我们正在努力确定用于预测红细胞抗体显著性的最佳方法。单核细胞-巨噬细胞测定似乎比单核细胞单层测定更敏感。因此，我们试图回答的问题是，单核细胞-巨噬细胞检测是否比单核细胞单层检测更适合预测红细胞抗体的重要性。
单核细胞单层测定和单核细胞-巨噬细胞测定的实验挑战是优化其效率以实现更快的完成，同时无需手动吞噬作用评估。换句话说，挑战在于尝试这些检测的半自动化。单核细胞单层测定实际上是我在 1980 年率先提出的，自 1983 年以来，免疫血液学参考实验室一直常规使用，以帮助确定当供体血液输注到具有这些抗体的患者时，哪些红细胞自身抗体或同种抗体有可能引起溶血。
因此，MMA 在检测中使用单核细胞，但抗体介导的溶血通常是由脾脏或肝脏中的巨噬细胞引起的。因此，在这里，我们正在探索在该测定中使用原代巨噬细胞是否比单核细胞更好作为潜在抗体临床意义的预测因子。试图使单核细胞 - 巨噬细胞检测更用户友好、更快，并且不需要光学显微镜，但也许需要一种读取吞噬作用的自动化机制。
首先，用 RPMI-1640 完全培养基稀释全血，并将其分层到密度梯度培养基上进行离心。离心后，取回含有外周血单核细胞或 PMBC 的血沉棕黄层。沉淀获得的 PBMC 后，将它们重悬于 10 毫升预热的 RPMI-1640 完全培养基中。
在开始单核细胞分离过程之前，使用适当的设备确定细胞数量。按照单核细胞分离试剂盒的说明，将样品转移到适当大小的丙烯管中。将富集混合物以每毫升样品 50 μL 的浓度添加到样品中。
上下移液样品后，涡旋使其充分混合，并将样品在 2 至 8 摄氏度下在冰桶中孵育 10 分钟。现在，在此孵育期间涡旋磁性颗粒 30 秒。孵育后，以每毫升样品 100 μL 的浓度向样品中添加磁性颗粒。
涡旋样品，并在 2 至 8 摄氏度下孵育 5 分钟。然后，使用分级移液管添加分离介质，根据需要将体积加满至 2.5 毫升或 10 毫升，并混合。接下来，将没有盖子的丙烯管放入磁力架中，并在室温下孵育约 2.5 分钟。
然后，拿起磁铁并以一个连续的动作倒置，将细胞悬液倒入新的 5 或 14 毫升试管中。将分离的细胞重悬于 RPMI-1640 培养基中。首先，将 5 毫升多聚-D-赖氨酸溶液加入 25 毫升培养瓶中，用于每个巨噬细胞群 M1 和 M2，并将培养瓶在罩中放置至少一小时。
测定细胞计数后，加入 5 毫升 RPMI-1640 培养基，然后将 1 至 5 次、10 次的 6 次单核细胞接种到每个预先编码的 25 毫升培养瓶中。将培养瓶在 37 摄氏度下与 5% 二氧化碳一起孵育至少两个小时。孵育期后，用 PBS 洗涤培养瓶 1 次，用 RPMI-1640 完全培养基洗涤 2 次。
根据所需的细胞类型，向培养瓶中加入 10 mL M1 或 M2 分化培养基，让细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的培养箱中分化 6 天。第 6 天，根据需要向每个培养瓶中加入 5 mL M1 或 M2 极化培养基。让巨噬细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的培养箱中极化至少两天。
在第 8 天收获 M1 或 M2 巨噬细胞之前，如果需要，将上清液收集到 15 毫升试管中以备进一步使用。向培养瓶中加入 1 mL 细胞分离溶液，然后孵育。要终止反应，向培养瓶中加入 3 mL 完全 RPMI-1640 培养基，并将培养基收集到 15 mL 试管中。
向培养瓶中再加入 3 mL 培养基后，使用细胞刮刀将细胞从底部分离。将分离的细胞收集在新鲜的 15 毫升试管中。为了确定 M1 和 M2 巨噬细胞的质量，用 PBS 洗涤细胞两次，并以 0.5 次重悬于完全 RPMI-1640 培养基中，每管 6 个细胞的 10 次方。
然后，使用流式细胞术分析两种细胞群。使用血细胞计数器以台盼蓝的一比一染色比例计数获得的 M1 和 M2 巨噬细胞。在 RPMI-1640 完全培养基中，将巨噬细胞重构至浓度为 1 乘以 10 倍/毫升 6 个细胞的幂。
使用微量移液器，将 400 微升细胞悬液接种到八孔室载玻片的每个孔中，并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的载玻片下在完全加湿的组织培养箱中孵育至少 1.5 小时。要洗涤 RhD 阳性 R2R2 红细胞，向细胞中加入 pH 值为 7.4 的 PBS，并将样品以 350 G 离心 5 分钟。再洗涤两次后，用目标抗体对测试 RBC 样品进行调理素。
将抗体调理素和非调理素红细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳中孵育 1 小时。每 15 分钟间歇性涡旋一次，以防止红细胞沉淀。然后如前所述，用 pH 值为 7.4 的 PBS 洗涤调理素红细胞 3 次。
为了检查 RBC 调理素作用，使用针对一抗调理素抗体的二抗调理作用抗人抗体进行间接抗球蛋白试验。读取间接抗球蛋白测试后，用 RPMI-1640 完全培养基以 1.25% 体积的体积悬浮液重构洗涤的调理素 RHD 和 R2R2 RBC。M1 和 M2 巨噬细胞孵育 1.5 小时后，沿孔的角落轻轻吸出并丢弃上清液培养基。
然后将 400 微升 1.25% 调理化的 RBC 混合物添加到一式三份设置的每个孔中。将样品在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳中孵育 2 小时，不受干扰。现在将 100 毫升 pH 值为 7.4 的 PBS 倒入两个烧杯中。
将载玻片浸入第一个烧杯中，缓慢来回移动 20 到 30 次。然后，将载玻片转移到第二个烧杯中，洗涤 20 至 30 次。从 PBS 中取出玻片，用纸巾轻拍掉多余的液体。
将玻片浸入 100% 甲醇中 45 秒以固定细胞。风干载玻片并使用内部准备的封固剂进行安装。加入盖玻片，让载玻片干燥过夜，然后再定量吞噬作用。
M1 和 M2 巨噬细胞成功极化并培养 8 天，在显微镜图像中观察到明显的形态学特征。在流式细胞术中，M1 巨噬细胞显示 CD80 表达约为 86.1%，CD209 表达约为 0.17%。M2 巨噬细胞 CD209 表达 97.3%，CD80 表达 0.003%。
荧光强度直方图证实，与 M2 巨噬细胞相比，M1 巨噬细胞中的 CD80 表达更高。而 M2 巨噬细胞的 CD209 表达显著高于 M1 巨噬细胞。与 M1 巨噬细胞相比，M2 巨噬细胞表现出显着更高的吞噬指数。
显微镜图像显示，与 M1 巨噬细胞相比，M2 巨噬细胞的吞噬作用增加。本研究旨在评估使用巨噬细胞代替单核细胞预测红细胞抗体意义的潜力。该表显示 M2 巨噬细胞的吞噬能力优于 M1 巨噬细胞或单核细胞，抗体被认为具有临床意义。
因此，随着进一步的研究，使用 M2 巨噬细胞的测定可用于更好地预测抗体的临床意义。
