Die Autoren möchten die Unterstützung der Universiti Putra Malaysia bestätigen.

Hinweis: Die chemischen und biochemische Reagenzien verwendet werden sollte der analysenrein und ohne weitere Reinigung verwendet. Bereiten Sie alle Lösungen mit sterilen deionisiertes Wasser. Autoklav alle Gläser vor der Sterilisation.
Achtung: Bitte verwenden alle geeigneten Sicherheitsmaßnahmen beim Labortätigkeiten, einschließlich des Einsatzes von technischen Kontrollen (Abzugshaube, Handschuhfach) durchführen und persönliche Schutzausrüstung (Schutzbrille, Handschuhe, Kittel, voller Länge Hose, geschlossene (Schuhe).
1. Herstellung und Charakterisierung von geändert Elektrode mit PLA-AuNPs
<ol><li>
Herstellung und Charakterisierung von PLA-AuNPs
	<ol>
<li>Schnell 100 mL kochendem wässrigen Chloroauric Säure (1 mM) 10 mL Natriumcitrat-Lösung (38,8 mM) hinzu und auf Raumtemperatur abkühlen. Beachten Sie die Änderungen in der Farbe in die vorbereiteten AuNPs-Lösung, die als gelb, schwärzlich Änderungen beginnt und endet schliesslich als Dunkles Rubinrot.</li>
		<li>Die PLA-Pellets in einem Edelstahl-Werkzeug für den Schmelzprozess legen und Heizen sie bei einer Temperatur von 190 ° C für 10 min. folgen mit den Pressvorgang: setzen Sie sie unter einem Druck von 2,2 MPa für 1 min als Teil der PLA-Blatt-Vorbereitung. Das PLA-Blatt wird nach dem Abkühlen für ca. 3 h einsatzbereit sein.</li>
		<li>Lösen Sie kräftig rühren auf, 0,68 mg der PLA Blätter in 5 mL Chloroform bei Raumtemperatur. Mischen Sie die gelöste PLA mit 10 mL der vorbereiteten AuNPs Lösung und homogen rühren bei Raumtemperatur. Die homogene Mischungen können dann als PLA-AuNPs bezeichnet und mit UV-Vis, XRD, TEM und FESEM mit EDX charakterisiert.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Herstellung und Charakterisierung von modifizierten Siebdruck kohlenstoffelektrode Hinweis: Die Erholungsfläche in dieser Studie verwendeten besteht aus einem drei-Elektroden-System: eine Gegenelektrode eine kohlenstoffelektrode arbeiten und eine Ag/AgCl-Referenzelektrode.<ol>
<li>Schnell Pipette 25 µL der homogenen Lösung von PLA-AuNPs auf die Erholungsfläche und dann Luft trocknen es für 24 Stunden vor der Verwendung.</li>
		<li>Elektrochemisch charakterisieren die modifizierte Elektroden Erholungsfläche/PLA-AuNPs, in Ferro Zyankali (K3[Fe(CN)6]3-/4 -) zur Messung der aktiven Fläche, elektrochemische Impedanz Spektroskopie, Wiederholbarkeit, Reproduzierbarkeit und Stabilität30.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Entwicklung der elektrochemische DNA-Biosensor
<ol><li>
Vorbereitung der Sonde Hinweis: Die Sequenzen von SsDNA Sonde und komplementären DNA wurden basierend auf den Informationen vom National Center for Biotechnology Information (NCBI) Datenbank ausgewählt.<ol>
<li>Kaufen Sie synthetische Oligonukleotide (20-Mer SsDNA Sonde, 20-Mer komplementären DNA-20-Mer nicht übereinstimmende DNA und 21-Mer-komplementären DNA) als lyophilisierte Pulver aus kommerziellen Laboren, basierend auf die folgenden Sequenzen: Thiolated SsDNA Sonde: 5′ - / 5ThioMC6-D/CGGATTATGCAGAAGCACTG - 3 ' komplementäre DNA: 5′ - CAGTGCTTCTGCATAATCCG - 3 ' One-Base nicht übereinstimmende DNA: 3 ' 5 ' - CAGTGCTTCTGC ṪTAATCCG - drei-Base nicht übereinstimmende DNA: 3 ' 5 ' - CAGTGCTTCT Ċ ṪṪTAATCCG - nicht-komplementären DNA: 5′ - CGCACAAGGCTCGACGGCTGA - 3 '</li>
		<li>Bereiten Sie Stammlösungen alle Oligonukleotide (100 µM) mit einer sterilen TE-Lösung (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5), in Portionen aufgeteilt. Beachten Sie dies bei-4 ° C und dann machen Sie die entsprechenden Verdünnungen nur vor dem Gebrauch.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Optimierung der Immobilisierung und Hybridisierung Hinweis: Eine Erholungsfläche modifiziert mit PLA-AuNPs, bezeichnet als Erholungsfläche/PLA-AuNPs, wurde für diese Studie verwendet und ein Drop-Gießverfahren diente für die DNA Immobilisierung und Hybridisierung.<ol>
<li>Erstens immobilisieren 25 µL Thiolated SsDNA Sonde auf der AuNPs/PLA-tauglich und Luft trocknen Sie es dann für 24 h bei Raumtemperatur, danach wird es schließlich als Erholungsfläche/PLA-AuNPs/SsDNA bezeichnet werden. Optimierung der Immobilisierung Bedingung mithilfe von drei Faktoren bestimmt: die Konzentration von SsDNA (von 0,2 bis 1,4 µM), Zeit (von 30 bis 210 min.) und Temperatur (von 25 bis 75 ° C).</li>
		<li>Pipette 25 µL der komplementären DNA auf die Oberfläche der Erholungsfläche/PLA-AuNPs/SsDNA zur Durchführung der Hybridisierung Veranstaltung, wonach es schließlich als Erholungsfläche/PLA-AuNPs/DsDNA bezeichnet werden kann. Optimierung der Hybridisierung Bedingung über die beiden Faktoren der Zeit (von 5 bis 30 min) und Temperatur (von 25 bis 75 ° C) zu bestimmen.</li>
		<li>Tauchen die immobilisierte und hybridisierte Elektroden in 20 µM MB für 30 min. unspezifisch adsorbierten DNA und überschüssige MB durch Waschen mit 0,5 M ABS/20 mM NaCl (pH 4,5) und dann Spülen mit entionisiertem Wasser. Maß der Spitzenstrom für MB-Reduzierung mit DPV-Technik. Die DPV-Messung mit 0,1 M PBS (pH 7) ausführen, enthält kein Indikator.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Charakterisierung von vorgefertigten DNA-biosensor
	<ol>
<li>Tauchen die Erholungsfläche/PLA-AuNPs in 20 µM MB für 30 min, mit 0,5 M ABS/20 mM NaCl (pH 4,5) waschen und Spülen mit entionisiertem Wasser vor der Messung. Ein ähnliches Verfahren für alle Interaktionen mit der DNA-Sonde, komplementäre DNA nicht übereinstimmende DNA und nicht-komplementären DNA-Proben zu folgen.</li>
		<li>Die elektrochemische Reduktion zu messen. Hinweis: Wir haben DPV Schnittstellensoftware kommerziell hergestellten Autolab mit gemessen. Die DPV-Messungen der MB elektrochemische Reduktion durchgeführt auf einem Potential von -0,5 V bis 0,25 V, mit einem möglichen Schritt von 0,005 V, Amplitude Modulation von 0,05 V und einer Abtastrate von 7,73 mVs-1 mit 0,1 M-PBS-Puffer (pH 7), enthält kein Indikator. Die Selektivität, Empfindlichkeit, Reproduzierbarkeit und Hitzestabilität von vorgefertigten DNA-Biosensor waren weiter untersucht. Berichteten Ergebnisse präsentierten sich als mittlere Wert Messungen in drei Wiederholungen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(3) Validierung der vorgefertigten DNA-Biosensor mit realen Proben
<ol><li>Vorbereitung von Bakterienstämmen
	<ol>
<li>Wählen Sie bakterielle Proben anhand ihrer erheblichen Verschmutzung der Meeresfrüchte31,32 . Hinweis: V. Parahaemolyticus Referenzstämme sowie 8 andere Bakterienstämme (Campylobacter Jejuni, Listeria Monocytogenes, Salmonella Typhimurium, Salmonellen Enteritis, Klebsiella Pneumonie, Escherichia coli O157: H7, Bacillus Cereusund Vibrio Alginolyticus) der gemeinsame lebensmittelbedingten Erreger waren für die elektrochemische DNA-Biosensor-Validierung in dieser Studie beschäftigt.</li>
		<li>Führen Sie eine Routine Subkultur von Bakterienstämmen auf ihre jeweiligen Agar alle zwei Wochen ihre Lebensfähigkeit zu erhalten, siehe Tabelle 1 für Kulturbedingungen.</li>
		<li>Pflegen Sie Langzeitarchivierung der Bakterienstämme in ihren jeweiligen wachsenden Brühen mit 20 % (V/V) Glycerin bei-80 ° C wie Glycerin schützt Bakterien verhindert die Bildung von Eiskristallen, die sie während des gefriervorgangs beschädigen können. Als nächstes impfen Sie eine Schleife der erhaltenen Bakterielle Zellkultur in Glycerin Aktien in der jeweiligen Brühen. Inkubieren Sie Brühen entsprechend ihrer jeweiligen Wachstumszeit und Temperatur, wenn benötigen, um die Bakterien wieder zu beleben.</li>
		<li>Bestimmen Sie die Menge von V. Parahaemolyticus Zellen unter Verwendung einer Ausbreitung Platte Technik33, ein Standard und eine bekannte Methode zum Auflisten von Mikroorganismen, die aus einer Reihe von Verdünnungen abgeleitet.<ol>
<li>Kultur V. Parahaemolyticus in Trypticase-Soja-Bouillon (TSB + 3 % NaCl) bei 37 ° C in einem 140 u/min schütteln Zustand. Übertragen Sie dann 1 mL Bakterienkultur Zelle in 9 mL TSB + 3 % NaCl, ein Verdünnungsfaktor 10-1 zu erhalten.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Wiederholen Sie diesen Schritt neun Mal, um eine vollständige Reihe von bis zu 10-10 Verdünnungsfaktor zu bekommen. Als nächstes 0,1 mL jedes Verdünnungsfaktor (ab 10-1 bis 10-10) auf ein Vibrio selektive nährbodenplatte Kolonie zählen, bzw. verteilt. Inkubieren Sie die Platten bei 37 ° C für 24 h inkubiert.</li>
		<li>Verwenden Sie einen Kolonie Zähler zählen einzelne Kolonien und dann zurück-rechnen (Anzahl der KBE/pipettiert Betrag x Verdünnungsfaktor) um eine koloniebildenden Einheiten pro Milliliter Dichte (KBE mL-1) zu erhalten. Leiten Sie die Konzentration der koloniebildenden Einheiten (KBE) in der Bakterien-Zellsuspensionen vom Kalibrierung Grundstück KBE mL-1 gegen Extinktion ab.</li>
	</ol></li>
	<li>Vorbereitung des PCR-Assays
	<ol>
<li>Extrahieren Sie genomischen DNA nach einem modifizierten Lyse Verfahren34gekocht. Erste, Streifen, eine einzelne bakterielle Belastung auf Agar-Medien und in Brühe Medien, gefolgt von Bebrüten es seine relative Wachstum Zustand, ein 140 u/min schütteln Zustand zu impfen.</li>
		<li>Pipette eine 1 mL-Kultur der Brühe in eine Mikro Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie dies bei 4830 x g und 4 ° C für 1 min um Pellets zu erhalten. Verwenden Sie ca. 500 µL steriler TE-Puffer für Resuspension mit Pellets. Halten Sie die entstandene Suspension für 10 min bei 98 ± 2 ° C in einem Heizblock und chill es sofort bei-18 ° C für 10 min zur lyse der Zellen und die DNA freigeben.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die genomische DNA bei 4830 x g und 4 ° C für 3 min zu erhalten eine klare Suspension und halten den Überstand bei-20 ° C für die weitere Verwendung. Verwenden Sie eine Biophotometer-Messung mit UV-Absorption bei einer Wellenlänge von 260 nm (als Nukleinsäuren absorbierenden Wellenlänge des Lichts) und auch bei einer Wellenlänge von 280 nm (als die Proteine absorbierenden Wellenlänge des Lichts) zu bestimmen, die Konzentration und Reinheit der entnommenen genomische DNA und identifizieren Sie dann alle Stämme mit standard biochemischen Assays35 und von 16 s rRNA-Gen-Sequenzierung36zu überprüfen. Zu guter Letzt Denaturieren Sie die genomische DNA bei 92 ° C für 2 min und im Eiswasser vor Anwendung der Biosensor kühlen Sie schnell.</li>
		<li>Weiter bestätigen das Vorhandensein V. Parahaemolyticus mittels PCR ToxR gen Ziel. Führen Sie diese Schritte in einem Thermocycler mit einer Grundierung (5'-GTCTTCTGACGCAATCGTTG-3' und 5'-ATACGAGTGGTTGCTGTCATG-3"). Optimieren Sie die PCR Verstärkung in eine gesamte Reaktionsvolumen von 25 µL bestehend aus sterilem Wasser (15,5 µL), Puffer (5 µL), Grundierung (1 µL, 10 µM), dNTP-Mix (1 µL), DNA-Vorlage (2 µL) und Taq-DNA-Polymerase (0,2 µL, 10 X).</li>
		<li>Vermischen Sie die Komponenten gut und ordnen Sie die PCR Verstärkung der Zielsequenz in einem Thermocycler programmiert für 30 Zyklen der Verstärkung. In unserer Studie jedem Zyklus bestand aus drei Schritten Reaktionen dh., erste Denaturierung (94 ° C, 3 min), gefolgt von 30 Zyklen der Denaturierung (94 ° C, 1 min), Glühen (63 ° C, 1,5 min) und Verlängerung (72 ° C, 1,5 min), gefolgt von letzte Verlängerung (72 ° C, 7 min).</li>
		<li>Bestimmen Sie die amplifizierten Produkte und deren Größen per Elektrophorese auf 1,5 % Agarosegel. Erfassen Sie die Gelbilder mit ein kommerziell hergestelltes Gel-Dokumentations-System.</li>
	</ol></li>
	<li>Vorbereitung der Herzmuschel-Proben
	<ol>
<li>Erhalten Sie frische Proben. Hinweis: Unsere frische Herzmuscheln (Anadara Granosa) wurden von der nassen Markt in Serdang Selangor, gewonnen und schnell an das Labor in einem Kühler Eisbox zur Analyse gebracht. Teilen Sie die Proben in 2 Gruppen, nämlich die behandelten und unbehandelten Gruppe davon aus, dass ums gleichmäßig aus den Beginn der Ernte geerntet wurden, bis ins Kühlhaus ablegen.</li>
		<li>Behandeln Sie Herzmuscheln in der behandelten Gruppe durch eine Aufbewahrung bei-20 ° C für 24 h, gefolgt durch die Einwirkung von UV-Licht bei 20 ° C für 4 h vor der DNA-Extraktion vor. Hinweis: Die Gefriertemperatur und UV-Exposition verwendet für die kontrollierte Gruppe tötet oder zumindest die natürlich anfallende V. Parahaemolyticus in ums beschränkt. Gelten Sie eine höhere Pasteurisierung Regime von 70 ° C nicht, wie der kontrollierten Zustand in dieser Studie die tatsächliche Situation der frische Herzmuscheln zu imitieren soll. Unterdessen analysieren Sie Proben direkt aus der unbehandelten Gruppe ohne jede Vorbehandlung, sobald sie im Labor ankommen.</li>
		<li>Subkultur einen Stamm von V. Parahaemolyticus ATCC 17802 TSB (3 % NaCl). Bestimmen Sie die entwicklungsfähigen Zellen in das Inokulum über Beschichtung von entsprechenden Verdünnungen der TSB (3 % NaCl) auf CA um ein Inokulum von 104 KBE mL-1 V. Parahaemolyticuszu erhalten. Waschen Sie jede Schale in destilliertem Wasser und Schrubben sie frei von Schmutz vor mit sterilen Pinzette in eine laminare Strömung Kabinett, um das Gewebe aus der Schale zu entfernen.</li>
		<li>Homogenisieren ca. 10 g Herzmuscheln Gewebeproben mit einem Homogenisator in 90 mL sterile TSB (3 % NaCl) für 60 s. hinzufügen eine bekannte Menge von V. Parahaemolyticus bis 9 mL der homogenisierten Probe Brühe für die Spikes Proben. Verwenden Sie die unspiked Beispiele als Negativkontrolle. Schätzen die Zellzahlen von V. Parahaemolyticus versetzt auf die Herzmuschel-Proben durch Ausplattieren 0,1 mL der Proben auf CA, und probieren Sie anschließend pipettieren 1 mL der Proben zu einem Microcentrifuge Schlauch für DNA Extraktion in der Biosensor und PCR-Assay verwendet werden.</li>
		<li>Extrahieren Sie die genomische DNA von der V. Parahaemolyticus der Spikes und unspiked Proben nach einem modifizierten gekocht Lyse Verfahren36. Schließlich bestimmen die DNA-Konzentration und Reinheit mit einer Bio-Photometer-Messung mit UV-Absorption bei einer Wellenlänge von 260 nm (als Nukleinsäuren absorbierenden Wellenlänge des Lichts) und auch bei einer Wellenlänge von 280 nm (als die Proteine, die Wellenlänge des Lichts absorbieren).</li>
	</ol></li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die entscheidenden Schritte in einen Rahmen für die erfolgreiche Entwicklung dieser Art von elektrochemische Biosensor sind Auswahl der geeigneten biologischen erkennungselemente für den Wandler (Nukleinsäure oder DNA hier); chemischen Ansatz für den Bau der Fernerkundungen Schicht des Wandlers; Transduktion Material; Optimierung der DNA Immobilisierung und Hybridisierung; und Validierung der entwickelten Biosensor mit realen Proben.
Für die erfolgreiche Entwicklung der empfindliche und s...

Ein wichtiges Thema der öffentlichen und wissenschaftlichen Diskussion in den letzten Jahren, Lebensmittelvergiftung wird hauptsächlich mit 3 Agenten: Mikroorganismen1, Chemikalien2und Parasiten3. Kontaminierter Lebensmittel kann dazu führen, dass schwerwiegende gesundheitliche Folgen beim Menschen, vor allem in höheren Risikogruppe der Personen mit geschwächtem Immunsystem, ältere Menschen, Schwangere, Säuglinge und Kleinkinder4. Mit mehr als 1 Million Fälle von akuter Durchfall bei Kindern unter 5 Jahren in Afrika, Asien und Lateinamerika jährlich auftretenden Lebensmittelvergiftungen ist eine wichtige globale Krankheit5,6 und der World Health Organization gegründet Mikroorganismen als wichtigsten Faktor7. Vibrio Parahaemolyticus zeichnet sich unter den bekanntesten virulente Stämme. In der Regel in Küsten-, Flussmündungen und marine8gefunden, ist es ein gramnegatives Bakterium, wird im hohen Salz Umgebungen aktiv, und verursacht schwere menschliche Gastroenteritis beim Verzehr in ungenügend gekocht, fehlgeleitetes oder roh marine Produkte-9. Darüber hinaus machen Vorerkrankungen bei manchen Menschen sie anfällig für Infektionen, Septikämie oder Ohr-Infektion aus V. Parahaemolyticus10gewickelt. Die Virulenzfaktoren von V. Parahaemolyticus hämolysinen gliedern sich in zwei Arten, die an der Pathogenese der Erkrankung beitragen: thermostabile direkten hlya (TDH) von Tdh Gene codiert und TDH-bezogene hlya von Trh Gene11codiert. Die Virulenz-Marker (Tdh und Trh Gene) von V. Parahaemolyticus befinden sich meist in klinischen Proben nicht in Umweltproben.
V. Parahaemolyticus besitzt die Fähigkeit, unter den unterschiedlichsten Bedingungen überleben, reagiert schnell auf Veränderungen der Umwelt12. Seine Verbreitung Mechanismus eskaliert sein Gefahrenpotenzial, als seine Giftigkeit parallel zu Zelle Masse13erhöht. Noch schlimmer ist, stellt Klimawandel diese Bakterien mit reichlich Bedingungen ihre Zelle Bevölkerung Wachstum14zu beschleunigen. Aufgrund seiner hohen Frequenz muss V. Parahaemolyticus überwacht werden entlang der Food Supply Chain, insbesondere beim Handel und Produktion von Meeresfrüchten, da diese Produkte sind wo sie sich befinden, in enormen Mengen15,16 überall auf der Welt. Derzeit werden die Bakterien identifiziert und isoliert mit einer Reihe von Methoden, einschließlich biochemischen Tests, Bereicherung und selektivmedien17, Enzym-linked Immunomagnetic sorbent assay (ELISA)18, Puls-Bereich Gelelektrophorese (PFGE) 19, Latex Agglutination Prüfungen und Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Tests20. Diese Methoden erfordern in der Regel qualifiziertes Personal, ausgefeilte Instrumente und aufwendige Techniken, die Informationen über Verunreinigung nicht sofort angeben. Dies schränkt die Wahrscheinlichkeit schädlichen Verunreinigungen und vor-Ort-Anwendungen sofort zu erkennen. Schnellnachweis Werkzeuge bleiben eine hervorragende Herausforderung.
Biosensoren zeichnet sich als eine vielversprechende Option für den Nachweis von lebensmittelbedingten Krankheitserregern, denn es eine zeitsparende, kostengünstige, praktische und Echtzeit-Analyse-Methode21,22,23,24 bietet . Zwar gab es viele positive Ergebnisse der Analyten Erkennung dotierten Proben und Standardlösung mit Biosensoren, bleibt es jedoch ein Mangel an Forschung auf realen Proben in wässrigen Gemischen oder Bio-Extrakte25angewendet. Vor kurzem erhielten elektrochemische Biosensoren mit direkte und/oder indirekte Desoxyribonukleinsäure (DNA) Erkennung erhöhte Aufmerksamkeit unter den Wissenschaftlern, aufgrund ihrer spezifischen Nachweis der komplementären Ziel über eine Hybridisierung Event26 , 27 , 28 , 29. diese einzigartige Ansätze sind stabiler im Vergleich zu den Enzym-basierte Biosensoren, bietet somit eine viel versprechende Technologie für Miniaturisierung und Vermarktung. Das Ziel der Studie berichtet, soll hier ein schnelles Werkzeug zu konstruieren, die V. Parahaemolyticus mit hoher Selektivität, Sensibilität und Praktikabilität, basierend auf der DNA-Sequenz Spezifität bei Hybridisierung erkennen kann. Identifikation-Strategien beinhalten die Kombination aus Polymilchsäure Säure stabilisiert gold-Nanopartikeln (PLA-AuNPs)30 und Siebdruck Kohleelektroden (SPCEs) in Anwesenheit der Hybridisierung Indikator, Methylenblau (MB). Das Potenzial des Konstrukts entwickelten Erkennung ist weiter untersucht mit Bakterien DNA lysate und frische Herzmuscheln Proben.

<table><tbody><tr><td>Acetic acid</td><td>Merck</td><td>100056</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Merck</td><td>102445</td><td></td></tr><tr><td>Diaminoethane tetraacetic acid</td><td>Promega</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Dibasic sodium phosphate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Disodium hydrogen phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>255793</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16368</td><td></td></tr><tr><td>Gold (III) chloride trihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>520918</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Merck</td><td>100317</td><td></td></tr><tr><td>Methylene blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M44907</td><td></td></tr><tr><td>Monobasic sodium phosphate, monohydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3522</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5119</td><td></td></tr><tr><td>Poly(lactic acid) resin, commercial grade 4042D</td><td>NatureWorks</td><td>4042D</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>R&amp;amp;M Chemicals</td><td>59435</td><td></td></tr><tr><td>Potassium dihydrogen phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hexacyanoferrate III</td><td>R&amp;amp;M Chemicals</td><td>208019</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate anhydrous salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Trisodium citrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl) aminomethane</td><td>Fisher Scientific</td><td>T395-100</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>2X PCR Master Mix with Dual-Dye</td><td>Norgen Biotek</td><td>28240</td><td></td></tr><tr><td>Agarose gel</td><td>Merck</td><td>101236</td><td></td></tr><tr><td>Bolton Agar</td><td>Merck</td><td>100079</td><td></td></tr><tr><td>Bolton Broth</td><td>Merck</td><td>100079</td><td></td></tr><tr><td>CHROMagar Vibrio</td><td>CHROMagar</td><td>VB910</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Promega</td><td>U1511</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0581</td><td></td></tr><tr><td>Eosin methylene blue agar&amp;nbsp;</td><td>Merck</td><td>101347</td><td></td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Biotium</td><td>41001</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Merck</td><td>104092</td><td></td></tr><tr><td>Go Taq Buffer</td><td>Promega</td><td>M7911</td><td></td></tr><tr><td>Loading dye 100 bp DNA ladder</td><td>Promega</td><td>G2101</td><td></td></tr><tr><td>Loading dye 1kb DNA ladder</td><td>Promega</td><td>G5711</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Promega</td><td>91176</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol egg yolk polymyxin agar</td><td>Merck</td><td>105267</td><td></td></tr><tr><td>McConkey Agar</td><td>Merck</td><td>105465</td><td></td></tr><tr><td>Nutrient Broth</td><td>Merck</td><td>105443</td><td></td></tr><tr><td>Taq polymerase</td><td>Merck</td><td>71003</td><td></td></tr><tr><td>Trypticase Soy Broth</td><td>Merck</td><td>105459</td><td></td></tr><tr><td>Trypticase Soy Agar</td><td>Merck</td><td>105458</td><td></td></tr></tbody></table>

development of an electrochemical dna biosensor to detect a foodborne pathogen

Vibrio Parahaemolyticus (V. Parahaemolyticus) ist eine gemeinsame lebensmittelbedingten Erreger, die für einen Großteil der Probleme der öffentlichen Gesundheit Global gesehen trägt erheblich auf die Rate der menschlichen Sterblichkeit und Morbidität. Konventionelle Methoden für den Nachweis von V. Parahaemolyticus wie Kultur-basierte Methoden, immunologischen Assays und molekularen Methoden erfordern komplizierte Probenbehandlung und sind zeitraubend, mühsam und teuer. Vor kurzem, Biosensoren erwiesen sich eine viel versprechende und umfassende Methode mit den Vorteilen der schnellen Erkennung, Wirtschaftlichkeit und Zweckmäßigkeit. Diese Forschung konzentriert sich auf die Entwicklung einer schnelle Methode zum Nachweis V. Parahaemolyticus mit hoher Selektivität und Empfindlichkeit, die mit den Prinzipien der DNA-Hybridisierung. In der Arbeit gelang mittels Röntgendiffraktometrie (XRD), Ultraviolett-sichtbare Spektroskopie (UV-Vis), Transmission Electron Microscopy (TEM), Feldemission Charakterisierung von synthetisierten Polymilchsäure Säure stabilisiert gold-Nanopartikeln (PLA-AuNPs) Rasterelektronenmikroskopie (FESEM) und zyklischer Voltammetrie (CV). Wir führten auch weitere Tests an Stabilität, Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit von PLA-AuNPs. Wir fanden, dass die PLA-AuNPs eine Klangstruktur von stabilisierten Nanopartikeln in wässriger Lösung gebildet. Wir beobachten auch, dass die Empfindlichkeit durch die kleinere Ladung übertragungswert Widerstand (R-ct) und eine Zunahme der aktiven Fläche (0,41 cm2) verbessert. Die Entwicklung unserer DNA-Biosensor beruhte auf Änderung der Siebdruck kohlenstoffelektrode (tauglich) mit PLA-AuNPs und mit Methylenblau (MB) als Redox-Indikator. Wir bewertet die Immobilisierung und Hybridisierung Ereignisse durch differenzielle Puls Voltammetrie (DPV). Wir fanden, dass ergänzende, nicht-ergänzende und nicht übereinstimmende Oligonukleotide wurden speziell zeichnet sich durch die vorgefertigten Biosensor. Es zeigte auch zuverlässig empfindliche Detektion in Kreuzreaktivität Studien von verschiedenen lebensmittelbedingten Krankheitserregern und bei der Identifizierung von V. Parahaemolyticus in frische Herzmuscheln.

Bildung von AuNPs zeigte sich durch die Veränderung der Farbe der wässrigen Lösung mit Natriumcitrat vorhanden. Dies verursacht die Farbe von hellgelb zu tief Rubinrot wechseln. Die Generation von PLA-AuNPs wurde aus den UV-Vis-Spektren (Abbildung 1), wo das Wachstum des Surface Plasmon Resonance (SPR) Peaks bei ca. 540 gefunden wurde, bestätigt nm. Die Entstehung und Existenz von PLA-AuNPs wurde auf 500-600 nm Wellenlänge reicht, je nach Partikel Größ...

Watch this Scientific Journal Video about Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen at JoVE.com

Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Entwicklung der eine elektrochemische DNA-Biosensor, einem Foodborne Krankheitserreger zu erkennen

Ein Protokoll für die Entwicklung der eine elektrochemische DNA-Biosensor bestehend aus eine Polymilchsäure Säure stabilisiert, gold-Nanopartikeln modifiziert, Siebdruck kohlenstoffelektrode Vibrio Parahaemolyticus erkennen wird vorgestellt.

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

development-an-electrochemical-dna-biosensor-to-detect-foodborne

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.0K Aufrufe.  Universiti Putra Malaysia. Ein Protokoll für die Entwicklung der eine elektrochemische DNA-Biosensor bestehend aus eine Polymilchsäure Säure stabilisiert, gold-Nanopartikeln modifiziert, Siebdruck kohlenstoffelektrode Vibrio Parahaemolyticus erkennen wird vorgestellt.

Serie: Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. Many patients would be better served by rapid, bedside tests. To this end our laboratory and others have developed a versatile, reagentless 
biosensor platform that supports the quantitative, reagentless, electrochemical detection of nucleic acids (DNA, RNA), proteins (including antibodies) and small 
molecules analytes directly in unprocessed clinical and environmental samples. In this video, we demonstrate the preparation and use of several biosensors in this 
"E-DNA" class. In particular, we fabricate and demonstrate sensors for the detection of a target DNA sequence in a polymerase chain reaction mixture, an HIV-specific antibody and the drug cocaine. The preparation procedure requires only three hours of hands-on effort followed by an overnight incubation, and their use requires only minutes.

"E-DNA" sensors, reagentless, electrochemical biosensors that perform well even when challenged directly in blood and other complex matrices, have been adapted to the detection of a wide range of nucleic acid, protein and small molecule analytes. Here we present a general procedure for the fabrication and use of such sensors.

Herstellung von elektrochemischen DNA Biosensoren für die Reagenzienfreier Nachweis von Nukleinsäuren, Proteinen und kleinen Molekülen

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Forschung

Biotechnik

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Electrochemical sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and can be adapted for detection of a wide variety of analytes. Electrochemical sensors operate by transducing a biological recognition event into a useful electrical signal. Signal transduction occurs by coupling the activity of a redox enzyme to an amperometric electrode. Sensor specificity is either an inherent characteristic of the enzyme, glucose oxidase in the case of a glucose sensor, or a product of linkage between the enzyme and an antibody or probe.
Here, we describe an electrochemical sensor assay method to directly detect and identify bacteria. In every case, the probes described here are DNA oligonucleotides. This method is based on sandwich hybridization of capture and detector probes with target ribosomal RNA (rRNA). The capture probe is anchored to the sensor surface, while the detector probe is linked to horseradish peroxidase (HRP). When a substrate such as 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) is added to an electrode with capture-target-detector complexes bound to its surface, the substrate is oxidized by HRP and reduced by the working electrode. This redox cycle results in shuttling of electrons by the substrate from the electrode to HRP, producing current flow in the electrode.

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

We describe an electrochemical sensor assay method for rapid bacterial detection and identification. The assay involves a sensor array functionalized with DNA oligonucleotide capture probes for ribosomal RNA (rRNA) species-specific sequences. Sandwich hybridization of target rRNA with the capture probe and a horseradish peroxidase-linked DNA oligonucleotide detector probe produces a measurable amperometric current.

Bakterielle Erkennung und Identifizierung mit elektrochemischen Sensoren

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses each and every year. Prevention of such outbreaks and minimization of the impact of an ongoing epidemic place an ever-increasing demand for analytical methods that can accurately identify culprit pathogens at the earliest stage. Although there is a large array of effective methods for pathogen detection, none of them can satisfy all the following five premier requirements embodied for an ideal detection method: high specificity (detecting only the bacterium of interest), high sensitivity (capable of detecting as low as a single live bacterial cell), short time-to-results (minutes to hours), great operational simplicity (no need for lengthy sampling procedures and the use of specialized equipment), and cost effectiveness. For example, classical microbiological methods are highly specific but require a long time (days to weeks) to acquire a definitive result.1 PCR- and antibody-based techniques offer shorter waiting times (hours to days), but they require the use of expensive reagents and/or sophisticated equipment.2-4 Consequently, there is still a great demand for scientific research towards developing innovative bacterial detection methods that offer improved characteristics in one or more of the aforementioned requirements. Our laboratory is interested in examining the potential of DNAzymes as a novel class of molecular probes for biosensing applications including bacterial detection.5
DNAzymes (also known as deoxyribozymes or DNA enzymes) are man-made single-stranded DNA molecules with the capability of catalyzing chemical reactions.6-8 These molecules can be isolated from a vast random-sequence DNA pool (which contains as many as 1016 individual sequences) by a process known as "in vitro selection" or "SELEX" (systematic evolution of ligands by exponential enrichment).9-16 These special DNA molecules have been widely examined in recent years as molecular tools for biosensing applications.6-8
Our laboratory has established in vitro selection procedures for isolating RNA-cleaving fluorescent DNAzymes (RFDs; Fig. 1) and investigated the use of RFDs as analytical tools.17-29 RFDs catalyze the cleavage of a DNA-RNA chimeric substrate at a single ribonucleotide junction (R) that is flanked by a fluorophore (F) and a quencher (Q). The close proximity of F and Q renders the uncleaved substrate minimal fluorescence. However, the cleavage event leads to the separation of F and Q, which is accompanied by significant increase of fluorescence intensity.
More recently, we developed a method of isolating RFDs for bacterial detection.5 These special RFDs were isolated to "light up" in the presence of the crude extracellular mixture (CEM) left behind by a specific type of bacteria in their environment or in the media they are cultured (Fig. 1). The use of crude mixture circumvents the tedious process of purifying and identifying a suitable target from the microbe of interest for biosensor development (which could take months or years to complete). The use of extracellular targets means the assaying procedure is simple because there is no need for steps to obtain intracellular targets.
Using the above approach, we derived an RFD that cleaves its substrate (FS1; Fig. 2A) only in the presence of the CEM produced by E. coli (CEM-EC).5 This E. coli-sensing RFD, named RFD-EC1 (Fig. 2A), was found to be strictly responsive to CEM-EC but nonresponsive to CEMs from a host of other bacteria (Fig. 3).
Here we present the key experimental procedures for setting up E. coli detection assays using RFD-EC1 and representative results.

We have recently reported a novel approach for generating fluorogenic DNAzyme probes that can be applied to set up a simple, "mix-and-read" fluorescent assay for bacterial detection. These special DNA probes catalyze the cleavage of a chromophore-modified DNA-RNA chimeric substrate in the presence of crude extracellular mixture (CEM) produced by a specific bacterium, thereby translating bacterial detection into fluorescence signal generation. In this report we will describe key experimental procedures where a specific DNAzyme probe denoted "RFD-EC1" is employed for the detection of the model bacterium, Escherichia coli (E. coli).

Nachweis von Bakterien mit fluorogenen DNAzyme

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses ...

Immunologie und Infektion

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

Optische Detektion von<em&gt; E. coli</em&gt; Bakterien durch Mesoporous Silicon Biosensoren

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration of pre-processing steps. Utilizing these devices towards the analysis of DNA hybridization events is important because it offers a technology for real time assessment of biomarkers at the point-of-care for various diseases. However, when the device footprint decreases the dominance of various physical phenomena increases. These phenomena influence the fabrication precision and operation reliability of the device. Therefore, there is a great need to accurately fabricate and operate these devices in a reproducible manner in order to improve the overall performance. Here, we describe the protocols and the methods used for the fabrication and the operation of a microfluidic-based electrochemical biochip for accurate analysis of DNA hybridization events. The biochip is composed of two parts: a microfluidic chip with three parallel micro-channels made of polydimethylsiloxane (PDMS), and a 3 x 3 arrayed electrochemical micro-chip. The DNA hybridization events are detected using electrochemical impedance spectroscopy (EIS) analysis. The EIS analysis enables monitoring variations of the properties of the electrochemical system that are dominant at these length scales. With the ability to monitor changes of both charge transfer and diffusional resistance with the biosensor, we demonstrate the selectivity to complementary ssDNA targets, a calculated detection limit of 3.8 nM, and a 13% cross-reactivity with other non-complementary ssDNA following 20 min&#160;of incubation. This methodology can improve the performance of miniaturized devices by elucidating on the behavior of diffusion at the micro-scale regime and by enabling the study of DNA hybridization events.

We present a microfluidic-based electrochemical biochip for DNA hybridization detection. Following ssDNA probe functionalization, the specificity, sensitivity, and detection limit are studied with complementary and non-complementary ssDNA targets. Results illustrate the influence of the DNA hybridization events on the electrochemical system, with a detection limit of 3.8 nM.

Einem mikrofluidischen Biochip-basierte Elektrochemische für Markierungsfreie DNA-Hybridisierungsanalyse

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) Method for Mycotoxin Detection

Immunoassays are a valid alternative to the more expensive and time consuming quantitative HPLC or GC1, 2 methods for the screening detection of hazardous mycotoxins in food commodities. In this protocol we show how to fabricate and interrogate an electrochemical competitive Enzyme linked immunomagnetic assay based on the use of magnetic beads as solid support for the immunochemical chain3 and screen printed electrodes as sensing platform.
Our method aims to determine the total amount of HT-2 and T-2 toxins, mycotoxins belonging to the trichothecenes family and of great concern for human health4. The use of an antibody clone with a cross reactivity of 100% towards HT-2 and T-2 allows to simultaneously detect both toxins with similar sensitivity5.
The first step of our assay is the coating step where we immobilize HT2-KLH conjugate toxin on the surface of magnetic beads. After a blocking step, necessary to avoid non-specific absorptions, the addition of a monoclonal antibody allows the competition between immobilized HT-2 and free HT-2 or T-2 present in the sample or dissolved in a standard solution.
At the end of the competition step, the amount of monoclonal antibody linked to the immobilized HT-2 will be inversely proportional to the amount of toxin in the sample solution.
A secondary antibody labeled with alkaline phosphatase (AP) is used to reveal the binding between the specific antibody and the immobilized HT-2. The final measurement step is performed by dropping an aliquot of magnetic bead suspension, corresponding to a specific sample/standard solution, on the surface of a screen-printed working electrode; magnetic beads are immobilized and concentrated by means of a magnet placed precisely under the screen-printed electrode. After two minutes of incubation between magnetic beads and a substrate for AP, the enzymatic product is detected by Differential Pulse Voltammetry (DPV) using a portable instrument (PalmSens) also able to initiate automatically eight measurements within an interval of few seconds.

ELIME Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical Method for Mycotoxin Detection

A protocol to detect trichothecenes (mycotoxins of concern for human health) using a newly developed screening method based on a competitive immunochemical method and a final electrochemical detection is demonstrated.

ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Elektrochemische) Verfahren zur Mykotoxin-Erkennung

Immunoassays are a valid alternative to the more expensive and time consuming quantitative HPLC or GC1, 2 methods for the screening detection of hazardous ...

Biologie

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 has been linked to both waterborne and foodborne illnesses, and remains a threat despite the food- and water-screening methods used currently. While conventional bacterial detection methods, such as polymerase chain reaction (PCR) and enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) can specifically detect pathogenic contaminants, they require extensive sample preparation and lengthy waiting periods. In addition, these practices demand sophisticated laboratory instruments and settings, and must be executed by trained professionals. Herein, a protocol is proposed for a simpler diagnostic technique that features the unique combination of magnetic and fluorescent parameters in a nanoparticle-based platform. The proposed multiparametric magneto-fluorescent nanosensors (MFnS) can detect E. coli O157:H7 contamination with as little as 1 colony-forming unit present in solution within less than 1 h. Furthermore, the ability of MFnS to remain highly functional in complex media such as milk and lake water has been verified. Additional specificity assays were also used to demonstrate the ability of MFnS to only detect the specific target bacteria, even in the presence of similar bacterial species. The pairing of magnetic and fluorescent modalities allows for the detection and quantification of pathogen contamination in a wide range of concentrations, exhibiting its high performance in both early- and late-stage contamination detection. The effectiveness, affordability, and portability of the MFnS make them an ideal candidate for point-of-care screening for bacterial contaminants in a wide range of settings, from aquatic reservoirs to commercially packaged foods.

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

The overall goal of this protocol is to synthesize functional nanosensors for the portable, cost-effective, and rapid detection of specifically targeted pathogenic bacteria through a combination of magnetic relaxation and fluorescence emission modalities.

Foodborne Krankheitserreger Screening mit Magneto-fluoreszierende Nanosensor: Schnellnachweis von E. Coli O157: H7

Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 has been linked to both waterborne and foodborne illnesses, and remains a threat despite the food- and ...

Electrowetting-based Digital Microfluidics Platform for Automated Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Electrowetting is the effect by which the contact angle of a droplet exposed to a surface charge is modified. Electrowetting-on-dielectric (EWOD) exploits the dielectric properties of thin insulator films to enhance the charge density and hence boost the electrowetting effect. The presence of charges results in an electrically induced spreading of the droplet which permits purposeful manipulation across a hydrophobic surface. Here, we demonstrate EWOD-based protocol for sample processing and detection of four categories of antigens, using an automated surface actuation platform, via two variations of an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) methods. The ELISA is performed on magnetic beads with immobilized primary antibodies which can be selected to target a specific antigen. An antibody conjugated to HRP binds to the antigen and is mixed with H2O2/Luminol for quantification of the captured pathogens. Assay completion times of between 6 and 10 min were achieved, whilst minuscule volumes of reagents were utilized.

Electrowetting-based digital microfluidic is a technique that utilizes a voltage-driven change in the apparent contact angle of a microliter-volume droplet to facilitate its manipulation. Combining this with functionalized magnetic beads enables the integration of multiple laboratory unit operations for sample preparation and identification of pathogens using Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA).

Elektrowetting-basierte Digital Microfluidics Plattform für automatisierte enzymgebundene Immunsorbent Assay

Electrowetting is the effect by which the contact angle of a droplet exposed to a surface charge is modified. Electrowetting-on-dielectric (EWOD) exploits ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Eine High-Throughput-Plattform für das Screening von Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Colorimetric Detection of Bacteria Using Litmus Test

There are increasing demands for simple but still effective methods that can be used to detect specific pathogens for point-of-care or field applications. Such methods need to be user-friendly and produce reliable results that can be easily interpreted by both specialists and non-professionals. The litmus test for pH is simple, quick, and effective as it reports the pH of a test sample via a simple color change. We have developed an approach to take advantage of the litmus test for bacterial detection. The method exploits a bacterium-specific RNA-cleaving DNAzyme to achieve two functions: recognizing a bacterium of interest and providing a mechanism to control the activity of urease. Through the use of magnetic beads immobilized with a DNAzyme-urease conjugate, the presence of bacteria in a test sample is relayed to the release of urease from beads to solution. The released urease is transferred to a test solution to hydrolyze urea into ammonia, resulting in an increase of pH that can be visualized using the classic litmus test.

We describe a protocol for colorimetric detection of E. coli using a modified litmus test that takes advantage of an RNA-cleaving DNAzyme, urease, and magnetic beads.

Kolorimetrischen Nachweis von Bakterien mit Lackmus-Test

There are increasing demands for simple but still effective methods that can be used to detect specific pathogens for point-of-care or field applications. ...