werden. <html> re 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54811 / 54811fig1.jpg &quot;/&gt; Abb . 1: Repräsentative Bilder der Muskel - Skelett - Elemente der Zebrabärbling Unterkiefer bei 5 dpf Repräsentative konfokalen Stapel des Unterkiefers von 5dpf Larven alle mit vorderen gezeigt nach oben (A) Immunostaining für A4.1025 die alle Skelett-Myosin Flecken (B) Immunostaining für Typ - II - Kollagen , das alle Knorpel (C) Stapel von einer Live - Larve markiert die transgenen Reporter COL2A1 ausdrücken: mCherry Knorpel Markierung (rot) und smyhc: GFP langsam Muskel (grün). IA: intermandibularis anterioren, PH: Winkelmesser hyoideus, AM: Adduktoren mandibulae, HALLO: hyoideus minderwertig, HALLO: hyoideus überlegen, CH: sternohyoideus, MC: Meckel-Knorpel, PQ: Palatoquadrate, CH:. Ceratohyal <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier eine größere Version zu sehen dieser Figur.</a> &quot;Fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig2.jpg" /> Abbildung 2: Erzeugung einer 3D - Oberfläche von konfokalen Daten Bilder den Übergang von der konfokalen Daten in eine 3D - Oberfläche für den Zebrabärbling Unterkiefer mit höherer Vergrößerung des Verbindungsbereichs zeigt.. (A) Rohdaten konfokalen; (B) Datensatz nach der Anwendung eines Gaußschen Filters; (C) Gefiltert Kontur; (D) 3D - Oberfläche. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig3.jpg" /> Abbildung 3: Repräsentative Maschen Zwänge und Kraftvektoren Repräsentative Maschen für eine 5 dpf Larve für (A) Mund Schließung zeigt und.(B) Mundöffnung. Weiße Punkte bezeichnen Stellen , wo das Modell beschränkt ist , und in dem Maße (beispielsweise x und y oder x, y und z). Weiße Linien bezeichnen Muskel Positionen, die mit dem Vektor der Muskelkraft durch weiße Pfeile gekennzeichnet. Rot zeigt Knorpel und Gelb die interzone. Diese Zahl wurde von ergänzendem Material modifiziert zuvor in Brunt veröffentlicht et al. 15. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig4.jpg" /> Abbildung 4:. Sensibilitätsprüfung FE-Modell Backenbewegung in 5dpf Zebrabärbling für verschiedene Knorpel und Interzonen Young-Module simulieren. Backenbewegung (offen in &amp; mgr; m geschlossen) auf der Backe markiert; mit der Farbtaste aufgezeichnet. Jedes Modell (A - L) eine unterschiedliche Kombination von Knorpel (c = 1,1, 3,1 bzw. 6,1 MPa) oder Interzonen (i = von 0,25, 0,5, 0,75 oder 1 MPa) Eigenschaften aufweisen . Horizontal schwarzer Pfeil hebt den Wert der Backenbewegung an der Spitze der Meckel-Knorpel (durch den vertikalen schwarzen Pfeil dargestellt). M und N Standbilder aus Videos von 5 dpf Larven zeigt Minimum, das heißt, Kiefer geschlossen (M) und Maximum, das heißt, Kiefer vollständig geöffnet (N) mit den beiden überlagerten (O) - weiße Linie auf O steht für die Verschiebung (von 43 &amp; mgr; m). In diesem Fall sind relativ Knorpel Eigenschaften von 1,1 mit einem Interzone von 0,25 (A) am besten entsprechen die Verschiebungen in lebenden Fischen gesehen (O). Panels AL dieser Figur wurden zuvor in Brunt et al. 15. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier um einen größeren vers anzuzeigen</a>Ion dieser Figur. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig5.jpg" /> Abbildung 5: Repräsentative Daten aus den FE - Modelle FE-Modell Simulation aller in einem 5 dpf Larve angewendet Muskeln (A - C).. (A) Von Mises (EMaxmin) (B) Mindesthauptdehnung (E Min. P, μɛ) (C) Maximaler Hauptdehnung (E Max. P., μɛ). FE-Modell-Simulation der maximalen und minimalen Hauptstämme bei Kieferöffnung. (D - K): Die maximale Hauptdehnung (. E Max P., μɛ) in (D) ventralen Kiefer Sicht und (E) ventralen Gelenkansicht (E) zeigt Lage von proximal-distalen Abschnitte durch den Knorpel Meckel Gelenk und das Interzonen in (E &#39;) und (E&#39; &#39;), respectively. (F): seitlichKiefer-Ansicht. (G): Lateralgelenk Ansicht. (H - K): minimale Hauptstamm (. E Min P, μɛ) in (H) ventralen Kiefer Sicht und (I) ventralen gemeinsamen Ansicht. (I) zeigt Lage der proximal-distalen Abschnitte durch den Knorpel Gelenk Meckel und interzone in (I &#39;) und (I&#39; &#39;) bzw. (J): seitliche Kieferansicht. (K): Lateralgelenk Ansicht. Diese Zahl wurde veröffentlicht früher al in Brunt et. 15. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Anzahl der Muskelfasern </td><td> Muskelfaserbereich (um 2) </td><td> Muskelgruppe Bereich (&amp; mgr; m2) </td><td> Force (N) </td></tr><tr><td> 5 dpf intermandibularis anterioren </td><td> 5 </td><td> 23.8 </td><td> 119 </td><td> 4.76e-6 </td></tr><tr><td> 5 dpf Winkelmesser hyoideus </td><td> 6 </td><td> 23.8 </td><td> 142,8 </td><td> 5.71e-6 </td></tr><tr><td> 5 dpf Adduktoren mandibulae </td><td> 9 </td><td> 23.8 </td><td> 214,2 </td><td> 8.57e-6 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Muskel - Quantifizierung. Durchschnittliche Muskelkräfte für die Intermandibularis Anterior, Adduktoren mandibulae und Protractor Hyoideus bei 5 dpf unter Verwendung von 40 nN / &amp; mgr; m 2 (Wert pro Flächeneinheit von Referenz 17 genommen) berechnet. (Lorga et al., 2011) (n = 3).

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Aufbau von Finite-Elemente-Modellen zur Untersuchung der Biomechanik des Zebrafischkiefers | Entwicklungsbiologie | Video

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

Finite Element Analysis is a frequently used tool to investigate the mechanical performance of structures under load. Here we apply its use to modeling the biomechanics of the zebrafish jaw.

Der Aufbau Finite-Elemente-Modelle zu Zebrabärbling Jaw Biomechanik Untersuchen

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

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9.0K Aufrufe.  University of Bristol. Finite Element Analysis is a frequently used tool to investigate the mechanical performance of structures under load. Here we apply its use to modeling the biomechanics of the zebrafish jaw. 

Serie: Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the large size of their cells in early embryos, make Xenopus laevis a useful model for visualising GFP-tagged ligands. Synthetic mRNAs are efficiently translated after injection into early stage Xenopus embryos, and injections can be targeted to a single cell. When combined with a lineage tracer such as membrane tethered RFP, the injected cell (and its descendants) that are producing the overexpressed protein can easily be followed. This protocol describes a method for the production of fluorescently tagged Wnt and Shh ligands from injected mRNA. The methods involve the micro dissection of ectodermal explants (animal caps) and the analysis of ligand diffusion in multiple samples. By using confocal imaging, information about ligand secretion and diffusion over a field of cells can be obtained. Statistical analyses of confocal images provide quantitative data on the shape of ligand gradients. These methods may be useful to researchers who want to test the effects of factors that may regulate the shape of morphogen gradients.

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

The manuscript here provides a simple set of methods for analysing the secretion and diffusion of fluorescently tagged ligands in Xenopus. This provides a context for testing the ability of other proteins to modify ligand distribution and allowing experiments that may give insight into mechanisms regulating morphogen gradients.

Mittels konfokaler Analyse<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Um Modulatoren der Wnt und Shh Morphogen Gradienten Untersuchen

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

The goal of this protocol is to describe a loss- and gain-of function method that is applicable to identify neogenin as a stage-specific receptor that leads to trophectoderm and inner cell mass differentiation in preimplantation mouse embryos.

Verlust- und Gewinn-of-function-Ansatz Frühe Zellschicksal Bestimmungsfaktoren in Preimplantation Maus Embryonen zur Untersuchung

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema and diminished visual acuity. However, human CECs are prone to compromised proliferative potential. Furthermore, stimulation of cell growth is often complicated by gradual endothelial-mesenchymal transition (EnMT). Therefore, understanding the mechanism of EnMT is necessary for facilitating the regeneration of CECs with competent function. In this study, we prepared a primary culture of bovine CECs by peeling the CECs with Descemet's membrane from the corneal button and demonstrated that bovine CECs exhibited the EnMT process, including phenotypic change, nuclear translocation of &#946;-catenin, and EMT regulators snail and slug, in the in vitro culture. Furthermore, we used a rat corneal endothelium cryoinjury model to demonstrate the EnMT process in vivo. Collectively, the in vitro primary culture of bovine CECs and in vivo rat corneal endothelium cryoinjury models offers useful platforms for investigating the mechanism of EnMT.

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

A primary culture of bovine corneal endothelial cells was used to investigate the mechanism of corneal endothelial-mesenchymal transition. Furthermore, a rat corneal endothelium cryoinjury model was used to demonstrate corneal endothelial-mesenchymal transition in vivo.

In vitro und in vivo Modelle Corneal Endothelial-mesenchymale Transition zu studieren

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema ...

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard microscopy techniques, due to the scattering of imaging light by the thick heart tissue, as these vessels are localized deep within the walls of the developing heart. As optical clearing of tissues using organic solvents such as BABB (1 part benzyl alcohol to 2 parts benzyl benzoate) has been shown to greatly improve the optical penetration depth that can be achieved, we combined clearance of whole, PECAM1-immunostained hearts, with laser-scanning confocal microscopy, in order to obtain high-resolution images of vessels throughout the entire heart. BABB clearance of embryonic hearts takes place rapidly and also acts to preserve the fluorescent signal for several weeks; in addition, samples can be imaged multiple times without loss of signal. This straightforward method is also applicable to imaging other types of blood vessels in whole embryos.

We present a protocol for the analysis of coronary vessels in whole embryonic murine hearts up to E15.5, using standard immunological staining methods followed by optical clearance and confocal microscopy. This technique enables visualization of blood vessels throughout the entire heart without the need for time-consuming analysis of serial sections.

Die Analyse der Herzkranzgefäße in Gelöscht Embryonale Herz

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Acute and Chronic Models of Hyperglycemia in Zebrafish: A Method to Assess the Impact of Hyperglycemia on Neurogenesis and the Biodistribution of Radiolabeled Molecules

Hyperglycemia is a major health issue that leads to cardiovascular and cerebral dysfunction. For instance, it is associated with increased neurological problems after stroke and is shown to impair neurogenic processes. Interestingly, the adult zebrafish has recently emerged as a relevant and useful model to mimic hyperglycemia/diabetes and to investigate constitutive and regenerative neurogenesis. This work provides methods to develop zebrafish models of hyperglycemia to explore the impact of hyperglycemia on brain cell proliferation under homeostatic and brain repair conditions. Acute hyperglycemia is established using the intraperitoneal injection of D-glucose (2.5 g/kg bodyweight) into adult zebrafish. Chronic hyperglycemia is induced by immersing adult zebrafish in D-glucose (111 mM) containing water for 14 days. Blood-glucose-level measurements are described for these different approaches. Methods to investigate the impact of hyperglycemia on constitutive and regenerative neurogenesis, by describing the mechanical injury of the telencephalon, dissecting the brain, paraffin embedding and sectioning with a microtome, and performing immunohistochemistry procedures, are demonstrated. Finally, the method of using zebrafish as a relevant model for studying the biodistribution of radiolabeled molecules (here,[18F]-FDG) using PET/CT is also described.

This work describes methods to establish acute and chronic hyperglycemia models in zebrafish. The aim is to investigate the impact of hyperglycemia on physiological processes, such as constitutive and injury-induced neurogenesis. The work also highlights the use of zebrafish to follow radiolabeled molecules (here, [18F]-FDG) using PET/CT.

Akute und chronische Modelle der Hyperglykämie in Zebrafisch: Eine Methode zur Beurteilung der Auswirkungen von Hyperglykämie auf die Neurogenese und die Biodistribution von radioaktiv markierten Molekülen

Hyperglycemia is a major health issue that leads to cardiovascular and cerebral dysfunction. For instance, it is associated with increased neurological ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding and invasion. Current animal models for the study of T. cruzi allow limited observation of parasites in vivo, representing a challenge for understanding parasite behavior during the initial stages of infection in humans. This protozoan has a flagellar stage in both vector and mammalian hosts, but there are no studies describing its motility in vivo.The objective of this project was to establish a live vertebrate zebrafish model to evaluate T. cruzi motility in the vascular system. Transparent zebrafish larvae were injected with fluorescently labeled trypomastigotes and observed using light sheet fluorescence microscopy (LSFM), a noninvasive method to visualize live organisms with high optical resolution. The parasites could be visualized for extended periods of time due to this technique&#39;s relatively low risk of photodamage compared to confocal or epifluorescence microscopy. T. cruzi parasites were observed traveling in the circulatory system of live zebrafish in different-sized blood vessels and the yolk. They could also be seen attached to the yolk sac wall and to the atrioventricular valve despite the strong forces associated with heart contractions. LSFM of T. cruzi-inoculated zebrafish larvae is a valuable method that can be used to visualize circulating parasites and evaluate their tropism, migration patterns, and motility in the dynamic environment of the cardiovascular system of a live animal.

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

In this protocol, fluorescently labeled T. cruzi&#160;were injected into transparent zebrafish larvae, and parasite motility was observed in vivo using light sheet fluorescence microscopy.

Gründung der Larven Zebrafisch als Tier-Modell zu untersuchen Trypanosomen Trypanosoma Motilität In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows within roughly two weeks after injury. Furthermore, zebrafish are able to heal bone rapidly after trepanation of the skull, and repair fractures that can be easily introduced into zebrafish bony fin rays. These injury assays represent feasible experimental paradigms to test the effect of administered drugs on rapidly forming bone. Here, we describe the use of these 3 injury models and their combined use with systemic glucocorticoid treatment, which exerts bone inhibitory and immunosuppressive effects. We provide a workflow on how to prepare for immunosuppressive treatment in adult zebrafish, illustrate how to perform fin amputation, trepanation of calvarial bones, and fin fractures, and describe how the use of glucocorticoids affects both bone forming osteoblasts and cells of the monocyte/macrophage lineage as part of innate immunity in bone tissue.

Here, we describe 3 adult zebrafish injury models and their combined use with immunosuppressive drug treatment. We provide guidance on imaging of regenerating tissues and on detecting bone mineralization therein.

Erwachsenen Zebrafisch Verletzungen Modelle zur Untersuchung der Auswirkungen von Prednisolon bei der Regeneration von Knochengewebe

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...

Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic regeneration, which involves blastema formation and intramembranous ossification analyzed by fluorescence immunohistochemistry and sequential in-vivo microcomputed tomography (&#956;CT). Mammalian regeneration is restricted to amputations transecting the distal region of the terminal phalanx (P3); digits amputated at more proximal levels fail to regenerate and undergo fibrotic healing and scar formation. The regeneration response is mediated by the formation of a proliferative blastema, followed by bone regeneration via intramembranous ossification to restore the amputated skeletal length. P3 amputation is a preclinical model to investigate epimorphic regeneration in mammals, and is a powerful tool for the design of therapeutic strategies to replace fibrotic healing with a successful regenerative response. Our protocol uses fluorescence immunohistochemistry to 1) identify early-and-late blastema cell populations, 2) study revascularization in the context of regeneration, and 3) investigate intramembranous ossification without the need for complex bone stabilization devices. We also demonstrate the use of sequential in vivo &#956;CT to create high resolution images to examine morphological changes after amputation, as well as quantify volume and length changes in the same digit over the course of regeneration. We believe this protocol offers tremendous utility to investigate both epimorphic and tissue regenerative responses in mammals.

Here, we present a protocol of adult mouse terminal phalanx amputation to investigate mammalian blastema formation and intramembranous ossification, analyzed by fluorescent immunohistochemistry and sequential in-vivo microcomputed tomography.

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in zebrafish during different developmental stages. To investigate the role of endoglin(eng) in vessel formation during the development of hereditary hemorrhagic telangiectasia&#160;(HHT), morpholino-mediated targeted knockdown of eng in zebrafish are used to study its temporal expression and associated functions. Here, whole-mount in situ RNA hybridization (WISH) is employed for the analysis of eng and its downstream genes in zebrafish embryos. Also, tube formation assays are performed in HHT patient-derived induced pluripotent stem cell-differentiated&#160;endothelial cells (iPSC-ECs; with eng mutations). A specific signal amplifying system using the whole amount In Situ Hybridization &#8211; WISH provides higher resolution and lower background results compared to traditional methods. To obtain a better signal, the post-fixation time is adjusted to 30 min after probe hybridization. Because fluorescence staining is not sensitive in zebrafish embryos, it is replaced with diaminobezidine (DAB) staining here. In this protocol, HHT&#160;patient-derived iPSC lines containing an eng mutation are differentiated into endothelial cells. After coating a plate with basement membrane matrix for 30 min at 37 &#176;C, iPSC-ECs are seeded as a monolayer into wells and kept at 37 &#176;C for 3 h. Then, the tube length and number of branches are calculated using microscopic images. Thus, with this improved WISH protocol, it is shown that reduced eng expression affects endothelial progenitor formation in zebrafish embryos. This is further confirmed by tube formation assays using iPSC-ECs derived from a patient with HHT. These assays confirm the role for eng in early vascular development.

Presented here is a protocol for whole-mount in situ RNA hybridization analysis in zebrafish and tube formation assay in patient-derived induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells to study the role of endoglin in vascular formation.

Ganz-Mount-In-Situ-Hybridisierung in Zebrafisch-Embryonen und Tube-Formations-Assay in iPSC-ECs zur Untersuchung der Rolle von Endoglin in der Gefäßentwicklung

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome affinity purification (TRAP) method and consecutive optimized low-input library preparation.
As starting material, we employ plant lines that express GFP-tagged ribosomal protein RPL18 in a cell type-specific manner by use of adequate promoters. Prior to immunopurification and RNA extraction, the tissue is snap frozen, which preserves tissue integrity and simultaneously allows execution of time series studies with high temporal resolution. Notably, cell wall structures remain intact, which is a major drawback in alternative procedures such as fluorescence-activated cell sorting-based approaches that rely on tissue protoplasting to isolate distinct cell populations. Additionally, no tissue fixation is necessary as in laser capture microdissection-based techniques, which allows high-quality RNA to be obtained.
However, sampling from subpopulations of cells and only isolating polysome-associated RNA severely limits RNA yields. It is, therefore, necessary to apply sufficiently sensitive library preparation methods for successful data acquisition by RNA-seq.
TRAP offers an ideal tool for plant research as many developmental processes involve cell wall-related and mechanical signaling pathways. The use of promoters to target specific cell populations is bridging the gap between organ and single-cell level that in turn suffer from little resolution or very high costs. Here, we apply TRAP to study cell-cell communication in lateral root formation.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Translating ribosome affinity purification (TRAP) offers the possibility to dissect developmental programs with minimal processing of organs and tissues. The protocol yields high-quality RNA from cells targeted with a green fluorescent protein (GFP)-labeled ribosomal subunit. Downstream analysis tools, such as qRT-PCR or RNA-seq, reveal tissue and cell type-specific expression profiles.

Übersetzen von Ribosome Affinity Purification (TRAP) zur Untersuchung der Arabidopsis thaliana Wurzelentwicklung in einer zelltypspezifischen Skala

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...