Havuz tasarımı ve oligo kurtarma <ol><li> Incelenmesi gereken ilk adım, pre-mRNA havuzu tasarımı. Bu UCSC Genom Tarayıcı kullanarak ve belirli genler, ek kavşaklar, ya da diğer ilgi alanları indirme yapılabilir. </li><li> Ilgi pencereler seçildikten sonra, onlar karşısında kiremit hesaplama aşağıdaki koşullar kullanılarak okuma süresini, bu nedenle her oligo önceki 20 nükleotidler kaydırılır bir 10 nükleotid örtüşme, 30 nükleotid olmalıdır. * Oligo örtüşme yeterli kapsama sağlamak için ek sitelerine yakınlığı artan olmalıdır; 10 20 nükleotidler örtüşme artırarak bunu başarabilirsiniz. </li><li> Havuz downstream yükseltmek için kullanılan olacak evrensel astar dizileri, her biri 30 nükleotid oligo Kanat. Agilent, dizileri, özel bir oligonükleotid mikroarray basılacaktır Çinili oligo siparişleri teslim edilmelidir. </li><li> Mikroarray yüzeyinden DNA oligos kurtarmak için bir dizi hibridizasyon odasında dizi kapak slayt slayt üzerine yerleştirerek ve hafifçe 500 mcL dH 2 O pipetleme başlamak </li><li> Sandwich kapağını kaydırarak üstüne dizi, süreci bozabilir hava kabarcıklarını önlemek için özen. Oligos ile yan su yüzeyine dokunarak böylece dizi yüz aşağı yere emin olun. Başparmak bir kural dizisi üzerinde Agilent etiket kapak slayt Agilent etiketi karşı karşıya olduğu &quot;Agilent dokunur Agilent&quot; anlamına </li><li> Hibridizasyon odasına kapatın ve bir melezleşme fırında 99 ° C&#39;de gece boyunca döndürmek. </li><li> Ertesi gün, dikkatle odasından dizi kaldırmak ve oligos dizi yüzey kurtuldu içeren su, çekmek. Bu oligo havuzu </li><li> Havuz için 1.5 ml Eppendorf tüp 3-5 ikinci bakliyat yerleştirin ve% 50 genlik havuzu sonikasyon </li><li> Sonra, sonuna T7 etiketiyle evrensel primerler kullanılarak, düşük devir PCR ile havuz yükseltmek. Için ilk turda 94, doğasını ° C 1 dakika 20 saniye boyunca 55 ° C&#39;de tavlama ve 72 az 1 dakika için uzatıyoruz ° C. Bir sonraki tur için, 10 saniye, 20 saniye ve 10 saniye 72 az 5 dakika nihai bir uzama adım ° C ile ilgili her sıcaklıkta Havuz yükseltmek için gerekli döngülerinin sayısını oligo kurtarma etkinliğini bağlı olduğundan, birden fazla döngüsü numaraları denemek için gerekli olabilir. Bulaşmış bir akrilamid jel üzerinde bir grup tarafından anlamına havuzu, aşırı yükseltmek için dikkatli olun. PCR amplifiye örnekleri gerekli ° C ye kadar 4 saklanabilir. </li><li> Oligo hazırlanmasında son adım Ambion MEGAshortscript ™ kiti kullanılarak RNA yazıya. * Aşağıdaki protokol Ambion adapte edilmiştir <ol class="lalpha"><li> Oda sıcaklığında T7 10x Reaksiyon Tamponu, dört ribonukleotid çözümler su ve buz üzerinde T7 Enzim Mix tutarken çözülme </li><li> Reaksiyon karışımı oda sıcaklığında bir RNaz ücretsiz mikrosantrifüj tüp birleştirin. Reaksiyon tamponu Bileşenleri tepki buz üzerinde işlendiği takdirde DNA çökelmesine neden olabilir. </li><li> Aşağıdaki sırayla, pipet 3 mcL nükleaz içermeyen su, 10x reaksiyon tamponu 2 mcL, her 75 mM NTP çözüm 2 mcL, 5 mcL (PCR amplifiye oligo havuzu) DNA ve 2 T7 enzim mcL 20 mcL son hacim </li><li> Tüp, ardından kısa bir süre tüpün alt karışımı toplamak için mikrofuge&#39;de reaksiyon karışımı hafifçe vurun. </li><li> Bir PCR reaksiyonu 37 ° C&#39;de 2 saat süreyle inkübe edin. İnkübasyon süresi şablon bağımlı olacaktır, bu nedenle, maksimum verim için en uygun inkübasyon süresi belirlemek için bir süre ders deney kullanmak için gerekli olabilir </li><li> 2 saat sonra, ek bir 15 dakika için 37 reaksiyon ve inkübe Turbo DNaz 1 mcL ekleyerek ° C DNA kaldırmak </li><li> Reaksiyon feshedebilir ve RNA, fenol / kloroform ekstraksiyon ve etanol yağış kurtarmak. <ol class="lalpha"><li> 20 mcL reaksiyon hacmi için 115 dH 2 O mcL ve reaksiyon 3 M sodyum asetat 15 mcL ekleyin. </li><li> Asidik fenol ve kloroform 75 mcL 75 mcL ekleyin sonra iyice karıştırın. 13.000 rpm hızında oda sıcaklığında bir dakika sonra mikrofuge&#39;de, vorteks çözüm karıştırın. Yeni bir tüp sulu tabaka transferi ve çıkarma tekrarlayın </li><li> Yeni bir tüp sulu tabaka transferi ve kloroform 150 mcL ekleyin. Vorteks, daha önce olduğu gibi karışım ve santrifüj. Yeni bir tüp sulu aktarın. </li></ol></li><li> % 100 soğuk etanol iki cilt sulu katman ekleme ve iyi karıştırma RNA kurtarın. -20, 15 dakika en az karışımı soğutun ° C daha sonra 4 santrifüj ° C maksimum hızda 15 dakika boyunca pelet RNA. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve 0.1x Tris-EDTA (TE) Tampon 105 mcL pelet tekrar süspansiyon haline getirin .. </li></ol></li><li> Bu, tüm serbest nükleotidler T7 Kit tepki kaldırmak için en doğru sonuçları, RiboGreen kullanarak RNA miktarını zordur. <ol class="lalpha"><li> Kantitatif başlamak için, ilk 2.300 mcL + 50μL/sample yeterli 1x TE sulandırmak. </li><li> Sonra, RiboGreen olun. 1000 gerekecektir mcL + 50 mcL / örnek. Yüksek oranda örnekleri (1 mcg / ml ile 20 ng / ml), 1x TE RiboGreen 1:200 karışımı, düşük aralık örnekleri için (50 ng / ml &#39;ye 1 ng / ml), 1x TE RiboGreen 1:2000 karışımı ; Pipet opak bir plaka her kuyuya RiboGreen çözüm 50 mcL, A1 ile başlayan ve aşağı hareket değil, karşısında </li><li> 2 yüksek oranda numune veya 100 ng / mcL düşük aralık örnekleri için mikrogram / ml RNA stok çözeltinin </li><li> Orijinal 2 mcg / ml veya 100 ng / ml stok altı sonraki 01:02 dilüsyonları stok çözümlerini kullanarak, standart bir eğri oluşturmak; PCR şerit tüpe stokunun Pipet 240 mcL. Kalan 7 tüpleri, pipet 1x TE 120 mcL. RNA stok 120 mcL alın ve tüp 2 ile karıştırın. Tüp 2 120 mcL alın ve tüp 3 ile karıştırın. Tüp 7 kadar tekrarlayın. Tube 8 sadece TE olacak ve boş olacaktır. Opak levha, A1, standart eğri çözümler Pipet 50 mcL: H2 (eğri iki kez çalıştırmak) </li><li> Yeni bir tüp, oligo havuzu 5 mcL TE 45 mcL karıştırın ve 50 mcL RiboGreen, içerir iyi 50 mcL ekleyin. </li><li> Bir plaka okuyucu kullanarak bir dalgaboyu 485 nm ve 530 nm emisyon dalga boyu ile bir dakika karıştırın, sonra üst floresan okumak ve plaka okuma için makineyi </li><li> -20 ° C&#39;de muhafaza edilmelidir kurtarılan RNA ölçmek için oluşturulan standart eğrisi, kullanın </li></ol></li></ol> Bir ilgi RNP oligo havuzu Co-immunoprecipitation <ol><li> Co-immunoprecipitation başlamadan önce protein, A ve G Dynabeads Invitrogen gelen protein reaksiyon başına 50 mcL son hacmi 1:1 oranında karıştırılarak hazırlar. Örneğin, iki reaksiyon için 50 mcL her boncuk her eklersiniz. </li><li> Süpernatantı eşit hacimli soğuk 1x PBS ile iki kez kaldırmak ve boncuklar yıkayın boncuk yerde tutmak için Novagen bu gibi bir Manyetik Ayırma Stand kullanın </li><li> İkinci yıkamadan sonra, soğuk 1x PBS eşit hacimde boncuklar tekrar süspansiyon haline getirin ve 2 ng başına antikor reaksiyonu ekleyin. Bu miktar antikor bağlı olarak değişebilir, deneme optimal koşullarda bulmak için gerekli. </li><li> 4 antikor / boncuk karışımı bir gecede inkübe dönen bir platform üzerinde ° C </li><li> Sabah, non-spesifik bağlama engellemek için sonicated maya toplam RNA reaksiyon başına 2 mg ve 4 ek bir 30 dakika çevirin ° C </li><li> Boncuk tutmak için manyetik raf kullanarak, tüp içinde ikinci yıkama PBS bırakarak, soğuk 1x PBS ile iki kez süpernatant kaldırmak ve boncuk yıkayın. </li><li> Yeni tüpler, her bir tüpe her reaksiyon ve boncuk karışımı kısım 50 mcL çıkartın. Bir ana karışımı hazırlarken boncuk oturup </li><li> Her reaksiyon hacmi 120 getirmek için 200 ng oligo havuzu, koruma primerlerin ekimolar oranı, 2 mg sonicated maya toplam RNA, 20 mcL HeLa nükleer ekstresi (bu RNP kaynak) ve tampon E eklemek mcL. Koruma astarlar evrensel primerler RNA sürümleri. Sipariş transkripsiyon sonuna T7 etiketiyle evrensel primerler şablonları, daha sonra MEGAshortscript ™ Kit kullanarak şablonlar RNA yazıya. </li><li> Ana karışımı 120 mcL ve tekrar süspansiyon boncuk boncuk alikotları süpernatantı. 4 ° C&#39;de 1-2 saat süreyle Rock reaksiyonlar. </li><li> Inkübasyondan sonra, her bir reaksiyon için, bir &quot;toplam&quot; RNA örnek için küçük bir kısım (boncuklar dahil) kaldırmak </li><li> Manyetik ayırma stand reaksiyonlar kalan koyun ve süpernatantı kaldırmak. Örnek downstream üzerinden akış, bu analiz için gerekli olmamasına rağmen, bunu kaydetmek için yararlı olabilir. </li><li> Soğuk 1x PBS 50 mcL boncuklar 1-2 kez yıkayın. Boncuk üzerinde antikor bağlı RNA &quot;IP&quot; örnek. </li><li> 0.1x TE tampon% 1 SDS 50 mcL &quot;toplam&quot; ve &quot;IP&quot; boncuk süspanse edin ve 65 ° C&#39;de 15 dakika süreyle RNA Zehir örnekleri ısı. </li><li> Şimdi daha önce boncuk bağlı ve fenol / kloroform ekstraksiyon etanol yağış takip, temiz RNA içerir süpernatantı çıkarın. Kuru pelet ve 50 mcL 0.1x TE tampon tekrar süspansiyon haline getirin. </li></ol> Ters transkripsiyon ve co-IP örnekleri amplifikasyon aminoallyl etiketleme için hazırlık <ol><li> Sonra, RNA örnekleri ters transkripsiyonu ve PCR amplifiye olmalıdır. Ters transkripsiyon reaksiyonu için, ters evrensel primerler kullanın. </li><li> Her örnek için, 1 mcL karıştırma başlar1 mcL şablonu RNA ters evrensel astar (immunoprecipitation tepki) ve dH 2 O 10 mcL Reaksiyonlar 70 ° C 5 dakika buz üzerinde soğutun ya da 4 tutmak ° C&#39;ye ısıtın. </li><li> Örnekleri serin olsa da, şu ana karışımı olun. Her reaksiyon için 10 mM dNTP 4 mcL, 2 mcL 10x Arrayscript tampon, 1 mcL RNaz inhibitörü, 1 mcL ters transkripsiyon enzim birleştirir. İyice karıştırın ve her ters transkripsiyon reaksiyonu ana karışımı 8 mcL ekleyin. </li><li> 95 numuneler 42 ° C&#39;de 2 saat süreyle inkübe ° C, daha sonra 5 dakika boyunca 4 ° C örnekleri amplifikasyon için gerekli olan kadar. PCR makinesi kullanın. </li><li> RNA örnekleri ters transkripsiyon sonra, PCR, bir T7 etiketi içeren primerler biri ile evrensel primerler kullanarak onları yükseltmek. Birden fazla döngüleri denemek için gerekli olabilir, böylece havuz yükseltmek için gerekli sayısı döngüleri ortak IP verimliliğine bağlı olacaktır. Her reaksiyon 10x Taq reaksiyon tamponu, her astar (100 mM), cDNA şablon 1 mcL (ters transkripsiyon reaksiyonu), 10 mM dNTP 1 mcL dH 2 O 42.2 mcL 0.2 mcL 5 mcL gerektirir ve Taq enziminin 0.4 mcL. PCR örnekleri, 3 dakika boyunca 94 ° C&#39;de inkübe başlayın. Sonra, her döngüsü, 94 doğasını ° C 45 saniye, 30 saniye boyunca ° C 55 tavlama ve 72 ° C&#39;de 10 dakika için son bir uzama, bir dakika için 72 ° C&#39;de uzatıyoruz. </li><li> Sonra, MEGAshortscript ™ Kit kullanarak tekrar örnekleri yazıya, ancak, bu kez 2 aminoallyl UTP mcL eklemek yerine, T7 UTP. Aminoallyl UTP Cy boyalar ile RNA etiketlemek için kullanılır. </li><li> Fenol / kloroform ve etanol örnekleri hızlandırabilir. Glycoblue veya amonyum asetat kullanmayın, her ikisi de dizi örnekleri melezleşmesi engel olabilir. 4.5, 0.1 M sodyum karbonat mcL pelet ve tekrar süspansiyon kurulayın. </li></ol> Amino-Cy Boyalar RNA alil etiketleme <ol><li> Etiketleme protokol DMSO 45 mcL, floresan boya, cy3 ve Cy5 her çözülür başlamak için. Işık önlemek için, karanlıkta, alüminyum folyo ve -20 ° C&#39;de deposunda tüpler sarın </li><li> Örnekleri RNA 2.5 nükleaz içermeyen su mcL ekleyin ve iyice karıştırın </li><li> Sonra, &quot;IP&quot; örnek &quot;toplam&quot; örnek Cy3 3 mcL ve Cy5 3 mcL ekleyin. Örnekleri oda sıcaklığında 1 saat süreyle karanlıkta inkübe, Cy-5 maviye dönecek iken Cy-3 örnek, kırmızı ya da pembe dönecek. </li><li> Reaksiyonu sonlandırmak için, her numune 6 uL 4 M hidroksilamin-HCl ekleyin, iyice karıştırın ve kısaca döndürün. Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. </li><li> 0.1x TE 50 mcL etanol yağış ve tekrar süspansiyon pelet takip fenol / kloroform ekstraksiyon etiketli örnekleri arındırın </li></ol> Agilent Dizi Hibridizasyon Kiti kullanarak mikroarray örnekleri melezleşme <ol><li> 10x engelleme tampon, 140 mcL mcL nükleaz içermeyen H2 O Cy3 etiketli &quot;toplam&quot; havuz, Cy5 etiketli &quot;IP&quot; havuz 25 mcL 25 mcL, 10, 50 mcL yavaşça karıştırarak hibridizasyon başlayın 25x parçalanma tampon ve 2x hibridizasyon tamponu 250 mcL, kabarcıklar tanıtan önlemek için özen gösterin. Kısaca, tüp altında çözüm toplamak ve kabarcıkları azaltmak için de örnek mikrofuge&#39;de. </li><li> Hibridizasyon odasında o-ring kapağını kaydırarak yerleştirin ve dikkatli bir slayt üzerine çözüm pipetle. </li><li> Algılama dizisi &quot;sandviç&quot; çözüm kapağını kaydırarak üstüne yerleştirin. Dizi Agilent etiket kapak slayt Agilent etiketi bakacak şekilde yönlendirmek dizi slayt unutmayın. </li><li> Kelepçe hibridizasyon odasında slayt / dizi sandviç ve 50 ° C&#39;de 3 saat boyunca döndürün. </li><li> Dizi dönen iken, 50-ml konik tüpler aşağıdaki 50 ml çözüm: Bir konik dH 2 O, ayrı bir tüp içinde iki 1x SCC tampon çözeltiler, her, bir 2x SCC tampon 50 ml ile dolu. </li><li> Üç saatlik inkübasyondan sonra, dikkatli bir dizi / slayt sandviç çözülme ve 2x SCC tampon içeren 50 ml konik yerleştirin. Bir cımbız kullanarak, yavaşça kapağını kaydırarak dizinin ayrı ve kapağını kaydırarak dışarı doğru çekin. Slayt çekilir gibi dizi temas için dikkatli olun. Konik kapatın ve 60 saniye boyunca yavaşça ters çevirin. </li><li> Cımbız kullanarak, 1x SCC çözümü için dizi transferi, tüp kap ve hafifçe dizinin ikinci 1x SCC çözüm transferi ve 1 dakika sonra tekrar yavaşça bir dakika için ters ters. </li><li> Son olarak, dH 2 O tüp dizi transferi ve 30 saniye boyunca yavaşça ters çevirin. </li><li> Dizideki bir Kimwipe slayt kenarları koyarak kurulayın. Devam dizi döndürmek için oligos içeren yan bozmayacak emin olun silin. </li><li> Kuru dizi yerleştirin.Mikroarray tarayıcı ile boş bir 50 mL konik tüpü ve tarama </li></ol> Mikroarray yorumlama <ol><li> Mikroarray tarayıcı dizi TIF görüntü yaratacaktır. Agilent Feature Extraction yazılımı aracılığıyla bu görüntüyü kullanarak, özel havuzu benzersiz ızgara dosya (Agilent tarafından sağlanan) çalıştırın. </li><li> Agilent yazılımı bir Perl betiği ile ayrıştırılır bir dosya oluşturmak için her özellik sinyal yorumlayabilir. Her özellik sinyali o kanalda toplam yoğunluğu normale. Yeşil kanal belirli bir özelliği Örneğin, bireysel özellik için yeşil kanal yoğunluğu tüm özellikleri üzerinde yeşil kanal toplam yoğunluğu ile ayrılır. Nihai çıkış dizinin her özelliği yeşil kanal üzerinden kırmızı kanalın günlük oranıdır. </li><li> Mikroarray oligo havuzu veri bir resim elde etmek için genomuna yeniden eşlenir ve ne kadar güçlü, ilgi RNP bağlı olabilir. </li></ol> Şekil 1. Deneysel şematik <img src="/files/ftp_upload/1622/1622fig1a.jpg" alt="Şekil 1a" /> A. şeması Fayansları. Seçme ve pre-mRNA dizileri faiz indirirken sonra, seçerek alan 10 nükleotid artışlarla vardiya 30 nükleotid pencereler ile döşenir. Evrensel astar bağlayıcı siteleri kanadını pencerenin her iki tarafında. <img src="/files/ftp_upload/1622/1622fig1b.jpg" alt="Şekil 1b" /> B. Sentez dizi. Agilent, dizileri, özel bir oligonükleotid mikroarray basılacaktır Çinili oligo siparişleri teslim edilmelidir. <img src="/files/ftp_upload/1622/1622fig1c.jpg" alt="Şekil 1c" /> C. Co immunoprecipitation. Dizi kapalı oligos kaynatıldıktan sonra, HeLa nükleer özü de inkübe, daha sonra ilgi RNP karşı bir antikor ile hazırlanmış manyetik boncuk özü ekleyin. Cy3 ile başlayan oligo havuzu ve Cy5 bağlı IP havuzu Etiket ve algılama dizi ve tarama için geçerlidir. Şekil 2. Annotating genomu ve zenginleştirme veri analizi. <img src="/files/ftp_upload/1622/1622fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> A. Convert ortalama dizi veri tabanı on günlüğüne skoru her genomik koordinat ve harita verilen koordinatları puan. Bu ortalama adım 3 ile ortalama zenginleştirme skoru 10-nt her pencere için yukarıdaki grafikler halinde puanları 2, 4 ve 0.5, 30-nt oligos örtüşen bir örnek verilir. Seçilen genomik bölgelerde Deneylerde Genom Tarayıcı Özel bir Track kullanılarak görüntülendi. Verilen örnekte bir tarayıcı penceresi clta gen, gen özellikleri (ekzon / intron / alternatif ekleme vb), koyu kırmızı dikey çubuklar tarafından temsil PTB bağlı oligos alt ve günlük ortalama zenginleştirme puanları boyunca verilmiştir. PTB güçlü polypyrimidine yolu sadece upstream ekzon 2 bağlar.

RNA veya protein düzeyi ya havuz bu yaratılış hatırlamak için bu yordamı bu çok önemli yaparken esnek ve modifikasyon açık. RNA düzeyinde orthologous bölgelerde, hastalık mutasyonlar, polimorfizmleri, ya da rastgele mutasyonların oligonükleotid dizisi içine sokulabilir. RNA bağlayıcı faktör protein düzeyinde fosforilasyon veya diğer post translasyonel modifikasyonlar tarafından değiştirilebilir. Ayrıca, bağlayıcı bir ortamda ya ek faktörlerin etkileşim veya ilgi RNA bağlayıcı protein i...

a rapid high-throughput method for mapping ribonucleoproteins (rnps) on human pre-mrna

RNA&#39;lar Sıralama RNA bağlayıcı proteinler ile birlikte immunoprecipitate (co-IP), bu bağlayıcı konuma göstererek ekleme anlayışımız artan sıklıkla bir ekleme faktörü fonksiyonu etkiler. Ancak, herhangi bir örnekleme stratejisi ile bir ekleme faktörüne bağlı bir RNA belirleme şansı hücresel bolluk orantılıdır. Biz aksi takdirde geçici pre-mRNA bağlayıcı özgüllüğü araştırmak için bir roman in vitro yaklaşım geliştirdik. Bu yaklaşım, özel olarak tasarlanmış bir oligonükleotid havuzu kullanan intronlar, ekzon, ek kavşaklar, veya diğer pre-mRNA boyunca fayans. Havuz, bir tür moleküler seçim tabi tutulur. Burada, ilişkili ve ilişkisiz bir bölümünü içine oligonükleotid ayırarak yöntem göstermek ve bağlı fraksiyon her oligonükleotid zenginleştirme kaydetmek için bir iki renk dizisi stratejisi kullanacaklardır. Dizi veri dizisi özel ve yapısal pre-mRNA bağlayıcı ribonükleoprotein (RNP) determinates tanımlamak için yeteneği ile yüksek çözünürlüklü haritalar üretir. Bu yöntem için eşsiz bir avantajı havuz özellikle pre-mRNA dizisi tasarlanmış ve sentezlenmiş olarak, mevcut IP ve SELEX teknikleri ile ilgili mRNA doğru örnekleme yanlılığı önlemek için yeteneğidir. Deneyci, havuzu kendi ihtiyaçlarına uyarlayarak çapında çalışma ve kiremit hangi bölgeleri seçer oligonükleotid havuzu esneklik başka bir avantajdır. Bu tekniği kullanarak, bir tahlil büyük bir ölçekte bağlayıcı veya fonksiyonel bir ekleme muhabiri kütüphane klon ve fraksiyonunda zenginleştirilmiş olduğunu oligonükleotidler tespit polimorfizmleri veya mutasyonların etkileri. In vitro yüksek çözünürlüklü eşleştirme düzenini Bu roman düşük bolluk in vivo teknikler mevcut çalışma zorlaştırır geçici pre-mRNA türleri, RNP etkileşimleri çalışmak için benzersiz bir şekilde sağlar.

Watch this Scientific Journal Video about A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA at JoVE.com

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Pre-mRNA geçici doğası nedeniyle, izole etmek ve incelemek için zor olabilir<em&gt; In vivo</em&gt;. Burada, bir roman mevcut<em&gt; In vitro</em&gt; Yaklaşım, sentetik bir oligo havuzu kullanarak RNA-protein etkileşimleri araştırmak için pre-mRNA seçilen bölgelerde fayans.

İnsan pre-mRNA üzerinde Haritalama Ribonucleoproteins Hızlı Yüksek verim için Yöntemi (RNPs)

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

a-rapid-high-throughput-method-for-mapping-ribonucleoproteins-rnps-on

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

11.7K Görüntüleme.  Brown University. Pre-mRNA geçici doğası nedeniyle, izole etmek ve incelemek için zor olabilir In vivo. Burada, bir roman mevcut In vitro Yaklaşım, sentetik bir oligo havuzu kullanarak RNA-protein etkileşimleri araştırmak için pre-mRNA seçilen bölgelerde fayans.

Video: A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

Rapid Metodoloji tarafından Roman RNA Bağlayıcı Proteinler İzolasyon

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

Genetik

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most cases, the action of noncoding RNAs is mediated by proteins whose functions are in turn regulated by these interactions with noncoding RNAs. Consistent with this, a growing number of proteins involved in nuclear functions have been reported to bind RNA and in a few cases the RNA-binding regions of these proteins have been mapped, often through laborious, candidate-based methods.
Here, we report a detailed protocol to perform a high-throughput, proteome-wide unbiased identification of RNA-binding proteins and their RNA-binding regions. The methodology relies on the incorporation of a photoreactive uridine analog in the cellular RNA, followed by UV-mediated protein-RNA crosslinking, and mass spectrometry analyses to reveal RNA-crosslinked peptides within the proteome. Although we describe the procedure for mouse embryonic stem cells, the protocol should be easily adapted to a variety of cultured cells.

We describe a protocol to identify RNA-binding proteins and map their RNA-binding regions in live cells using UV-mediated photocrosslinking and mass spectrometry.

Kütle spektrometresi tabanlı kimlik RNA-bağlama bölgelerinin için numune hazırlama

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Biyokimya

An Oligonucleotide-based Tandem RNA Isolation Procedure to Recover Eukaryotic mRNA-Protein Complexes

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein complexes is essential to understanding mRNA regulation inferred by interacting proteins or non-coding RNAs. Herein, we describe a tandem RNA isolation procedure (TRIP) that enables the purification of endogenously formed mRNA-protein complexes from cellular extracts. The two-step protocol involves the isolation of polyadenylated mRNAs with antisense oligo(dT) beads and subsequent capture of an mRNA of interest with 3&#39;-biotinylated 2&#39;-O-methylated antisense RNA oligonucleotides, which can then be isolated with streptavidin beads. TRIP was used to recover in vivo crosslinked mRNA-ribonucleoprotein (mRNP) complexes from yeast, nematodes and human cells for further RNA and protein analysis. Thus, TRIP is a versatile approach that can be adapted to all types of polyadenylated RNAs across organisms to study the dynamic re-arrangement of mRNPs imposed by intracellular or environmental cues.

A tandem RNA isolation procedure (TRIP) for recovery of endogenously formed mRNA-protein complexes is described. Specifically, RNA-protein complexes are crosslinked in vivo, polyadenylated RNAs are isolated from extracts with oligo(dT) beads, and particular mRNAs are captured with modified RNA antisense oligonucleotides. Proteins bound to mRNAs are detected by immunoblot analysis.

Ökaryotik mRNA-Protein kompleksleri kurtarmak için bir Tandem oligonükleotid tabanlı RNA izolasyon yordamı

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used strategy for RBP capture exploits the polyadenylation [poly(A)] of target RNAs, which mostly occurs on eukaryotic mature mRNAs, leaving most binding proteins of non-poly(A) RNAs unidentified. Here we describe the detailed procedures of a recently reported method termed click chemistry-assisted RNA-interactome capture (CARIC), which enables the transcriptome-wide capture of both poly(A) and non-poly(A) RBPs by combining the metabolic labeling of RNAs, in vivo UV cross-linking, and bioorthogonal tagging.

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

A detailed protocol for applying the click chemistry-assisted RNA-interactome capture (CARIC) strategy to identify proteins binding to both coding and noncoding RNAs is presented.

Yakalama ve tıklama Kimya destekli RNA-interactome kullanarak RNA bağlanıcı proteinler tanımlaması (CARIC) strateji yakalama

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

RiboTag Immunoprecipitation in the Germ Cells of the Male Mouse

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, characterizing differences in the translatome (the whole of translated mRNAs) provides an additional layer of information particularly useful when trying to understand the function of RNA regulating or binding proteins. A number of methods for accomplishing this have been developed, including ribosome profiling and polysome analysis. However, both methods carry significant technical challenges and cannot be applied to specific cell populations within a tissue unless combined with additional sorting methods. In contrast, the RiboTag method is a genetic-based, efficient, and technically straightforward alternative that allows the identification of ribosome associated RNAs from specific cell populations without added sorting steps, provided an applicable cell-specific Cre driver is available. This method consists of breeding to generate the genetic models, sample collection, immunoprecipitation, and downstream RNA analyses. Here, we outline this process in adult male mouse germ cells mutant for an RNA binding protein required for male fertility. Special attention is paid to considerations for breeding with a focus on efficient colony management and the generation of correct genetic backgrounds and immunoprecipitation in order to reduce background and optimize output. Discussion of troubleshooting options, additional confirmatory experiments, and potential downstream applications is also included. The presented genetic tools and molecular protocols represent a powerful way to describe the ribosome-associated RNAs of specific cell populations in complex tissues or in systems with aberrant mRNA storage and translation with the goal of informing on the molecular drivers of mutant phenotypes.

Here, we describe the immunoprecipitation of ribosomes and associated RNA from select populations of adult male mouse germ cells using the RiboTag system. Strategic breeding and careful immunoprecipitation result in clean, reproducible results that inform on the germ cell translatome and provide insight into the mechanisms of mutant phenotypes.

Erkek Farenin Germ Hücrelerinde RiboTag İmmünanyağış

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, ...

Gelişim Biyolojisi

iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

The unique composition and spatial arrangement of RNA-binding proteins (RBPs) on a transcript guide the diverse aspects of post-transcriptional regulation1. Therefore, an essential step towards understanding transcript regulation at the molecular level is to gain positional information on the binding sites of RBPs2.
Protein-RNA interactions can be studied using biochemical methods, but these approaches do not address RNA binding in its native cellular context. Initial attempts to study protein-RNA complexes in their cellular environment employed affinity purification or immunoprecipitation combined with differential display or microarray analysis (RIP-CHIP)3-5. These approaches were prone to identifying indirect or non-physiological interactions6. In order to increase the specificity and positional resolution, a strategy referred to as CLIP (UV cross-linking and immunoprecipitation) was introduced7,8. CLIP combines UV cross-linking of proteins and RNA molecules with rigorous purification schemes including denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. In combination with high-throughput sequencing technologies, CLIP has proven as a powerful tool to study protein-RNA interactions on a genome-wide scale (referred to as HITS-CLIP or CLIP-seq)9,10. Recently, PAR-CLIP was introduced that uses photoreactive ribonucleoside analogs for cross-linking11,12.
Despite the high specificity of the obtained data, CLIP experiments often generate cDNA libraries of limited sequence complexity. This is partly due to the restricted amount of co-purified RNA and the two inefficient RNA ligation reactions required for library preparation. In addition, primer extension assays indicated that many cDNAs truncate prematurely at the crosslinked nucleotide13. Such truncated cDNAs are lost during the standard CLIP library preparation protocol. We recently developed iCLIP (individual-nucleotide resolution CLIP), which captures the truncated cDNAs by replacing one of the inefficient intermolecular RNA ligation steps with a more efficient intramolecular cDNA circularization (Figure 1)14. Importantly, sequencing the truncated cDNAs provides insights into the position of the cross-link site at nucleotide resolution. We successfully applied iCLIP to study hnRNP C particle organization on a genome-wide scale and assess its role in splicing regulation14.

The spatial arrangement of RNA-binding proteins on a transcript is a key determinant of post-transcriptional regulation. Therefore, we developed individual-nucleotide resolution UV crosslinking and immunoprecipitation (iCLIP) that allows precise genome-wide mapping of the binding sites of an RNA-binding protein.

iCLIP - Bireysel Nükleotid Çözünürlük protein-RNA Etkileşimleri Transcriptome geniş Haritalama

The unique composition and spatial arrangement of RNA-binding proteins (RBPs) on a transcript guide the diverse aspects of post-transcriptional ...

Biyoloji

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

Development of the lower urogenital tract (LUT) is an intricate process. This complexity is evidenced during formation of the prostate from the fetal male urethra, which relies on androgenic signals and epithelial-mesenchymal interactions1,2. Understanding the molecular mechanisms responsible for prostate development may reveal growth mechanisms that are inappropriately reawakened later in life to give rise to prostate diseases such as benign prostatic hyperplasia and prostate cancer.
The developing LUT is anatomically complex. By the time prostatic budding begins on 16.5 days post conception (dpc), numerous cell types are present. Vasculature, nerves and smooth muscle reside within the mesenchymal stroma3. This stroma surrounds a multilayered epithelium and gives rise to the fetal prostate through androgen receptor-dependent paracrine signals4. The identity of the stromal androgen receptor-responsive genes required for prostate development and the mechanism by which prostate ductal epithelium forms in response to these genes is not fully understood. The ability to precisely identify cell types and localize expression of specific factors within them is imperative to further understand prostate development. In situ hybridization (ISH) allows for localization of mRNAs within a tissue. Thus, this method can be used to identify pattern and timing of expression of signaling molecules and their receptors, thereby elucidating potential prostate developmental regulators.
Here, we describe a high throughput ISH technique to identify mRNA expression patterns in the fetal mouse LUT using vibrating microtome-cut sections. This method offers several advantages over other ISH protocols. Performing ISH on thin sections adhered to a slide is technically difficult; cryosections frequently have poor structural quality while both cryosections and paraffin sections often result in weak signal resolution. Performing ISH on whole mount tissues can result in probe trapping. In contrast, our high throughput technique utilizes thick-cut sections that reveal detailed tissue architecture. Modified microfuge tubes allow easy handling of sections during the ISH procedure. A maximum of 4 mRNA transcripts can be screened from a single 17.5dpc LUT with up to 24 mRNA transcripts detected in a single run, thereby reducing cost and maximizing efficiency. This method allows multiple treatment groups to be processed identically and as a single unit, thereby removing any bias for interpreting data. Most pertinently for prostate researchers, this method provides a spatial and temporal location of low and high abundance mRNA transcripts in the fetal mouse urethra that gives rise to the prostate ductal network.

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

Here, we describe an efficient high throughput in situ hybridization (ISH) method for visualizing patterns of mRNA expression in developing fetal mouse prostate tissue sections. The method can be easily adapted to visualize mRNA expression patterns in other mouse tissues or in tissues from other species.

Yüksek Verimli In situ</emFetal Fare Alt Ürogenital Yolu mRNA İfade Desenler Karakterize> Hibridizasyon Yöntemi

Development of the lower urogenital tract (LUT) is an intricate process. This complexity is evidenced during formation of the prostate from the fetal male ...

Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and readily available form of data collection. In many research and disease models however, steady state levels of target gene mRNA does not always directly correlate with steady state protein levels. Post-transcriptional gene regulation is a likely explanation of the divergence between the two. Driven by the binding of RNA Binding Proteins (RBP), post-transcriptional regulation affects mRNA localization, stability and translation by forming a Ribonucleoprotein (RNP) complex with target mRNAs. Identifying these unknown de novo mRNA targets from cellular extracts in the RNP complex is pivotal to understanding mechanisms and functions of the RBP and their resulting effect on protein output. This protocol outlines a method termed RNP immunoprecipitation-microarray (RIP-Chip), which allows for the identification of specific mRNAs associated in the ribonucleoprotein complex, under changing experimental conditions, along with options to further optimize an experiment for the individual researcher. With this important experimental tool, researchers can explore the intricate mechanisms associated with post-transcriptional gene regulation as well as other ribonucleoprotein interactions.

A step by step protocol to isolating and identifying RNA associated complexes through RIP-Chip.

RIP-Chip kullanarak Hücre Ekstraktlarının gelen mRNA mikroRNA&#39;lar ve ribonükleoprotein Kompleksi Protein Bileşenlerinin İzolasyonu ve Tanımlama için Yöntemi

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and ...

Simultaneous Mapping and Quantitation of Ribonucleotides in Human Mitochondrial DNA

Established approaches to estimate the number of ribonucleotides present in a genome are limited to the quantitation of incorporated ribonucleotides using short synthetic DNA fragments or plasmids as templates and then extrapolating the results to the whole genome. Alternatively, the number of ribonucleotides present in a genome may be estimated using alkaline gels or Southern blots. More recent in vivo approaches employ Next-generation sequencing allowing genome-wide mapping of ribonucleotides, providing the position and identity of embedded ribonucleotides. However, they do not allow quantitation of the number of ribonucleotides which are incorporated into a genome. Here we describe how to simultaneously map and quantitate the number of ribonucleotides which are incorporated into human mitochondrial DNA in vivo by Next-generation sequencing. We use highly intact DNA and introduce sequence specific double strand breaks by digesting it with an endonuclease, subsequently hydrolyzing incorporated ribonucleotides with alkali. The generated ends are ligated with adapters and these ends are sequenced on a Next-generation sequencing machine. The absolute number of ribonucleotides can be calculated as the number of reads outside the recognition site per average number of reads at the recognition site for the sequence specific endonuclease. This protocol may also be utilized to map and quantitate free nicks in DNA and allows adaption to map other DNA lesions that can be processed to 5&#180;-OH ends or 5&#180;-phosphate ends. Furthermore, this method can be applied to any organism, given that a suitable reference genome is available. This protocol therefore provides an important tool to study DNA replication, 5&#180;-end processing, DNA damage, and DNA repair.

Here we describe a method amenable to simultaneously quantitate and genome-wide map ribonucleotides in highly intact DNA at single-nucleotide resolution, combining enzymatic cleavage of genomic DNA with its alkaline hydrolysis and subsequent 5&#180;-end sequencing.

Eş zamanlı haritalama ve Nefelometri Ribonucleotides insan mitokondriyal DNA'ın

Established approaches to estimate the number of ribonucleotides present in a genome are limited to the quantitation of incorporated ribonucleotides using ...

Global Identification of Co-Translational Interaction Networks by Selective Ribosome Profiling

In recent years, it has become evident that ribosomes not only decode our mRNA but also guide the emergence of the polypeptide chain into the crowded cellular environment. Ribosomes provide the platform for spatially and kinetically controlled binding of membrane-targeting factors, modifying enzymes, and folding chaperones. Even the assembly into high-order oligomeric complexes, as well as protein-protein network formation steps, were recently discovered to be coordinated with synthesis.
Here, we describe Selective Ribosome Profiling, a method developed to capture co-translational interactions in vivo. We will detail the various affinity purification steps required for capturing ribosome-nascent-chain complexes together with co-translational interactors, as well as the mRNA extraction, size exclusion, reverse transcription, deep-sequencing, and big-data analysis steps, required to decipher co-translational interactions in near-codon resolution.

Co-translational interactions play a crucial role in nascent-chain modifications, targeting, folding, and assembly pathways. Here, we describe Selective Ribosome Profiling, a method for in vivo, direct analysis of these interactions in the model eukaryote Saccharomyces cerevisiae.

Ko-Translasyonel Etkileşim Ağlarının Seçici Ribozom Profilleme ile Küresel Tanımlanması

In recent years, it has become evident that ribosomes not only decode our mRNA but also guide the emergence of the polypeptide chain into the crowded ...

İnsan pre-mRNA üzerinde Haritalama Ribonucleoproteins Hızlı Yüksek verim için Yöntemi (RNPs)

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler