Department of Defense (Idea Award W81XWH-07-0406) - Zum Ulus Atasoy NIH RO1 A1080870 - Um Ulus Atasoy NIH R21 A1079341 - Um Ulus Atasoy University of Missouri Institutional Funds - Um Ulus Atasoy

Versuchsvorbereitung Vor Beginn Experiments ist es kritisch, alle Reagenzien, Behältern und Geräten RNase frei zu haben. Saures Glaswaren mit RNase-Inhibitor (RNaseZAP, Ambion) durch Spülen mit DEPC-behandeltem Wasser. Stellen Sie sicher, dass alle Reagenzien wie RNase free bestätigt werden. Ein. Bereiten mRNP Lysate <ol><li> Züchten und zu ernten exponentiell wachsenden Gewebezellen zwischen 2-5 mg Gesamtprotein für jede RIP erzeugen. <ol class="lalpha"><li> Zwei P150 Kulturschalen sind in der Regel ausreichend. </li><li> Für jede RBP untersucht, müssen zelluläre Gesamt-Anzahl und Proteinmengen optimiert, um entsprechende Ziel-mRNA und RBP Wechselwirkungen zu maximieren. </li><li> RIP für qRT-PCR-Analyse erfordert möglicherweise weniger Zelllysat (ca. 400 pg Gesamtprotein) aufgrund seiner Amplifikation und Detektion Verfahren besonders für hohe Fülle RBPs wie HuR, AUF1, TIAR. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Pellet-Zellen über Zentrifugation bei 200 xg für 8-10 min bei 4 ° C, dann dreimal mit eiskaltem PBS. </li><li> Nach dem letzten Waschen sanft Fingern an die Unterseite des Rohres und resuspendieren Zellpellet in gleichen Volumina von vorbereiteten Polysomen Lysepuffer (PLB) mit RNase und Proteaseinhibitoren. <ol class="lalpha"><li> Es wird empfohlen, zu messen, die genaue Volumen des Zellpellets. </li></ol></li><li> Gently Pipette Mischung (nicht vortexen) auseinander zu brechen Klumpen von Zellen und inkubieren Lysat auf Eis für 5 min. </li><li> Zentrifuge bei 13.000 × g für 20 min bei 4 ° C, um das Lysat von Schutt zu löschen. </li><li> Sofortüberweisung Überstand gelöscht, um vorgekühlten Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Keep on ice und bei -80 ° C. <ol class="lalpha"><li> Sofortige Einfrieren rundet das richtige Lyse der Zellen und verhindert unerwünschte Bindung. Fahren Sie mit dem RIP sofort folgende Beispiel Tauwetter und halten Proben auf Eis RNA-Abbau zu vermeiden. &lt;/ Li&gt; <li> Das Lysat kann gelagert werden bis zu sechs Monaten bei -80 ° C. Vermeiden wiederholten Gefrier-Auftau-Zyklen, wie dies an Protein und / oder mRNA-Abbau führen kann. </li></ol></li><li> Quantifizieren Proteinkonzentration im Lysat unter Verwendung von Standard Bradford Protein Assay. </li></ol> 2. Coat Protein A Sepharose Beads mit Antikörper und Wash <ol><li> Pre-Protein A-Sepharose Dünung (PAS)-Perlen über Nacht in NT2 Puffer (3-4 Volumina) mit 5% BSA. Lagerung bei 4 ° C. <ol class="lalpha"><li> Langzeitlagerung von bis zu mehreren Monaten bei 4 ° C ist möglich, wenn mit 0,1% Natriumazid ergänzt. </li><li> Protein Sepharoseperlen sollte basierend auf Isotyp des Antikörpers RBP Target ausgewählt werden. Proteine ​​A, G und A / G haben alle spezifischen Isotyp Ziele und unterscheiden sich in Ziel-Affinität. Protein A-Sepharose Kügelchen wurden basierend auf Isotyp Spezifität und Affinität für Protein HuR Antikörper verwendet. </li></ol></li><li> Vor Gebrauch entfernen überschüssiges NT2-Puffer, sodass die endgültige Perlen Puffer beträgt 1:1. </li><li> Verwendung von 1,5 ml RNAse-frei Mikrozentrifugenröhrchen, entfernen 100 ul PAS Aufschlämmung und stell 30 ug Antikörper für jede einzelne IP-Reaktion (dh spezifische RBP und Isotyp-Kontrolle). </li><li> Fügen 100-200 ul NT2 Puffer Antikörper Beadgemisch. <ol class="lalpha"><li> Gemisch kann für mehrere Wochen bei 4 ° C gelagert werden, wenn sie mit 0,1% Natriumazid ergänzt. </li><li> Ein Isotyp-passenden Antikörper oder ganzen normalen Seren von derselben Spezies sollten parallel als ein Antikörper gegen Hintergrund Steuerung RNA verwendet werden. </li></ol></li><li> Fügen entsprechenden Antikörper zu Wulst-Mix und über Nacht inkubieren, Tumbling Ende über Ende bei 4 ° C. <ol class="lalpha"><li> Optimieren Antikörpertiter für spezifische Protein untersucht (1, 5, 10 oder 30 ug Antikörper ist normalerweise ausreichend). </li></ol></li><li> Planen Antikörper-beschichteten Kügelchen unmittelbar vor der Verwendung durch Waschen mit 1 mleiskalter NT2-Puffer 5 mal. <ol class="lalpha"><li> Waschen Beadgemisch durch Zentrifugation bei 13.000 × g für 1-2 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die maximale Menge an Überstandes mit Hand Pipette oder Aspirator aber vorsichtig sein, zu verhindern, dass Pellets. </li><li> Waschen hilft bei der Entfernung ungebundenen Antikörper sowie RNase Verunreinigungen von Antikörper-Gemisch. </li></ol></li><li> Nach der letzten Wäsche abgeschlossen wurde, resuspendieren die Perlen in 700 ul eiskaltem NT2 Puffer durch Behandlung mit verschiedenen RNase-Inhibitoren gefolgt, um die Ziel-mRNAs, einschließlich 10 ul RNase Out bei 40 U / ul, 10 ul 100 mM zu schützen DTT und 15 ul EDTA (15 mM). Bringt Volumen 1.000 ul mit NT2 Puffer. <ol class="lalpha"><li> Vanadyl-Ribonucleosid-Komplexe werden nicht verwendet aufgrund Hemmwirkung von EDTA. </li></ol></li></ol> 3. Immunpräzipitation und RNA Niederschlag <ol><li> Optional Preclear Schritt:<ol class="lalpha"><li> In den Hintergrund zu reduzieren, können Perlen und Kontroll-Antikörper vor, klare Lysat verwendet werden. Dies kann die Signal in der Ausgabe. </li><li> Dieser Schritt kann es notwendig sein Hintergrund zu reduzieren, wenn dabei IP mittels Microarray gefolgt. Es ist im Allgemeinen nicht notwendig, IP mittels qRT-PCR gefolgt. </li><li> Preclear mit 15 ug Isotypenkontrolle für 30 min / 4 ° C Taumeln Ende über Ende. </li><li> Fügen Sie 50 ul vorgequollenen PAS Perlen nicht mit Antikörper beschichtet ab Schritt 2,1. </li><li> Inkubieren 30 min / 4 ° C unter Rotation Ende über Ende </li><li> Zentrifugieren bei 10000 × g bei 4 ° C. Speichern Überstand für IP. </li></ol></li><li> Fügen Sie 100 ul der isolierten geklärte Lysat (ca. 2-5 mg) auf vorbereitete Antikörper-Mix. <ol class="lalpha"><li> Verdünnen Lysat wird dazu beitragen, Hintergrund und unspezifische Bindung zu reduzieren. </li><li> Anzahl der Lysat-Eingang kann je nach Nachweismethode und Fülle von RBP or Effizienz der RBP Antikörper, wie in Schritt 1.1.c. beachten </li></ol></li><li> (Optional) sofort mischen Rohr durch leichtes flicking mehrfach durch kurze Zentrifugation bei 10.000 × g bei 4 ° C bis Pellet Perlen und umgehend entfernen 100 ul des Überstandes als Gesamteingangsleistung mRNA Darstellung für qPCR Analyse unter Verwendung von Standard-Techniken RNA-Isolierung. <ol class="lalpha"><li> Dieser Schritt ist zu bestätigen, dass Eingangs-Lysat RNA ist optimal für IP und sollte nur als Prüfschritt oder als Schritt zur Problembehandlung nach RIP mit schlechter RNA Ergebnisse durchgeführt werden. </li></ol></li><li> Wrap Rohr in Parafilm eindeutige Abdichtung und Inkubieren bei 4 ° C für 2 bis 4 Stunden zu gewährleisten, Taumeln Ende über Ende. <ol class="lalpha"><li> Timing der Inkubation sollte basierend auf dem Soll Fülle optimiert werden und sollte minimiert werden, um komplexe Umlagerung oder Zersetzung zu vermeiden. Für einige RBPs kürzere Inkubationen kann mehr optimal. </li></ol></li><li> Pellet Perlen bei 5.000 xgfoder 5 min bei 4 ° C und bis auf Potenzialanalyse Überstand durch Western blot. Shop Aliquots bei -80 ° C. <ol class="lalpha"><li> Aliquote des Überstandes mit hohen Mengen an restlichem Zielprotein kann auf ein Versagen des Proteins durch Sepharosebeads ausgefällt werden. </li></ol></li><li> Wie zuvor beschrieben, zu waschen Perlen 5 mal mit 1 ml eiskaltem NT2 Puffer und Zentrifugation (5.000 × g für 5 min bei 4 ° C) und dann mit der Hand zu entfernen Pipette oder einem Aspirator Überstand. <ol class="lalpha"><li> Strengere Waschverfahren kann verwendet werden, um Hintergrund durch Ergänzung NT2 Puffer mit Natriumdeoxycholat, Harnstoff oder SDS verringern. </li><li> Die Proben auf Eis so viel wie möglich und arbeiten schnell, um den Abbau der Ziel-mRNA zu minimieren. </li></ol></li><li> Optional: Speichern eines kleines Aliquot (10%) der Beadgemisch oder führen eine zusätzliche Probe parallel zur Kontrolle der Effizienz von IP Zielprotein mittels Western Blot-Analyse.</li></ol> 4. DNase und Proteinase K Behandlungen <ol><li> Nach dem Waschen resuspendieren Perlen mit 100 ul NT2-Puffer mit 5 ul RNase-freie DNase 1 (2 U / ul) ergänzt. </li><li> Halten bei 37 ° C für 5-10 min. 1 ml NT2 Puffer und Zentrifuge bei 5.000 xg für 1 min bei Raumtemperatur. <ol class="lalpha"><li> Eine kleine (~ 10%) Aliquot von Perlen verwendet werden, um die IP-Effizienz durch SDS-PAGE-Analyse zu überprüfen. </li></ol></li><li> Resuspendieren PAS Pellet in 100 ul NT2-Puffer, 5 ul Proteinase K (10 mg / ml) und 1 ul 10% SDS. </li><li> Inkubieren der resuspendierten Kügelchen Mischung für 30 min bei 55 ° C in einem Wasserbad leicht auf jeder flicking 10 min. <ol class="lalpha"><li> Proteinase K wird in der Veröffentlichung der RNP-Komponenten unterstützen. </li></ol></li><li> Pellet Perlen bei 5.000 xg für 5 min bei Raumtemperatur (RT) und den Überstand (~ 100 ul). </li><li> Fügen Sie 200 ul NT2 Puffer Perlen, Zentrifugenfuge 5.000 xg für 2 min bei RT, sammeln Überstand (~ 200 ul) und discard Perlen. </li><li> Kombinieren Überstände (100 ul und 200 ul) und 300 ul untere Schicht der Säure Phenol-CHCl 3. </li><li> Vortex, 1 min RT (oder 37 ° C im Shaker) und Zentrifuge bei 16.000 xg bei RT für 1 min. </li><li> Sammeln Sie 250 ul der oberen Schicht (nicht stören Schnittstelle), fügen Sie 25 ul Natriumacetat bei pH 5,2, 625 ul 100% EtOH und 5 ul glycoblue und gut mischen. </li><li> Bewahren Sie über Nacht bei -20 ° C. <ol class="lalpha"><li> Um eine einwandfreie Rückgewinnung der RNA zu gewährleisten, wird die Zugabe von glycoblue die Sichtbarkeit des RNA-Pellet, indem sie als Träger-Molekül zu erhöhen. </li></ol></li><li> Am folgenden Tag Spin Mischung Rohre durch Inversion 3-5 mal, bei 12.000 × g bei 4 ° C für 30 min und der Überstand verworfen. </li><li> 1 ml 70% EtOH auf die blaue Pellet und mischen durch Umdrehen oder Vortexen. </li><li> Zentrifuge 12.000 × g bei 4 ° C für 2 min. </li><li> Discard Überstand abzentrifugieren und 12.000 × g für 1 Minute bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Sie alle verbleibenden 70% EtOH mit einer Pipette und an der Luft trocknen Pellet bei RT für 5 min. </li><li> Resuspendieren in 20-40 ul RNase / DNase-freiem Wasser oder einem anderen geeigneten Volumen benötigt. <ol class="lalpha"><li> Probe ist nun bereit für weitere Downstream-Anwendungen wie qRT-PCR oder Microarray. </li><li> Nanodrop Spektrophotometrie kann bei der Beurteilung Probenkonzentration verwendet werden, jedoch mit wertvollen Proben kann es von Vorteil sein, nanodropping Proben zu vermeiden, da es sein kann, verschwenderisch und relativ ungenau. Wir schlagen vor, die Normalisierung Proben Housekeeping-Gen-Transkripte auf Reinheit und IP Effizienz für Edelsteine ​​oder geringe Ausbeute Proben zu beurteilen. </li></ol></li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Wenn das Verfahren optimiert und richtig ausgeführt, sollte der Immunpräzipitation ergeben signifikante Anreicherung von mRNA Ziele. Typisch, Abhängig von der RBP und seine mRNA Target (s), so sehen wir die Anreicherung von etwa 10 - bis 50-fache, wenn sie durch qRT-PCR untersucht. Viele Ziele RBPs kann en masse entdeckt werden mittels Microarray-Analyse. Jedoch ist dieses Verfahren anfällig für Degradation wie bei qRT-PCR verglichen. Abhängig von der RBP, die Anzahl von Zielen und den Wirkungsgrad der Reaktion kann Mikroarray offenbaren hunderte neuer Targets, oder es kann nur ein paar zu entdecken, wenn überhaupt. Beispielsweise einer der besseren dadurch RNA-Bindeproteinen HuR, post-transkriptionell reguliert die Expression und Translation von Genen viele wichtige physiologische 1, 2. Isolierung des HuR-ribonucleo-Komplexes mittels RIP-Chip in Brustkrebs-Zelllinien, beispielsweise offenbart Anreicherung von mehreren wichtigen bekannten HuR Ziele, einschließlich β-Actin-PCR unter Verwendung qRT wie in Abbildung 1 gezeigt. In beiden Krebszelllinien β-Aktin 12 angereichert - bis 15-fache. Normalerweise, wenn richtig durchgeführt sehen wir eine deutliche enrichment von β-Aktin in einer Vielzahl von Zelllinien. Allerdings, wenn die RIP nicht verraten keinen wesentlichen Bereicherung für β-Aktin deutet auf ein Problem mit dem RIP und das Verfahren kann wiederholt werden muss. Außerdem ergab Mikroarray-Analyse von immunpräzipitierten Proben aus diesen Zellinien deutliche Expression Teilmengen HuR Targets in verschiedenen Östrogenrezeptor (ER) positiven MCF-7 Krebszellen gegenüber ER negativen MB-231 Brustkrebs-Zelllinien, wie in 2 gezeigt, ein. Diese Ziele lassen sich in mehrere Kategorien: bekannte und unbekannte HuR Ziele, die entweder verbunden waren oder nicht im Zusammenhang mit Krebs. Zum Beispiel sind sowohl CALM2 und CD9 Krebsgene die nicht zuvor als HuR Targets identifiziert. Verwendung des Mikroarrays und Bestätigung mit qRT-PCR, CALM2 und CD9 erwiesen sich 5 - bis 180-fache in HuR Pellet angereichert, die eine Wechselwirkung zwischen dem prominenten HuR Protein und dieser Zielgene. <img src = &quot;/ files/ftp_upload/3851/3851fig1.jpg&quot; alt = &quot;Abbildung 1&quot; /&gt; Abbildung 1. Immunpräzipitation und RIP in MB-231 (ER-) und MCF-7 (ER +) Brustkrebszellen. Immunpräzipitationen wurden von MB-231 oder MCF-7 Zelllysaten unter Verwendung von Anti-HuR monoklonalen Antikörper (3A2) und IgG1 Isotyp-Kontrolle. A. IP Western of HuR zeigte erwartete Größe band von 3A2 erkannt. Panel auf der rechten Seite zeigt Mengen von HuR im Eingang Lysate aus beiden Zelllinien verwendet, mit β-Tubulin als Ladekontrolle. B. Überprüfung durch quantitative RT-PCR zeigte fünfzehn und elf-fache Anreicherung von β-Aktin, ein bekannter HuR Ziel, in den 3A2 IPs von MB-231 und MCF-7, bzw.. Alle ΔΔCT Werte wurden auf GAPDH normalisiert. Experimente wurden in doppelter Ausführung (n = 2) erfolgt. <img src="/files/ftp_upload/3851/3851fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. HuR RIP-CHIP identifiziert verschiedene genetische Profile in ER + und ER-Brustkrebszellen.HuR Immunpräzipitationen wurden von MB-231 MCF-7 oder Zelllysaten unter Verwendung HuR Antikörper und IgG1 Isotyp-Kontrolle hybridisiert Illumina Sentrix Arrays (47.000 Gene) durchgeführt. Steuersignale wurden abgezogen. Die Ergebnisse stellen die kumulativen Daten aus 12 verschiedenen Arrays. Experimente wurden in dreifacher Ausführung (n = 3) für jede Zelllinie mit passenden Kontrollen durchgeführt. Waagen sind log2.

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	<li>Calaluce, R., Gubin, M. M., Davis, J. W., Magee, J. D., Chen, J., Kuwano, Y., Gorospe, M., Atasoy, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+binding+protein+HuR+differentially+regulates+unique+subsets+of+mRNAs+in+estrogen+receptor+negative+and+estrogen+receptor+positive+breast+cancer.">The RNA binding protein HuR differentially regulates unique subsets of mRNAs in estrogen receptor negative and estrogen receptor positive breast cancer.</a> BMC Cancer. 10, 126-140 (2010).</li><li>Gubin, M. M., Calaluce, R., Davis, J. W., Magee, J. D., Strouse, C. S., Shaw, D. P., Ma, L., Brown, A., Hoffman, T., Rold, T. L., Ulus Atasoy, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+RNA+binding+protein+HuR+impairs+tumor+growth+in+triple+negative+breast+cancer+associated+with+deficient+angiogenesis.">Overexpression of the RNA binding protein HuR impairs tumor growth in triple negative breast cancer associated with deficient angiogenesis.</a> Cell Cycle. 9, 3337-3346 (2010).</li><li>Keene, J. D., Komisarow, J. M., Friedersdorf, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIP-Chip:+the+isolation+and+identification+of+mRNAs,+microRNAs+and+protein+components+of+ribonucleoprotein+complexes+from+cell+extracts.">RIP-Chip: the isolation and identification of mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts.</a> Nature Protocols. 1, 302-307 (2006).</li><li>Tenenbaum, S. A., Lager, P. J., Carson, C. C., Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonomics:+identifying+mRNA+subsets+in+mRNP+complexes+using+antibodies+to+RNA-binding+proteins+and+genomic+arrays.">Ribonomics: identifying mRNA subsets in mRNP complexes using antibodies to RNA-binding proteins and genomic arrays.</a> Methods. 26, 191-198 (2002).</li><li>Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Atasoy, U., Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+regulatory+analysis+using+en+masse+nuclear+run-ons+and+ribonomic+profiling+with+autoimmune+sera.">Genome-wide regulatory analysis using en masse nuclear run-ons and ribonomic profiling with autoimmune sera.</a> Gene. 317, 79-87 (2003).</li><li>Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Lager, P. J., Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+mRNA+subsets+in+messenger+ribonucleoprotein+complexes+by+using+cDNA+arrays.">Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 14085-14090 (2000).</li><li>Baroni, T. E., Chittur, S. V., George, A. D., Tennebaum, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+RIP-Chip+Analysis.">Advances in RIP-Chip Analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 419, 93-108 (2008).</li><li>de Silanes Lopez, I., Zhan, M., Lal, A., Yang, X., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+target+RNA+motif+for+RNA-binding+protein+HuR.">Identification of a target RNA motif for RNA-binding protein HuR.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 2987-2992 (2004).</li><li>de Silanes Lopez, I., Lal, A., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HuR:+post-transcriptional+paths+to+malignancy.">HuR: post-transcriptional paths to malignancy.</a> RNA Biol. 2, 11-13 (2005).</li><li>Grigull, J., Mnaimneh, S., Pootoolal, J., Robinson, M. D., Hughes, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+mRNA+stability+using+transcription+inhibitors+and+microarrays+reveals+posttranscriptional+control+of+ribosome+biogenesis+factors.">Genome-wide analysis of mRNA stability using transcription inhibitors and microarrays reveals posttranscriptional control of ribosome biogenesis factors.</a> Mol. Cell Biol. 24, 5534-5547 (2004).</li><li>Hieronymus, H., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+RNA-protein+interactions+illustrates+specificity+of+the+mRNA+export+machinery.">Genome-wide analysis of RNA-protein interactions illustrates specificity of the mRNA export machinery.</a> Nat. Genet. 33, 155-161 (2003).</li><li>Hieronymus, H., Yu, M. C., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mRNA+surveillance+is+coupled+to+mRNA+export.">Genome-wide mRNA surveillance is coupled to mRNA export.</a> Genes Dev. 18, 2652-2662 (2004).</li><li>Mukherjee, N., Corcoran, D. L., Nusbaum, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+Regulatory+Mapping+Indicates+that+the+RNA-Binding+Protein+HuR+Couples+Pre-mRNA+Processing+and+mRNA+Stability.">Integrative Regulatory Mapping Indicates that the RNA-Binding Protein HuR Couples Pre-mRNA Processing and mRNA Stability.</a> Molecular Cell. 43, 1-13 (2011).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Aufgrund der Natur dieses Experiments, Optimierung und Erfahrung wird die einzigen Möglichkeiten, um erfolgreich gewährleistet beschaffen die beabsichtigten Ergebnisse sein. In vielen Schritte dieses Verfahrens sind die Temperatur und effiziente Handhabung der Reagenzien und Produkte von entscheidender Bedeutung. Die richtige Planung und Ausführung der Technik wird dazu beitragen, sicherzustellen, dass das Experiment innerhalb eines angemessenen Zeitrahmens an den optimalen Temperaturen empfohlen wurde durchgeführt. Ein Hauptproblem mit RNA Isolation Experimenten ist die Empfindlichkeit von RNAs den Abbau durch RNasen. Alle Reagenzien müssen RNase frei und gelagert oder verwendet in RNase-freiem Container sein. Dies ist ein entscheidender Schritt bei der Sicherstellung der Integrität Ihrer mRNA Probe. Selbst wenn das Experiment korrekt durchgeführt wird, kann jedoch das gewünschte Ergebnis nicht durch die Art der Wechselwirkung zwischen dem RBP und seiner Ziel-mRNAs erreicht werden. Ein potentielles Problem wird mit einer geringen oder gar kein Signal von der RNA durch die RIP-Chip isoliert.Obwohl es Signals von Gesamt-RNA sein kann, kann dies das Ergebnis einer unzureichenden Bindungsprotein ist heruntergezogen werden, die Perlen sein. Der erste Schritt bei der Fehlerbehebung ist zu bestätigen, dass die zelluläre Lysat verwendet adäquaten Ausdruck der spezifischen RBP hat. Nach Bestätigung kann Protein nach der endgültigen NT2 Waschen isoliert werden gewaschen und in Laemmli-Puffer oder einer anderen geeigneten denaturierenden Puffer und erhitzt bei 95 ° C für 5 min. Western-Blot-Analyse kann an diesen Proben in Koordination mit Eingangs Lysat sowie negative Kontrollen verwendet werden, um eine ausreichende Pulldown von assoziierten Protein. Darüber hinaus, weil Lysieren der Zelle ist erforderlich, um diese Komponenten zugreifen zu können, kann das Potential für abnorme und unerwünschte Wechselwirkungen zwischen normalerweise getrennten Proteine ​​und mRNA eingeführt werden. Diese Interaktionen könnten binden und &quot;tanken&quot; Ihre Ziel-mRNAs oder Proteine ​​durch unspezifische Wechselwirkungen. Zusätzlich Proteine ​​in diesen unterschiedlichen conditions kann in mehreren Varianten falten und ihre Bindungsmotive kann nicht zugegriffen werden, um ihre Ziel-mRNAs, die Verhinderung ihrer Wechselwirkungen. Beide stärken die Bedeutung der Zusammenarbeit effizient als auch die Nutzung der optimalen Temperaturen aufgeführt, um diese unerwünschte Wechselwirkungen zu begrenzen. Darüber hinaus wird die Optimierung der Waschbedingungen für jeden spezifischen Zielproteins kritisch sein, um die Reinheit der Wechselwirkung maximieren. Mehr stringenten Waschbedingungen erforderlich sein. Zum Beispiel kann der Waschpuffer mit SDS oder einer entsprechenden Menge an Harnstoff um unspezifische Wechselwirkungen und Hintergrund im Signalausgang reduzieren ergänzt werden. Dies wird völlig abhängig von der angestrebten Experimentator RBP sowie die Ziel-mRNA in ihrer einzigartigen physiologischen Bedingungen. Einige Bedingungen nicht geeignet sein für bestimmte mRNA-Analyse-Tools, die zur Vorbereitung von Proben von Bedeutung. Schließlich, obwohl RIP ist bei der Anreicherung von RNA erfolgreiche-RBP Interaktionen, ein gut bekanntes Problem mit RIP (CHIP)-Methode ist die Unfähigkeit, die spezifischen bindenden Domänen des RBP auf die vorübergehende mRNA Targets zu identifizieren. Mehrere Vernetzung Techniken können durch RIP einzigartige Sequenz Ziele zu isolieren verwendet befolgt werden, allerdings neigt die Verwendung von kurzwelligem UV-auf Nukleinsäure-Schäden führen. Ein neues Verfahren PAR-CLIP oder photoaktivierbaren Ribonukleosid Vernetzen und immuoprecipitation bekannt beschäftigt langwelligen UV bis in Thiouridin naszierende RNA, die eine Identifizierung der eindeutigen Bindungsstellen von sowohl stabil als auch transient RNA-Wechselwirkungen zu integrieren. Insgesamt hat RIP-Chip als hervorragendes Werkzeug zur Isolierung und Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen RNA-bindende Proteine ​​und ihre mRNA Zielsetzungen unserer Gruppe sowie viele andere Forschergruppen etabliert. Obwohl sensible Natur und Praxis wird ordnungsgemäße Durchführung dieses Verfahrens ergeben die Isolierung dieser RNP-Komplexe, die bis vor kurzem INACC habenessible für die Entdeckung und Analyse.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td> Catalog Number </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> 1 M Dithiothreit </td><td> Fischer </td><td> BP172-5 </td><td> DTT </td></tr><tr><td> DNase 1 </td><td> Ambion </td><td> 2235 </td><td> RNase-frei </td></tr><tr><td> Ethylendiamin Tetraccetic Säure </td><td> Fischer </td><td> BP118-500 </td><td> EDTA </td></tr><tr><td> Glykogen </td><td> Ambion </td><td> 9516 </td><td></td></tr><tr><td> 1 HEPES </td><td> Sigma </td><td> H3375-100G </td><td> pH 7,0 </td></tr><tr><td> Igepal Nonidet P-40 </td><td> USB </td><td> 78641 </td><td> NP40 </td></tr><tr><td> 1 M KCl </td><td> Fischer </td><td> BP366-500 </td><td></td></tr><tr><td> 1 M MgCl 2 </td><td> Fischer </td><td> BP214-500 </td><td></td></tr><tr><td> NT2 Buffer </td><td> * Unten finden </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Polysom ​​Lysis Buffer </td><td> * Unten finden </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Proteaseinhibitor-Cocktail-Tabletten </td><td> Roche </td><td> 11873580001 </td><td></td></tr><tr><td> Protein A-Sepharose Kügelchen </td><td> Sigma </td><td> P3391 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> Fischer </td><td> BP1700-100 </td><td></td></tr><tr><td> RNase Out RNase Inhibitor </td><td> Invitrogen </td><td> 10777-019 </td><td> 40 U / ul </td></tr><tr><td> 1 M NaCl </td><td> Fischer </td><td> BP358-212 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumdodecylsulfat </td><td> Fischer </td><td> BP166-500 </td><td> SDS </td></tr><tr><td> 1 M Tris-HCl </td><td> Fischer </td><td&gt; BP153-500 </td><td> pH 7,4 </td></tr><tr><td> Trizol </td><td> Invitrogen </td><td> 15596-026 </td><td></td></tr><tr><td> Vanadyl-Ribonucleosid-Komplexe </td><td> New England Labs </td><td> S1402S </td><td> VRC </td></tr></tbody></table> <table border="1"><tbody><tr><td> Reagent Aufarbeitung </td></tr><tr><td> Planen Reagenzien in RNase / DNase-frei, DEPC behandeltem Glaswaren </td></tr><tr><td> Polysomen Lysepuffer </td></tr><tr><td> 100 mM KCl </td></tr><tr><td> 5 mM MgCl 2 </td></tr><tr><td> 10 mM HEPES (pH 7,0) </td></tr><tr><td> 0,5% NP40 </td></tr><tr><td> 1 mM DTT </td></tr><tr><td> 100 Einheiten / ml RNase Out </td></tr><tr><td> 400 uM VRC </td></tr><tr><td> Protease-Inhibitor-Cocktail Tablette </td></tr><tr><td> 5 ml Lysepuffer Polysomen </td></tr><tr><td> Fügen Sie 50 ul 1 M HEPES (pH 7,0) </td></tr><tr><td> 500 ul 1 M KCL </td></tr><tr><td> 25 ul 1 M MgCl 2 </td></tr><tr><td> 25 ul NP40 </td></tr><tr><td> 4,7 ml RNase-DNase-freie H 2 O </td></tr><tr><td> 50 ul 1 M DTT </td></tr><tr><td> 12,5 ul 100 U / ml RNase Out </td></tr><tr><td> 200 ul Protease-Inhibitor-Cocktail (gelöst laut Hersteller) </td></tr><tr><td> 10 ul 200 mM VRC (zum Zeitpunkt der Verwendung) </td></tr><tr><td> NT2 Buffer </td></tr><tr><td> 50 mM Tris-HCl (pH 7,4) </td></tr><tr><td> 150 mM NaCl </td></tr><tr><td> 1 mM MgCl 2 </td></tr><tr><td> 0,05% NP40 </td></tr><tr><td> 1 l Puffer NT2 </td></tr><tr><td> 50 ml Tris (pH 7,4) </td></tr><tr><td> 30 ml 5 M NaCl </td></tr><tr><td> 1 ml 1 M MgCl <sub&gt; 2 </td></tr><tr><td> 500 ul NP40 </td></tr><tr><td> 820 ml RNase-DNase-freie H 2 O </td></tr></tbody></table>

method for the isolation and identification of mrnas, micrornas and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts using rip-chip

Als Folge der Entwicklung von High-Throughput-Sequenzierung und effiziente Mikroarray-Analyse hat die globale Genexpressionsanalyse sich eine einfache und leicht zugängliche Form der Datenerfassung. In vielen Forschungs-und Krankheitsmodelle jedoch nicht steady state Ebenen der Zielgen-mRNA nicht immer direkt mit steady state Protein-Spiegel korrelieren. Post-transkriptionelle Genregulation ist eine wahrscheinliche Erklärung für die Diskrepanz zwischen den beiden. Angetrieben durch die Bindung von RNA-bindende Proteine ​​(RBP), wirkt posttranskriptionale Regulierung mRNA Lokalisierung, Stabilität und Translation durch Bilden einer Ribonucleoprotein (RNP)-Komplex mit Ziel-mRNAs. Identifizierung dieser unbekannten de novo mRNA Targets aus Zellextrakten in der RNP-Komplex schwenkbar ist, um das Verständnis Mechanismen und Funktionen des RBP und deren resultierende Wirkung auf die Protein-Ausgang. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren genannt RNP Immunpräzipitations-Mikroarray (RIP-Chip), die für die Identifizierung von s ermöglichtpezifische mRNAs in der Ribonukleoproteinkomplex verbunden sind, unter wechselnden experimentellen Bedingungen, zusammen mit Optionen weiter zu optimieren, um ein Experiment für den einzelnen Forscher. Mit diesem wichtigen experimentelles Werkzeug, können die Forscher erkunden die komplizierten Mechanismen mit post-transkriptionellen Genregulation sowie andere ribonucleoprotein Wechselwirkungen verbunden.

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Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

Eine Schritt für Schritt-Protokoll zur Isolierung und Identifizierung von RNA assoziiert Komplexe durch RIP-Chip.

Verfahren zur Isolierung und Identifizierung von mRNAs, microRNAs und Protein-Komponenten des Ribonucleoprotein Komplexe aus Zellextrakten mit RIP-Chip

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and ...

method-for-isolation-identification-mrnas-micrornas-protein

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

27.5K Aufrufe.  University of Missouri. Eine Schritt für Schritt-Protokoll zur Isolierung und Identifizierung von RNA assoziiert Komplexe durch RIP-Chip.

Serie: Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. They are composed of position-dependent, cis-acting RNA elements and unique combinations of RNA binding proteins. Defining the composition of a specific RNP is essential to achieving a fundamental understanding of gene regulation. The isolation of a select RNP is akin to finding a needle in a haystack. Here, we demonstrate an approach to isolate RNPs associated at the 5' untranslated region of a select mRNA in asynchronous, transfected cells. This cognate RNP has been demonstrated to be necessary for the translation of select viruses and cellular stress-response genes.
The demonstrated RNA-protein co-precipitation protocol is suitable for the downstream analysis of protein components through proteomic analyses, immunoblots, or suitable biochemical identification assays. This experimental protocol demonstrates that DHX9/RNA helicase A is enriched at the 5' terminus of cognate retroviral RNA and provides preliminary information for the identification of its association with cell stress-associated huR and junD cognate mRNAs.

This manuscript describes an approach to isolate select cognate RNPs formed in eukaryotic cells via a specific oligonucleotide-directed enrichment. We demonstrate the applicability of this approach by isolating a cognate RNP bound to the retroviral 5' untranslated region that is composed of DHX9/RNA helicase A.

Isolierung von Cognate RNA-Protein-Komplexe von Zellen unter Verwendung von Oligonukleotid-gerichtete Elution

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

Forschung

Biochemie

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

Neuartige RNA-bindende Proteine ​​Isolation durch die rasche Methodik

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

Genetik

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most cases, the action of noncoding RNAs is mediated by proteins whose functions are in turn regulated by these interactions with noncoding RNAs. Consistent with this, a growing number of proteins involved in nuclear functions have been reported to bind RNA and in a few cases the RNA-binding regions of these proteins have been mapped, often through laborious, candidate-based methods.
Here, we report a detailed protocol to perform a high-throughput, proteome-wide unbiased identification of RNA-binding proteins and their RNA-binding regions. The methodology relies on the incorporation of a photoreactive uridine analog in the cellular RNA, followed by UV-mediated protein-RNA crosslinking, and mass spectrometry analyses to reveal RNA-crosslinked peptides within the proteome. Although we describe the procedure for mouse embryonic stem cells, the protocol should be easily adapted to a variety of cultured cells.

We describe a protocol to identify RNA-binding proteins and map their RNA-binding regions in live cells using UV-mediated photocrosslinking and mass spectrometry.

Probenvorbereitung für Masse Spektrometrie-basierte Identifikation der RNA-bindende Regionen

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Chip-based Three-dimensional Cell Culture in Perfused Micro-bioreactors

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from non-biodegradable polymers, e.g., polycarbonate or polymethyl methacrylate by micro injection molding, micro hot embossing or micro thermoforming. But, it can also be manufactured from bio-degradable polymers. Its overall dimensions are 0.7 1 x 20 x 20 x 0.7 1 mm (h x w x l). The main features of the chips used are either a grid of up to 1156 cubic micro-containers (cf-chip) each the size of 120-300 x 300 x 300 &mu; (h x w x l) or round recesses with diameters of 300 &mu; and a depth of 300 &mu; (r-chip). The scaffold can house 10 Mio. cells in a three-dimensional configuration. For an optimal nutrient and gas supply, the chip is inserted in a bioreactor housing. The bioreactor is part of a closed steril circulation loop that, in the simplest configuration, is additionaly comprised of a roller pump and a medium reservoir with a gas supply. The bioreactor can be run in perfusion, superfusion, or even a mixed operation mode. We have successfully cultivated cell lines as well as primary cells over periods of several weeks. For rat primary liver cells we could show a preservation of organotypic functions for more than 2 weeks. For hepatocellular carcinoma cell lines we could show the induction of liver specific genes not or only slightly expressed in standard monolayer culture. The system might also be useful as a stem cell cultivation system since first differentiation experiments with stem cell lines were promising.

We describe a chip-based platform for the three-dimensional cultivation of cells in micro-bioreactors. One chip can house up to 10 Mio. cells that can be cultivated under precisely defined conditions with regard to fluid flow, oxygen tension etc. in a sterile, closed circulation loop.

Chip-basierte dreidimensionale Zellkultur in perfundierten Micro-Bioreaktoren

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from ...

Biologie

An Oligonucleotide-based Tandem RNA Isolation Procedure to Recover Eukaryotic mRNA-Protein Complexes

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein complexes is essential to understanding mRNA regulation inferred by interacting proteins or non-coding RNAs. Herein, we describe a tandem RNA isolation procedure (TRIP) that enables the purification of endogenously formed mRNA-protein complexes from cellular extracts. The two-step protocol involves the isolation of polyadenylated mRNAs with antisense oligo(dT) beads and subsequent capture of an mRNA of interest with 3&#39;-biotinylated 2&#39;-O-methylated antisense RNA oligonucleotides, which can then be isolated with streptavidin beads. TRIP was used to recover in vivo crosslinked mRNA-ribonucleoprotein (mRNP) complexes from yeast, nematodes and human cells for further RNA and protein analysis. Thus, TRIP is a versatile approach that can be adapted to all types of polyadenylated RNAs across organisms to study the dynamic re-arrangement of mRNPs imposed by intracellular or environmental cues.

A tandem RNA isolation procedure (TRIP) for recovery of endogenously formed mRNA-protein complexes is described. Specifically, RNA-protein complexes are crosslinked in vivo, polyadenylated RNAs are isolated from extracts with oligo(dT) beads, and particular mRNAs are captured with modified RNA antisense oligonucleotides. Proteins bound to mRNAs are detected by immunoblot analysis.

Ein Oligonukleotid-basierte Tandem RNA Isolierung Vorgehensweise eukaryotischen mRNA-Protein-komplexe

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used strategy for RBP capture exploits the polyadenylation [poly(A)] of target RNAs, which mostly occurs on eukaryotic mature mRNAs, leaving most binding proteins of non-poly(A) RNAs unidentified. Here we describe the detailed procedures of a recently reported method termed click chemistry-assisted RNA-interactome capture (CARIC), which enables the transcriptome-wide capture of both poly(A) and non-poly(A) RBPs by combining the metabolic labeling of RNAs, in vivo UV cross-linking, and bioorthogonal tagging.

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

A detailed protocol for applying the click chemistry-assisted RNA-interactome capture (CARIC) strategy to identify proteins binding to both coding and noncoding RNAs is presented.

Erfassung und Identifizierung von RNA-bindende Proteine mit Click-Chemie-gestützte RNA-Interaktom erfassen (CARIC) Strategie

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in disease states and provide therapeutic targets and biomarkers. Here, we detail how to accurately quantify microRNAs. Briefly, this method describes isolating microRNAs, ligating them to adaptors suitable for high-throughput sequencing, amplifying the final products, and preparing a sample library. Then, we explain how to align the obtained sequencing reads to microRNA hairpins, and quantify, normalize, and calculate their differential expression. Versatile and robust, this combined experimental workflow and bioinformatic analysis enables users to begin with tissue extraction and finish with microRNA quantification.

Here, we describe a step-by-step strategy for isolating small RNAs, enriching for microRNAs, and preparing samples for high-throughput sequencing. We then describe how to process sequence reads and align them to microRNAs, using open source tools.

Eine vollständige Pipeline zum Isolieren und Sequenzieren von MicroRNAs und deren Analyse mithilfe von Open Source Tools

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT employs two purification steps. First, immunoprecipitation of a tagged RNP subunit is followed by mild RNase digestion and subsequent non-denaturing affinity elution. A second immunoprecipitation of another RNP subunit allows for enrichment of a defined complex. Following a denaturing elution of RNAs and proteins, the RNA footprints are converted into high-throughput DNA sequencing libraries. Unlike the more popular ultraviolet (UV) crosslinking followed by immunoprecipitation (CLIP) approach to enrich RBP binding sites, RIPiT is UV-crosslinking independent. Hence RIPiT can be applied to numerous proteins present in the RNA interactome and beyond that are essential to RNA regulation but do not directly contact the RNA or UV-crosslink poorly to RNA. The two purification steps in RIPiT provide an additional advantage of identifying binding sites where a protein of interest acts in partnership with another cofactor. The double purification strategy also serves to enhance signal by limiting background. Here, we provide a step-wise procedure to perform RIPiT and to generate high-throughput sequencing libraries from isolated RNA footprints. We also outline RIPiT&#39;s advantages and applications and discuss some of its limitations.

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

Here, we present a protocol to enrich endogenous RNA binding sites or &#34;footprints&#34;&#160;of RNA:protein (RNP) complexes from mammalian cells. This approach involves two immunoprecipitations of RNP subunits and is therefore dubbed RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT).

Identifizierung von Fußabdrücken von RNA:Protein-Komplexe über RNA-Immunpräzipitation im Tandem gefolgt von Sequenzierung (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

Eine schnelle High-Throughput-Verfahren zur Abbildung Ribonukleoproteine ​​(RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

RiboTag Immunoprecipitation in the Germ Cells of the Male Mouse

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, characterizing differences in the translatome (the whole of translated mRNAs) provides an additional layer of information particularly useful when trying to understand the function of RNA regulating or binding proteins. A number of methods for accomplishing this have been developed, including ribosome profiling and polysome analysis. However, both methods carry significant technical challenges and cannot be applied to specific cell populations within a tissue unless combined with additional sorting methods. In contrast, the RiboTag method is a genetic-based, efficient, and technically straightforward alternative that allows the identification of ribosome associated RNAs from specific cell populations without added sorting steps, provided an applicable cell-specific Cre driver is available. This method consists of breeding to generate the genetic models, sample collection, immunoprecipitation, and downstream RNA analyses. Here, we outline this process in adult male mouse germ cells mutant for an RNA binding protein required for male fertility. Special attention is paid to considerations for breeding with a focus on efficient colony management and the generation of correct genetic backgrounds and immunoprecipitation in order to reduce background and optimize output. Discussion of troubleshooting options, additional confirmatory experiments, and potential downstream applications is also included. The presented genetic tools and molecular protocols represent a powerful way to describe the ribosome-associated RNAs of specific cell populations in complex tissues or in systems with aberrant mRNA storage and translation with the goal of informing on the molecular drivers of mutant phenotypes.

Here, we describe the immunoprecipitation of ribosomes and associated RNA from select populations of adult male mouse germ cells using the RiboTag system. Strategic breeding and careful immunoprecipitation result in clean, reproducible results that inform on the germ cell translatome and provide insight into the mechanisms of mutant phenotypes.

Verfahren zur Isolierung und Identifizierung von mRNAs, microRNAs und Protein-Komponenten des Ribonucleoprotein Komplexe aus Zellextrakten mit RIP-Chip

Zusammenfassung

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Isolierung von Cognate RNA-Protein-Komplexe von Zellen unter Verwendung von Oligonukleotid-gerichtete Elution

Neuartige RNA-bindende Proteine Isolation durch die rasche Methodik

Probenvorbereitung für Masse Spektrometrie-basierte Identifikation der RNA-bindende Regionen

Chip-basierte dreidimensionale Zellkultur in perfundierten Micro-Bioreaktoren

Ein Oligonukleotid-basierte Tandem RNA Isolierung Vorgehensweise eukaryotischen mRNA-Protein-komplexe

Erfassung und Identifizierung von RNA-bindende Proteine mit Click-Chemie-gestützte RNA-Interaktom erfassen (CARIC) Strategie

Eine vollständige Pipeline zum Isolieren und Sequenzieren von MicroRNAs und deren Analyse mithilfe von Open Source Tools

Identifizierung von Fußabdrücken von RNA:Protein-Komplexe über RNA-Immunpräzipitation im Tandem gefolgt von Sequenzierung (RIPiT-Seq)

Eine schnelle High-Throughput-Verfahren zur Abbildung Ribonukleoproteine (RNPs) on Human pre-mRNA

RiboTag Immunpräzipitation in den Keimzellen der männlichen Maus

Verfahren zur Isolierung und Identifizierung von mRNAs, microRNAs und Protein-Komponenten des Ribonucleoprotein Komplexe aus Zellextrakten mit RIP-Chip

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Isolierung von Cognate RNA-Protein-Komplexe von Zellen unter Verwendung von Oligonukleotid-gerichtete Elution

Neuartige RNA-bindende Proteine ​​Isolation durch die rasche Methodik

Probenvorbereitung für Masse Spektrometrie-basierte Identifikation der RNA-bindende Regionen

Chip-basierte dreidimensionale Zellkultur in perfundierten Micro-Bioreaktoren

Ein Oligonukleotid-basierte Tandem RNA Isolierung Vorgehensweise eukaryotischen mRNA-Protein-komplexe

Erfassung und Identifizierung von RNA-bindende Proteine mit Click-Chemie-gestützte RNA-Interaktom erfassen (CARIC) Strategie

Eine vollständige Pipeline zum Isolieren und Sequenzieren von MicroRNAs und deren Analyse mithilfe von Open Source Tools

Identifizierung von Fußabdrücken von RNA:Protein-Komplexe über RNA-Immunpräzipitation im Tandem gefolgt von Sequenzierung (RIPiT-Seq)

Eine schnelle High-Throughput-Verfahren zur Abbildung Ribonukleoproteine ​​(RNPs) on Human pre-mRNA

RiboTag Immunpräzipitation in den Keimzellen der männlichen Maus

Neuartige RNA-bindende Proteine Isolation durch die rasche Methodik

Eine schnelle High-Throughput-Verfahren zur Abbildung Ribonukleoproteine (RNPs) on Human pre-mRNA