Pool Design und Oligo Erholung <ol><li> Der erste Schritt ist, die pre-mRNA-Pool Design studiert werden. Dies kann mit Hilfe der UCSC Genome Browser und das Herunterladen bestimmter Gene, Spleißstellen oder anderen Bereichen von Interesse sein. </li><li> Sobald die Fenster von Interesse ausgewählt wurden, Fliesen über sie rechnerisch unter den folgenden Bedingungen: read Länge sollte 30 Nukleotiden mit einer 10 Nukleotid überlappen, so daß jeder Oligo ist 20 Nukleotide aus dem Stand eins verschoben werden. * Oligo überschneiden sollten in der Nähe Spleißstellen erhöht werden, um ausreichenden Versicherungsschutz zu sorgen; zunehmende Überlappung von 10 bis 20 Nukleotide können dies zu erreichen. </li><li> Flanke jedes 30-Nukleotid-Oligo mit Universal Primer-Sequenzen, mit denen in den Pool hinter verstärken wird. Tiled Oligo Aufträge sollten an Agilent, wo die Sequenzen auf einem benutzerdefinierten Oligonukleotid-Microarray gedruckt werden eingereicht werden. </li><li> Zur Wiederherstellung der DNA Oligos aus der Microarray-Oberfläche, indem Sie das Array Deckglas in einem Array Hybridisierung Kammer und sanft Pipettieren 500 &amp;mgr; l dH 2 O auf der Folie beginnen </li><li> Sandwich das Array auf der Oberseite des Deckels schieben und darauf achten, Luftblasen, die den Prozess stören können vermieden werden. Achten Sie darauf, um das Array Gesicht Platz nach unten, so dass die Seite mit den Oligos ist die Berührung der Oberfläche des Wassers. Eine gute Faustregel ist, &quot;Agilent Agilent berührt&quot; bedeutet, dass die Agilent-Label auf dem Array der Agilent-Label Gesichter auf dem Deckglas </li><li> Schließen Sie die Hybridisierung Kammer und drehen über Nacht bei 99 ° C in einem Hybridisierungsofen </li><li> Am folgenden Tag, entfernen Sie vorsichtig das Array aus der Kammer und ziehen Sie das Wasser, das nun die Oligos befreit von der Array-Oberfläche. Dies ist die Oligo-Pool </li><li> Setzen Sie den Pool in einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen und beschallen den Pool bei 50% Amplitude für 3-5 Sekunden-Takt </li><li> Next, verstärken den Pool von Low Cycle PCR, mit der Universal Primer mit einem T7-Tag am Ende angehängt. Für die erste Runde, denaturieren bei 94 ° C für 1 Minute bei 55 ° C tempern für 20 Sekunden, und längliche für 1 Minute bei 72 ° C. Für den folgenden Runden, do 10 Sekunden, 20 Sekunden und 10 Sekunden auf der jeweiligen Temperatur, mit einem letzten Elongationsschritt von 5 Minuten bei 72 ° C. Da die Anzahl der Zyklen notwendig, um den Pool zu verstärken, hängt von der Effizienz der Oligo Erholung, kann es notwendig sein, um mehrere Taktzahlen versuchen. Achten Sie darauf, nicht zu stark verstärken den Pool, die durch eine verschmierte Bande auf ein Acrylamid-Gel bezeichnet wird. PCR-Proben können bei 4 ° C gelagert werden, bis sie benötigt. </li><li> Der letzte Schritt in Oligo Vorbereitung ist, um RNA zu transkribieren über die MEGAshortscript ™ Kit von Ambion. * Das folgende Protokoll wurde von Ambion angepasst <ol class="lalpha"><li> Auftauen T7 10x Reaktionspuffer, vier Ribonukleotid Lösungen und Wasser bei Raumtemperatur unter Beibehaltung der T7-Enzym-Mix auf Eis </li><li> Montieren Sie die Reaktionsmischung in ein RNase-freies Reaktionsgefäß bei Raumtemperatur. Komponenten der Reaktion Puffer kann Template-DNA zu fällen führen, wenn die Reaktion auf Eis vermischt wird. </li><li> In der folgenden Reihenfolge, Pipette 3 ul Nuklease-freies Wasser, 2 ul der 10x Reaktionspuffer, 2 &amp;mgr; l je 75 mM NTP-Lösung, 5 ul der Template-DNA (die PCR Oligo-Pool) und 2 ul T7-Enzym, für ein Endvolumen von 20 ul </li><li> Flick das Rohr vorsichtig, um die Reaktion dann kurz zentrifugieren der Mischung am Boden des Röhrchens zu sammeln mischen. </li><li> Inkubieren Sie die Reaktion in einem Thermocycler bei 37 ° C für 2 Stunden. Inkubationszeit werden Template-abhängigen, daher kann es erforderlich sein, um eine Zeit-Gänge-Experiment zu verwenden, um die optimale Inkubationszeit für maximale Ausbeute zu bestimmen </li><li> Nach 2 Stunden, entfernen Sie die Template-DNA durch Zugabe von 1 ul der Turbo DNase, um die Reaktion und bei 37 ° C für weitere 15 Minuten </li><li> Beenden Sie die Reaktion und Wiederherstellung der RNA durch Phenol / Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung. <ol class="lalpha"><li> Für einen 20 ul Reaktionsvolumen, fügen Sie 115 ul von dH 2 O und 15 ul 3 M Natriumacetat, um die Reaktion. </li><li> Gründlich mischen fügen Sie dann 75 ul saurem Phenol und 75 ul Chloroform. Mischen Sie die Lösung durch Vortexen, dann Mikrozentrifuge für eine Minute bei 13.000 rpm bei Raumtemperatur. Übertragen Sie die wässrige Schicht in ein neues Röhrchen und die Extraktion </li><li> Übertragen Sie die wässrige Schicht in ein neues Röhrchen und fügen 150 ul Chloroform. Vortex die Mischung und Zentrifuge wie zuvor. Übertragen Sie die wässrige Schicht in ein neues Röhrchen. </li></ol></li><li> Recover die RNA durch Zugabe von zwei Volumen 100% kaltem Ethanol zur wässrigen Schicht und gut mischen. Gefühlt die Mischung für mindestens 15 Minuten bei -20 ° C dann bei 4 ° C zentrifugieren für 15 Minuten bei maximaler Geschwindigkeit zu Pellets der RNA. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 105 ul von 0,1 x Tris-EDTA (TE) Buffer .. </li></ol></li><li> Es ist schwierig, alle freien Nukleotiden aus der T7 Kit Reaktion zu entfernen, so dass für die genauesten Ergebnisse, Quantifizierung der RNA mit RiboGreen. <ol class="lalpha"><li> Zu Beginn der Quantifizierung zunächst verdünnt genug 1x TE, 2.300 ul + 50μL/sample. </li><li> Als nächstes machen RiboGreen. Sie wird 1000 müssen ul + 50 ul / Probe. Für eine hohe Reichweite Proben (1 pg / ml bis 20 ng / mL) mischen RiboGreen 1:200 in 1x TE, für den niedrigen Bereich Proben (50 ng / ml bis 1 ng / ml) mischen RiboGreen 1:2000 mit 1x TE ; Je 50 ul der RiboGreen Lösung in jede Vertiefung eine undurchsichtige Platte, beginnend mit A1 und nach unten bewegen, nicht über </li><li> Verdünnen Sie eine RNA-Stammlösung zu 2 pg / mL für hohe Reichweite Proben oder 100 ng / ul für niedrige Bandbreite Proben </li><li> Mit der Stammlösungen, erstellen Sie eine Standard-Kurve von sechs nachfolgenden 01.02 Verdünnungen der ursprünglichen 2 pg / mL bzw. 100 ng / mL Lager Pipette 240 &amp;mgr; l der Brühe in eine PCR-Streifen-Rohr. In den verbleibenden 7 Röhren, Pipette 120 ul 1x TE. Nehmen Sie 120 ul aus der RNA Lager gut verrühren und mit Rohr 2. Nehmen Sie 120 ul von Rohr 2 und mischen sich mit Rohr 3. Wiederholen, bis das Rohr 7. Rohr 8 wird nur TE und wird Ihre blank sein. Je 50 ul der Standardkurve-Lösungen in die undurchsichtige Platte, A1: H2 (run die Kurve zweimal) </li><li> In ein neues Rohr, Mix 45 ul TE mit 5 ul der Oligo-Pool und fügen Sie alle 50 ul einer gut, dass 50 ul RiboGreen enthält. </li><li> Mit einem Platten-Lesegerät das Gerät so einstellen las-Fluoreszenz von der Spitze nach einer Minute mischen sich mit einer Anregungswellenlänge von 485 nm und Emissionswellenlänge von 530 nm und lesen Sie die Platte </li><li> Verwenden Sie die Standardkurve generiert, um das gewonnene RNA zu quantifizieren, die bei -20 ° C aufbewahrt werden sollte </li></ol></li></ol> Co-Immunpräzipitation der Oligo-Pool mit einer RNP von Interesse <ol><li> Vor Beginn der Co-Immunopräzipitation, bereiten die Protein A und Protein G Dynabeads von Invitrogen, indem man sie in einem Verhältnis von 1:1 bis zu einem Endvolumen von 50 ul pro Reaktion. Zum Beispiel für zwei Reaktionen würden Sie mit 50 ul jeder einzelnen Perle. </li><li> Verwenden Sie einen Magnetic Separation Stehen wie dieses von Novagen, um die Perlen in Position zu halten, während Sie den Überstand zu entfernen und waschen Sie die Perlen zweimal mit dem gleichen Volumen kalten 1x PBS </li><li> Nach dem zweiten Waschen, resuspendieren die Kügelchen in einem gleichen Volumen kalten 1x PBS und mit 2 ng des Antikörpers pro Reaktion. Dieser Betrag kann je nach den Antikörper, so Experimente notwendig, um die optimalen Bedingungen zu finden. </li><li> Inkubieren der Antikörper / Perlen Mischung über Nacht bei 4 ° C auf einer rotierenden Plattform </li><li> Am Morgen, fügen Sie 2 g pro Reaktion beschallt Hefe-Gesamt-RNA, um unspezifische Bindung zu blockieren, und drehen Sie für weitere 30 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Mit dem magnetischen Rack an die Perlen zu halten, entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Perlen zweimal mit kaltem 1x PBS, so dass die PBS aus dem zweiten Waschen in die Röhre. </li><li> Nehmen Sie neue Rohre, eine für jede Reaktion und aliquote 50 ul der Raupe Mischung in jedes Röhrchen. Lassen Sie die Kugeln sitzen, während der Vorbereitung einen Master-Mix </li><li> Für jede Reaktion mit 200 ng des Oligo-Pool, einem äquimolaren Verhältnis von Primern, 2 ug beschallt Hefe-Gesamt-RNA, 20 uL HeLa Kernextrakt (dies ist die RNP-Quelle) und Puffer E, um die Lautstärke zu bringen bis zu 120 ul. Der Schutz Primer sind RNA-Versionen der universellen Primern. Auftrag Transkription Vorlagen der Universal-Primer mit einem T7-Tag am Ende angehängt, dann transkribieren RNA aus den Vorlagen mit dem MEGAshortscript ™ Kit. </li><li> Entfernen Sie den Überstand von der Perle Aliquots und resuspendieren Perlen in 120 ul des Master-Mix. Rock the Reaktionen bei 4 ° C für 1-2 Stunden. </li><li> Nach der Inkubation für jede Reaktion, entfernen Sie ein kleines Aliquot (einschließlich der Perlen) für eine &quot;totale&quot; RNA-Proben </li><li> Platzieren Sie den Rest der Reaktionen auf die magnetische Trennung stehen und entfernen Sie den Überstand. Es ist zwar nicht notwendig, diese Flow-Through-Probe Downstream zu analysieren, kann es nützlich sein, um zu sparen. </li><li> Waschen Sie die Kugeln 1-2 mal mit 50 ul kaltem 1x PBS. Die RNA gebunden an den Antikörper auf den Kügelchen ist die &quot;IP&quot;-Probe. </li><li> Resuspendieren &quot;total&quot; und der &quot;IP&quot; Perlen in 50 ul 1% SDS in 0,1 x TE-Puffer und Wärme die Proben bei 65 ° C für 15 Minuten, um die RNA zu eluieren. </li><li> Entfernen Sie den Überstand, der jetzt enthält die RNA, die zuvor an die Kügelchen gebunden war und sauber durch Phenol / Chloroform-Extraktion durch eine Ethanolfällung folgte. Trocknen Sie die Pellet resuspendieren und in 50 ul 0,1 x TE-Puffer. </li></ol> Reverse Transkription und Amplifikation von Co-IP-Proben in Vorbereitung für aminoallyl Kennzeichnung <ol><li> Als nächstes muss der RNA-Proben werden revers transkribiert und mittels PCR amplifiziert. Für die Reaktion der reversen Transkription, verwenden Sie die reverse universelle Primer. </li><li> Für jede Probe durch Mischen 1 ul beginnenumgekehrt universelle Primer, mit 1 ul der Template-RNA (aus der Immunpräzipitation Reaktion) und 10 ul dH 2 O. Erhitzen Sie die Reaktionen bei 70 ° C für 5 Minuten auf Eis kühlen oder halten bei 4 ° C. </li><li> Während die Proben kühl, die folgenden Master-Mix. Für jede Reaktion kombinieren 4 ul 10 mM dNTPs, 2 ul 10x Arrayscript Puffer, 1 ul RNase-Inhibitor und 1 ul reverse Transkription Enzym. Gründlich mischen und fügen 8 &amp;mgr; l des Master-Mix für jede Reaktion der reversen Transkription. </li><li> Verwenden Sie eine PCR-Maschine, die Proben bei 42 ° C inkubieren für 2 Stunden, gefolgt von 95 ° C für 5 Minuten, dann 4 ° C, bis die Proben sind für eine Verstärkung benötigt. </li><li> Nach reverse Transkription der RNA-Proben, verstärken PCR sie mit dem Universal-Primer, mit einer der Primer mit einem T7-Tag. Die Anzahl der Zyklen erforderlich, um den Pool verstärken wird auf die Effizienz der Zusammenarbeit IP hängen so kann es notwendig sein, um mehrere Zyklen zu versuchen. Jede Reaktion erfordert 5 ul 10x Taq Reaktionspuffer, 0,2 ul von jedem Primer (100 mM), 1 ul der cDNA-Template (aus der Reaktion der reversen Transkription), 1 ul 10 mM dNTPs, 42,2 ul dH 2 O, und 0,4 ul der Taq-Enzym. Beginnen Sie mit der PCR durch Inkubation der Proben bei 94 ° C für 3 Minuten. Als nächstes für jeden Zyklus, Denaturierung bei 94 ° C für 45 Sekunden, bei 55 ° C tempern für 30 Sekunden, und längliche bei 72 ° C für 1 Minute, mit einer abschließenden Elongation bei 72 ° C für 10 Minuten. </li><li> Als nächstes transkribieren die Proben erneut mit dem MEGAshortscript ™ Kit jedoch, fügen Sie diese Zeit 2 ul der aminoallyl UTP, anstelle des T7 UTP. Die aminoallyl UTP wird verwendet, um die RNA mit dem Cy-Farbstoffe zu kennzeichnen. </li><li> Phenol / Chloroform und Ethanol Fällung der Proben. Verwenden Sie KEINE Glycoblue oder Ammoniumacetat, können beide mit Hybridisierung der Proben auf das Array stören. Trocknen Sie die Pellet resuspendieren und in 4,5 &amp;mgr; l 0,1 M Natriumcarbonat. </li></ol> Amino-allyl Markierung von RNA mit Cy Dyes <ol><li> Zu Beginn der Kennzeichnung Protokoll löst jede der Fluoreszenzfarbstoffe, Cy3 und Cy5, in 45 ul DMSO. Um zu vermeiden, Licht, wickeln Sie die Rohre in Alu-Folie und bei -20 ° C im Dunkeln </li><li> Add 2,5 ul Nuklease-freies Wasser, um Proben RNA und gründlich mischen </li><li> Als Nächstes fügen Sie 3 ul der Cy3 die &quot;total&quot;-Probe, und 3 ul Cy5 die &quot;IP&quot;-Probe. Inkubieren Sie die Proben im Dunkeln für 1 Stunde bei Raumtemperatur; Die Cy-3 Probe wird rot oder rosa, während die Cy-5 wird blau. </li><li> Zur Beendigung der Reaktion, man 6 ul 4 M Hydroxylamin-HCl zu jeder Probe, mischen und Spin kurz. Inkubieren für 15 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Purify der markierten Proben durch Phenol / Chloroform-Extraktion durch Ethanolfällung und Pellet in 50 ul 0,1 x TE gefolgt </li></ol> Hybridisieren Proben, die Microarray mit dem Agilent Array Hybridisierung Kit <ol><li> Beginnen Sie mit der Hybridisierung durch vorsichtiges Mischen 50 ul 10x Blockierungspuffer, 140 ul von Nuklease-freiem H2 O, 25 ul der Cy3-markierten &quot;total&quot; Pool, 25 ul der Cy5-markierten &quot;IP&quot;-Pool, 10 ul der 25x Fragmentierung Puffer und 250 ul der 2x Hybridisierungspuffer, wobei darauf zu achten Einführung Blasen. Microfuge die Probe kurz auf die Lösung in den Boden des Röhrchens zu sammeln und zu Blasen zu reduzieren. </li><li> Setzen Sie den O-Ring Deckglas in der Hybridisierung Kammer und sorgfältig Pipette die Lösung auf die Folie. </li><li> Legen Sie die Erkennung Array auf dem Deckglas zu &quot;Sandwich&quot;-Lösung. Denken Sie daran zu orientieren Array schieben, so dass die Agilent-Label auf dem Array steht die Agilent-Label auf dem Cover schieben. </li><li> Spannen Sie die Folie / array Sandwich in der Hybridisierung Kammer und drehen bei 50 ° C für 3 Stunden. </li><li> Während die Array rotiert, nehmen Sie die folgenden 50 mL Lösungen in 50-ml konische Röhrchen: eine konische gefüllt mit 50 ml dH 2 O, zwei 1x SCC Pufferlösungen, jeweils in einem separaten Röhrchen und ein 2x SCC-Puffer. </li><li> Nach der dreistündigen Inkubation sorgfältig ausspannen Array / Dia-Sandwich und legen Sie es in der 50 ml-Erlenmeyerkolben mit den 2x SCC-Puffer. Mit einer Pinzette vorsichtig trennen das Array aus dem Deckel schieben und ziehen Sie den Deckel schieben. Achten Sie darauf, das Array als die Folie herausgezogen berühren. Schließen Sie die konische und schonend für 60 Sekunden umdrehen. </li><li> Mit der Pinzette, übertragen Sie die Array auf die 1x SCC-Lösung, Kappe der Röhre, und sanft für 1 Minute dann invertieren Transfer des Arrays auf den zweiten 1x SCC-Lösung und wieder sanft für eine weitere Minute umzukehren. </li><li> Schließlich übertragen das Array in die Röhre dH 2 O und schonend für 30 Sekunden umdrehen. </li><li> Dry das Array, indem die Ränder der Folie auf einem Kimwipe. Fahren Sie mit dem Array auf drehen Sie das Tuch und achten Sie darauf nicht stören die Seite mit den Oligos. </li><li> Setzen Sie den trockenen Array inein leeres 50-ml konischen Rohr-und Scan mit einem Microarray-Scanner </li></ol> Die Interpretation der Microarray <ol><li> Die Microarray-Scanner wird ein TIF-Bild des Arrays. Führen Sie dieses Image durch die Agilent Feature Extraction Software, mit der Grid-Datei (im Lieferumfang von Agilent), die einzigartig auf Ihre speziellen Pool ist. </li><li> Die Agilent-Software wird das Signal an jedes Feature zu interpretieren, um eine Datei, die mit einem Perl-Skript analysiert wird erstellt. Das Signal an die einzelnen Funktionen, um die gesamte Intensität bei diesem Kanal zu normalisieren. Zum Beispiel bei einer bestimmten Funktion in den grünen Kanal, ist die Intensität der grünen Kanal für die einzelnen Leistungsstufen durch die gesamte Intensität des grünen Kanals über alle Funktionen unterteilt. Die endgültige Ausgabe wird das Protokoll Verhältnis der Rot-Kanal über den grünen Kanal in jede Funktion auf dem Array. </li><li> Die Oligo-Pool-Daten aus der Microarray kann wieder auf das Genom re-mapped sich ein Bild von dem zu bekommen, und wie stark, wird die gebundene RNP von Interesse. </li></ol> Abbildung 1. Experimentelle schematische <img src="/files/ftp_upload/1622/1622fig1a.jpg" alt="Abbildung 1a" /> A. Kachelschemas. Nach Auswahl und Download pre-mRNA-Sequenzen von Interesse, ist die Auswahl Bereich durch in 30 Nukleotid-Fenster, die Verschiebung in 10 Nukleotid-Schritten gefliest. Universal-Primer-Bindungsstellen Flanke jeder Seite des Fensters. <img src="/files/ftp_upload/1622/1622fig1b.jpg" alt="Abbildung 1b" /> B. Synthese Array. Tiled Oligo Aufträge sollten an Agilent, wo die Sequenzen auf einem benutzerdefinierten Oligonukleotid-Microarray gedruckt werden eingereicht werden. <img src="/files/ftp_upload/1622/1622fig1c.jpg" alt="Abbildung 1c" /> C. Co-Immunpräzipitation. Nach dem Kochen die Oligos aus dem Array, inkubieren in HeLa Kernextrakt, fügen Sie dann den Extrakt auf magnetische Kügelchen, die mit einem Antikörper gegen das RNP von Interesse bereit sind. Beschriften Sie die Start-Oligo-Pool mit Cy3 und die gebundene IP-Pool mit Cy5 und gelten für den Nachweis Array und scannen. Abbildung 2. Anmerkungen des Genoms mit und Analyse von Daten Bereicherung. <img src="/files/ftp_upload/1622/1622fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> A. Konvertieren Sie die durchschnittliche Punktzahl bei jedem genomische Koordinate aus der Array-Daten zur Basis-ten anmelden und Karte, die Gäste zu den angegebenen Koordinaten. Eine Darstellung dieser Mittelung Schritt ist für 3 überlappenden 30-nt Oligos mit Noten von 2, 4 und 0,5, wo die durchschnittliche Anreicherung Punktzahl für jede 10-nt-Fenster oben graphisch gegeben. Die ausgewählten genomischen Regionen wird über einen benutzerdefinierten Track in der USCS Genome Browser. Das Beispiel Browser-Fenster gegeben ist in der CLTA Gen, wo Gen-Funktionen (Exons / Introns / alternative Spleißen etc.) entlang der unteren und mittleren log Bereicherung Partituren aus dem PTB-gebundenen Oligos gegeben sind, werden durch dunkle rote senkrechte Balken dargestellt. PTB stark bindet kurz vor Exon 2 in der Polypyrimidintrakt.

Wenn Sie dieses Verfahren ihr wichtig, dass die Schöpfung des Pools erinnere, ist flexibel und offen für Veränderungen entweder an der RNA-oder Protein-Ebene. Bei der RNA-Ebene orthologen Regionen, Krankheit Mutationen, Polymorphismen oder Mutationen können in der Oligonukleotid-Sequenz eingeführt werden. Bei der Protein-Ebene der RNA-Bindung Faktor kann durch Phosphorylierung oder andere post-translationale Modifikationen verändert werden. Darüber hinaus kann die Bindung Umfeld manipuliert werden, um entweder er...

a rapid high-throughput method for mapping ribonucleoproteins (rnps) on human pre-mrna

Sequencing RNAs, dass die Zusammenarbeit Immunopräzipitat (Co-IP) mit RNA-bindende Proteine ​​hat unser Verständnis von Spleißen durch den Nachweis, dass die Bindung Standort erhöht oft Einflüsse Funktion eines Spleißfaktor. Doch wie bei jeder Strategie der Probenahme ist die Chance, eines RNA gebunden an eine Spleißfaktor ist proportional zu seiner zellulären Hülle und Fülle. Wir haben ein neues in vitro-Ansatz für die Vermessung Bindungsspezifität auf sonst vorübergehende pre-mRNA entwickelt. Dieser Ansatz nutzt eine speziell Oligonukleotid-Pool, Fliesen in Introns, Exons, Spleißstellen oder anderen pre-mRNA. Der Pool ist eine Art molekulare Selektion unterzogen. Hier zeigen wir die Methode durch die Trennung der Oligonukleotid in einen gebundenen und ungebundenen Fraktion und nutzen zwei Farb-Array-Strategie, um die Anreicherung von jedem Oligonukleotid in der gebundenen Fraktion aufzunehmen. Die Array-Daten erzeugt hochauflösende Karten mit der Fähigkeit zu identifizieren Sequenz-spezifische und strukturelle Bestimmtheiten der ribonucleoprotein (RNP) verbindlich pre-mRNA. Ein einzigartiger Vorteil dieses Verfahrens liegt in seiner Fähigkeit, die Probenahme Ausrichtung auf mRNA mit aktuellen IP und SELEX Techniken verbunden zu vermeiden, da der Pool speziell entwickelt wurde, und von prä-mRNA-Sequenz synthetisiert. Die Flexibilität der Oligonukleotid-Pool ist ein weiterer Vorteil, da der Experimentator wählt, welche Regionen zu studieren und Fliesen auf, Schneiderei am Pool auf ihre individuellen Bedürfnisse. Mit dieser Technik kann man Assay die Auswirkungen von Polymorphismen oder Mutationen auf die Bindung im großen Maßstab oder Klon der Bibliothek in einen funktionalen Spleißen Reporter und identifizieren Oligonukleotide, sind im Lieferumfang enthalten Fraktion angereichert. Dieser Roman in vitro hochauflösenden Kartierung Programm bietet die einzigartige Möglichkeit, RNP Interaktionen mit transienten pre-mRNA-Spezies, deren geringer Menge macht es schwer, sich mit aktuellen In-vivo-Techniken zu studieren.

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A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Durch die vorübergehende Natur der pre-mRNA, kann es schwierig sein zu isolieren und zu studieren<em&gt; In vivo</em&gt;. Hier präsentieren wir eine neuartige<em&gt; In-vitro-</em&gt; Ansatz zur RNA-Protein-Interaktionen mit Hilfe eines synthetischen Oligo-Pool zu untersuchen, die Fliesen in ausgewählten Regionen der pre-mRNA.

Eine schnelle High-Throughput-Verfahren zur Abbildung Ribonukleoproteine ​​(RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

a-rapid-high-throughput-method-for-mapping-ribonucleoproteins-rnps-on

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

11.7K Aufrufe.  Brown University. Durch die vorübergehende Natur der pre-mRNA, kann es schwierig sein zu isolieren und zu studieren In vivo. Hier präsentieren wir eine neuartige In-vitro- Ansatz zur RNA-Protein-Interaktionen mit Hilfe eines synthetischen Oligo-Pool zu untersuchen, die Fliesen in ausgewählten Regionen der pre-mRNA.

Serie: A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

Neuartige RNA-bindende Proteine ​​Isolation durch die rasche Methodik

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

Forschung

Genetik

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most cases, the action of noncoding RNAs is mediated by proteins whose functions are in turn regulated by these interactions with noncoding RNAs. Consistent with this, a growing number of proteins involved in nuclear functions have been reported to bind RNA and in a few cases the RNA-binding regions of these proteins have been mapped, often through laborious, candidate-based methods.
Here, we report a detailed protocol to perform a high-throughput, proteome-wide unbiased identification of RNA-binding proteins and their RNA-binding regions. The methodology relies on the incorporation of a photoreactive uridine analog in the cellular RNA, followed by UV-mediated protein-RNA crosslinking, and mass spectrometry analyses to reveal RNA-crosslinked peptides within the proteome. Although we describe the procedure for mouse embryonic stem cells, the protocol should be easily adapted to a variety of cultured cells.

We describe a protocol to identify RNA-binding proteins and map their RNA-binding regions in live cells using UV-mediated photocrosslinking and mass spectrometry.

Probenvorbereitung für Masse Spektrometrie-basierte Identifikation der RNA-bindende Regionen

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Biochemie

An Oligonucleotide-based Tandem RNA Isolation Procedure to Recover Eukaryotic mRNA-Protein Complexes

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein complexes is essential to understanding mRNA regulation inferred by interacting proteins or non-coding RNAs. Herein, we describe a tandem RNA isolation procedure (TRIP) that enables the purification of endogenously formed mRNA-protein complexes from cellular extracts. The two-step protocol involves the isolation of polyadenylated mRNAs with antisense oligo(dT) beads and subsequent capture of an mRNA of interest with 3&#39;-biotinylated 2&#39;-O-methylated antisense RNA oligonucleotides, which can then be isolated with streptavidin beads. TRIP was used to recover in vivo crosslinked mRNA-ribonucleoprotein (mRNP) complexes from yeast, nematodes and human cells for further RNA and protein analysis. Thus, TRIP is a versatile approach that can be adapted to all types of polyadenylated RNAs across organisms to study the dynamic re-arrangement of mRNPs imposed by intracellular or environmental cues.

A tandem RNA isolation procedure (TRIP) for recovery of endogenously formed mRNA-protein complexes is described. Specifically, RNA-protein complexes are crosslinked in vivo, polyadenylated RNAs are isolated from extracts with oligo(dT) beads, and particular mRNAs are captured with modified RNA antisense oligonucleotides. Proteins bound to mRNAs are detected by immunoblot analysis.

Ein Oligonukleotid-basierte Tandem RNA Isolierung Vorgehensweise eukaryotischen mRNA-Protein-komplexe

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used strategy for RBP capture exploits the polyadenylation [poly(A)] of target RNAs, which mostly occurs on eukaryotic mature mRNAs, leaving most binding proteins of non-poly(A) RNAs unidentified. Here we describe the detailed procedures of a recently reported method termed click chemistry-assisted RNA-interactome capture (CARIC), which enables the transcriptome-wide capture of both poly(A) and non-poly(A) RBPs by combining the metabolic labeling of RNAs, in vivo UV cross-linking, and bioorthogonal tagging.

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

A detailed protocol for applying the click chemistry-assisted RNA-interactome capture (CARIC) strategy to identify proteins binding to both coding and noncoding RNAs is presented.

Erfassung und Identifizierung von RNA-bindende Proteine mit Click-Chemie-gestützte RNA-Interaktom erfassen (CARIC) Strategie

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

RiboTag Immunoprecipitation in the Germ Cells of the Male Mouse

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, characterizing differences in the translatome (the whole of translated mRNAs) provides an additional layer of information particularly useful when trying to understand the function of RNA regulating or binding proteins. A number of methods for accomplishing this have been developed, including ribosome profiling and polysome analysis. However, both methods carry significant technical challenges and cannot be applied to specific cell populations within a tissue unless combined with additional sorting methods. In contrast, the RiboTag method is a genetic-based, efficient, and technically straightforward alternative that allows the identification of ribosome associated RNAs from specific cell populations without added sorting steps, provided an applicable cell-specific Cre driver is available. This method consists of breeding to generate the genetic models, sample collection, immunoprecipitation, and downstream RNA analyses. Here, we outline this process in adult male mouse germ cells mutant for an RNA binding protein required for male fertility. Special attention is paid to considerations for breeding with a focus on efficient colony management and the generation of correct genetic backgrounds and immunoprecipitation in order to reduce background and optimize output. Discussion of troubleshooting options, additional confirmatory experiments, and potential downstream applications is also included. The presented genetic tools and molecular protocols represent a powerful way to describe the ribosome-associated RNAs of specific cell populations in complex tissues or in systems with aberrant mRNA storage and translation with the goal of informing on the molecular drivers of mutant phenotypes.

Here, we describe the immunoprecipitation of ribosomes and associated RNA from select populations of adult male mouse germ cells using the RiboTag system. Strategic breeding and careful immunoprecipitation result in clean, reproducible results that inform on the germ cell translatome and provide insight into the mechanisms of mutant phenotypes.

RiboTag Immunpräzipitation in den Keimzellen der männlichen Maus

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, ...

Entwicklungsbiologie

iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

The unique composition and spatial arrangement of RNA-binding proteins (RBPs) on a transcript guide the diverse aspects of post-transcriptional regulation1. Therefore, an essential step towards understanding transcript regulation at the molecular level is to gain positional information on the binding sites of RBPs2.
Protein-RNA interactions can be studied using biochemical methods, but these approaches do not address RNA binding in its native cellular context. Initial attempts to study protein-RNA complexes in their cellular environment employed affinity purification or immunoprecipitation combined with differential display or microarray analysis (RIP-CHIP)3-5. These approaches were prone to identifying indirect or non-physiological interactions6. In order to increase the specificity and positional resolution, a strategy referred to as CLIP (UV cross-linking and immunoprecipitation) was introduced7,8. CLIP combines UV cross-linking of proteins and RNA molecules with rigorous purification schemes including denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. In combination with high-throughput sequencing technologies, CLIP has proven as a powerful tool to study protein-RNA interactions on a genome-wide scale (referred to as HITS-CLIP or CLIP-seq)9,10. Recently, PAR-CLIP was introduced that uses photoreactive ribonucleoside analogs for cross-linking11,12.
Despite the high specificity of the obtained data, CLIP experiments often generate cDNA libraries of limited sequence complexity. This is partly due to the restricted amount of co-purified RNA and the two inefficient RNA ligation reactions required for library preparation. In addition, primer extension assays indicated that many cDNAs truncate prematurely at the crosslinked nucleotide13. Such truncated cDNAs are lost during the standard CLIP library preparation protocol. We recently developed iCLIP (individual-nucleotide resolution CLIP), which captures the truncated cDNAs by replacing one of the inefficient intermolecular RNA ligation steps with a more efficient intramolecular cDNA circularization (Figure 1)14. Importantly, sequencing the truncated cDNAs provides insights into the position of the cross-link site at nucleotide resolution. We successfully applied iCLIP to study hnRNP C particle organization on a genome-wide scale and assess its role in splicing regulation14.

The spatial arrangement of RNA-binding proteins on a transcript is a key determinant of post-transcriptional regulation. Therefore, we developed individual-nucleotide resolution UV crosslinking and immunoprecipitation (iCLIP) that allows precise genome-wide mapping of the binding sites of an RNA-binding protein.

iClip - Transkriptom-weiten Mapping von Protein-RNA Wechselwirkungen mit Individual Nucleotide Resolution

The unique composition and spatial arrangement of RNA-binding proteins (RBPs) on a transcript guide the diverse aspects of post-transcriptional ...

Biologie

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

Development of the lower urogenital tract (LUT) is an intricate process. This complexity is evidenced during formation of the prostate from the fetal male urethra, which relies on androgenic signals and epithelial-mesenchymal interactions1,2. Understanding the molecular mechanisms responsible for prostate development may reveal growth mechanisms that are inappropriately reawakened later in life to give rise to prostate diseases such as benign prostatic hyperplasia and prostate cancer.
The developing LUT is anatomically complex. By the time prostatic budding begins on 16.5 days post conception (dpc), numerous cell types are present. Vasculature, nerves and smooth muscle reside within the mesenchymal stroma3. This stroma surrounds a multilayered epithelium and gives rise to the fetal prostate through androgen receptor-dependent paracrine signals4. The identity of the stromal androgen receptor-responsive genes required for prostate development and the mechanism by which prostate ductal epithelium forms in response to these genes is not fully understood. The ability to precisely identify cell types and localize expression of specific factors within them is imperative to further understand prostate development. In situ hybridization (ISH) allows for localization of mRNAs within a tissue. Thus, this method can be used to identify pattern and timing of expression of signaling molecules and their receptors, thereby elucidating potential prostate developmental regulators.
Here, we describe a high throughput ISH technique to identify mRNA expression patterns in the fetal mouse LUT using vibrating microtome-cut sections. This method offers several advantages over other ISH protocols. Performing ISH on thin sections adhered to a slide is technically difficult; cryosections frequently have poor structural quality while both cryosections and paraffin sections often result in weak signal resolution. Performing ISH on whole mount tissues can result in probe trapping. In contrast, our high throughput technique utilizes thick-cut sections that reveal detailed tissue architecture. Modified microfuge tubes allow easy handling of sections during the ISH procedure. A maximum of 4 mRNA transcripts can be screened from a single 17.5dpc LUT with up to 24 mRNA transcripts detected in a single run, thereby reducing cost and maximizing efficiency. This method allows multiple treatment groups to be processed identically and as a single unit, thereby removing any bias for interpreting data. Most pertinently for prostate researchers, this method provides a spatial and temporal location of low and high abundance mRNA transcripts in the fetal mouse urethra that gives rise to the prostate ductal network.

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

Here, we describe an efficient high throughput in situ hybridization (ISH) method for visualizing patterns of mRNA expression in developing fetal mouse prostate tissue sections. The method can be easily adapted to visualize mRNA expression patterns in other mouse tissues or in tissues from other species.

Ein hoher Durchsatz In situ Hybridisierung Methode zur mRNA Expression Patterns in der Fetal-Maus unteren Urogenitaltrakts Charakterisieren

Development of the lower urogenital tract (LUT) is an intricate process. This complexity is evidenced during formation of the prostate from the fetal male ...

Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and readily available form of data collection. In many research and disease models however, steady state levels of target gene mRNA does not always directly correlate with steady state protein levels. Post-transcriptional gene regulation is a likely explanation of the divergence between the two. Driven by the binding of RNA Binding Proteins (RBP), post-transcriptional regulation affects mRNA localization, stability and translation by forming a Ribonucleoprotein (RNP) complex with target mRNAs. Identifying these unknown de novo mRNA targets from cellular extracts in the RNP complex is pivotal to understanding mechanisms and functions of the RBP and their resulting effect on protein output. This protocol outlines a method termed RNP immunoprecipitation-microarray (RIP-Chip), which allows for the identification of specific mRNAs associated in the ribonucleoprotein complex, under changing experimental conditions, along with options to further optimize an experiment for the individual researcher. With this important experimental tool, researchers can explore the intricate mechanisms associated with post-transcriptional gene regulation as well as other ribonucleoprotein interactions.

A step by step protocol to isolating and identifying RNA associated complexes through RIP-Chip.

Verfahren zur Isolierung und Identifizierung von mRNAs, microRNAs und Protein-Komponenten des Ribonucleoprotein Komplexe aus Zellextrakten mit RIP-Chip

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and ...

Simultaneous Mapping and Quantitation of Ribonucleotides in Human Mitochondrial DNA

Established approaches to estimate the number of ribonucleotides present in a genome are limited to the quantitation of incorporated ribonucleotides using short synthetic DNA fragments or plasmids as templates and then extrapolating the results to the whole genome. Alternatively, the number of ribonucleotides present in a genome may be estimated using alkaline gels or Southern blots. More recent in vivo approaches employ Next-generation sequencing allowing genome-wide mapping of ribonucleotides, providing the position and identity of embedded ribonucleotides. However, they do not allow quantitation of the number of ribonucleotides which are incorporated into a genome. Here we describe how to simultaneously map and quantitate the number of ribonucleotides which are incorporated into human mitochondrial DNA in vivo by Next-generation sequencing. We use highly intact DNA and introduce sequence specific double strand breaks by digesting it with an endonuclease, subsequently hydrolyzing incorporated ribonucleotides with alkali. The generated ends are ligated with adapters and these ends are sequenced on a Next-generation sequencing machine. The absolute number of ribonucleotides can be calculated as the number of reads outside the recognition site per average number of reads at the recognition site for the sequence specific endonuclease. This protocol may also be utilized to map and quantitate free nicks in DNA and allows adaption to map other DNA lesions that can be processed to 5&#180;-OH ends or 5&#180;-phosphate ends. Furthermore, this method can be applied to any organism, given that a suitable reference genome is available. This protocol therefore provides an important tool to study DNA replication, 5&#180;-end processing, DNA damage, and DNA repair.

Here we describe a method amenable to simultaneously quantitate and genome-wide map ribonucleotides in highly intact DNA at single-nucleotide resolution, combining enzymatic cleavage of genomic DNA with its alkaline hydrolysis and subsequent 5&#180;-end sequencing.

Gleichzeitige Zuordnung und Quantifizierung der Purine im menschlichen mitochondrialen DNA

Established approaches to estimate the number of ribonucleotides present in a genome are limited to the quantitation of incorporated ribonucleotides using ...

Global Identification of Co-Translational Interaction Networks by Selective Ribosome Profiling

In recent years, it has become evident that ribosomes not only decode our mRNA but also guide the emergence of the polypeptide chain into the crowded cellular environment. Ribosomes provide the platform for spatially and kinetically controlled binding of membrane-targeting factors, modifying enzymes, and folding chaperones. Even the assembly into high-order oligomeric complexes, as well as protein-protein network formation steps, were recently discovered to be coordinated with synthesis.
Here, we describe Selective Ribosome Profiling, a method developed to capture co-translational interactions in vivo. We will detail the various affinity purification steps required for capturing ribosome-nascent-chain complexes together with co-translational interactors, as well as the mRNA extraction, size exclusion, reverse transcription, deep-sequencing, and big-data analysis steps, required to decipher co-translational interactions in near-codon resolution.

Co-translational interactions play a crucial role in nascent-chain modifications, targeting, folding, and assembly pathways. Here, we describe Selective Ribosome Profiling, a method for in vivo, direct analysis of these interactions in the model eukaryote Saccharomyces cerevisiae.

Globale Identifizierung von co-translationalen Interaktionsnetzwerken durch selektives Ribosomenprofiling

In recent years, it has become evident that ribosomes not only decode our mRNA but also guide the emergence of the polypeptide chain into the crowded ...

Eine schnelle High-Throughput-Verfahren zur Abbildung Ribonukleoproteine (RNPs) on Human pre-mRNA

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Neuartige RNA-bindende Proteine Isolation durch die rasche Methodik

Probenvorbereitung für Masse Spektrometrie-basierte Identifikation der RNA-bindende Regionen

Ein Oligonukleotid-basierte Tandem RNA Isolierung Vorgehensweise eukaryotischen mRNA-Protein-komplexe

Erfassung und Identifizierung von RNA-bindende Proteine mit Click-Chemie-gestützte RNA-Interaktom erfassen (CARIC) Strategie

RiboTag Immunpräzipitation in den Keimzellen der männlichen Maus

iClip - Transkriptom-weiten Mapping von Protein-RNA Wechselwirkungen mit Individual Nucleotide Resolution

Ein hoher Durchsatz In situ Hybridisierung Methode zur mRNA Expression Patterns in der Fetal-Maus unteren Urogenitaltrakts Charakterisieren

Verfahren zur Isolierung und Identifizierung von mRNAs, microRNAs und Protein-Komponenten des Ribonucleoprotein Komplexe aus Zellextrakten mit RIP-Chip

Gleichzeitige Zuordnung und Quantifizierung der Purine im menschlichen mitochondrialen DNA

Globale Identifizierung von co-translationalen Interaktionsnetzwerken durch selektives Ribosomenprofiling

Eine schnelle High-Throughput-Verfahren zur Abbildung Ribonukleoproteine ​​(RNPs) on Human pre-mRNA

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