使用新型 Stamp 装置从二维细胞培养物中生成三维球状体/类器官

我们的研究范围是在琼脂糖模具中使用创新的基于步骤的微孔系统建立一种高效且可重复的方案，用于生成三维细胞培养物。我们的目标是回答如何创建简化、受控的环境，以促进统一、高质量的 3D 培养，用于药物检测、基因工程和相关应用。3D 细胞培养系统的最新进展改善了细胞相互作用并创造了更多类似体内的环境。

这种方法增强了球状类器官的形成，使其成为生物医学研究的一个有前途的工具。目前的 3D 细胞培养技术包括悬滴、旋转细胞培养、低附着塑料、带锥形孔的板、微孔支架、磁珠和无支架水凝胶。这些方法可以形成 3D 细胞结构，每种结构都有自己的优点和局限性。

我们的实验方案解决了在大规模上生成具有一致大小和质量的均匀 3D 球状体和类器官的挑战。它解决了过程中的活力和细胞密度、处理困难和不稳定性问题，为可靠的 3D 细胞培养研究提供了经济高效、可重现的解决方案。我们致力于改进研究工具，生成产生胰岛素的 β 细胞的球状体类器官，用于体外分析和封装在生物聚合物中，旨在逆转 I 型糖尿病和从三阴性人乳腺癌细胞生成球状体类器官作为患者治疗前的药物筛选平台。

使用指定的软件设计图章装置。用软毛海绵和蒸馏水清洗定制的印章，以去除任何残留物。将干净的印章暴露在紫外线下 5 到 10 分钟，以确保无菌。

要制备 1 至 2% 琼脂糖溶液，称取所需量的纯琼脂糖粉末并将其溶解在 PBS 中。在微波炉中加热溶液，直到琼脂糖完全溶解。接下来，将大约 3 毫升 40 摄氏度的琼脂糖溶液移液到六孔板的每个孔中。

将邮票放在孔中央，让琼脂糖凝固 5 到 10 分钟。凝固后，轻轻地来回移动去除印章，以释放真空而不会损坏微孔。用 PBS 洗涤微孔 3 次以去除残留物。

将板暴露在紫外线下 10 分钟，以消除微生物污染。向 6 孔板的每个孔中加入 3 毫升培养基，并在 37 摄氏度下在二氧化碳培养箱中孵育过夜。为了获得猪胰岛的均质悬浮液，将胰蛋白酶添加到二维细胞培养物中以解离细胞。

然后，对细胞进行计数并调整浓度以达到六孔板每个微孔所需的细胞数。将 3 毫升细胞悬液移液到琼脂糖微孔上，并旋转板以确保分布均匀。让细胞在重力作用下沉降 10 到 15 分钟。

然后，在显微镜下观察沉淀的细胞。将板在 37 摄氏度下在 5% 二氧化碳培养箱中孵育。每两到三天，用新鲜培养基替换 50% 的旧培养基或用过的培养基。

继续培养，直到完全形成紧凑的三维结构。要收集球状体或类器官，请去除培养基并使用切割的移液器吸头，通过剧烈移液收集三维结构。通过在琼脂糖微孔中培养 48 小时，通过时间依赖性细胞聚集观察到，成功形成紧凑的三维结构。

从琼脂糖微孔中取出后，保留了活的三维结构，绿色染色表明结构内有活细胞，证实了细胞活力和稳定性。