使用荧光素酶转导的人T细胞追踪双特异性抗体诱导的T细胞运输

该方法允许用户轻松跟踪体内T细胞，以评估归巢动力学并监测T细胞持久性。该技术的主要优点是可以在同一只动物的多个时间点重复，而无需牺牲流式细胞术或免疫组织化学。这种技术也可以修改用于跟踪其他类型的免疫细胞。

要培养293T细胞，通过加入110毫升热灭活胎牛血清和11毫升青霉素链霉素来制备1升DMEM。解冻5次10至第六个293T细胞，并将它们转移到含有DMEM的T175烧瓶中。每三天将细胞分成 1 到 10 个，持续 6 天，直到细胞汇合超过 90%。

对于转染，使用移液器将1.5毫升培养基转移到两个50毫升的管中。向一个试管中加入 10 微克 VSVG 质粒、20 微克 gag pol 和 20 微克点击甲虫红 TDtomato 或 CBRTDR 荧光素酶质粒并混合。将100微升DNA体外转染试剂加入另一管中并混合。

将两个试管在室温下孵育五分钟。将含有DNA的体外转染试剂的培养基滴液转移到含有DNA质粒的管中，并用移液管轻轻混合。在室温下孵育20分钟。

在孵育期间，通过加入5至10毫升0.05%胰蛋白酶来分离293T细胞。细胞分离后，加入10毫升培养基，以800 G离心五分钟。将细胞重悬于1.5毫升培养基中。

将含有DNA体外转染试剂和DNA质粒的培养基加入293T细胞中，并在37摄氏度下孵育30分钟。孵育后，将悬浮液转移到T175烧瓶中。加入 18 毫升培养基，在 37 摄氏度下孵育过夜。

第二天，用玻璃移液管小心地吸出培养基，不要分离细胞，并用18毫升新鲜培养基代替。同样，在 37 摄氏度下孵育过夜。第二天，使用放在冰上的移液管除去病毒上清液，并以800G离心5分钟以沉淀细胞和碎片。

使用0.22微米过滤器过滤病毒上清液，并立即将其放在冰上。对于人T细胞的体外活化，将10毫升含有0.1%牛血清白蛋白或BSA和2毫摩尔EDTA的PBS加入无菌15毫升管中。然后要清洗珠子，将珠子添加到管中并将管子放在磁性架中。

两分钟后，从管中取出PBS。制备DMEM后，加入洗涤珠和白细胞介素-2或IL-2至每毫升30国际单位的最终浓度。使用血细胞仪和台盼蓝染色剂计数 T 细胞。

计数后，将所需数量的T细胞添加到培养基中，并轻轻倒置试管进行混合。在24孔组织培养板的每个孔中接种含有200万个T细胞，磁珠和IL-2的2.5毫升培养基。在37摄氏度的加湿5%二氧化碳中培养。

每天检查20倍物镜下的T细胞，持续三天，以确定何时用荧光素酶转导。接下来，要制备逆转录凝连蛋白板，将两毫升每毫升20微克的逆转录菌素在PBS中加入未处理的六孔板的孔中，并在室温下孵育两个小时。在不划伤板底部的情况下吸出逆转录菌素，并在六孔板中每孔加入三毫升 2% BSA 的 PBS。

在室温下孵育30分钟。接下来，对于棘刺，吸出BSA并用三毫升PBS洗涤孔一次。继续或更换新的PBS，并将板盖在4摄氏度下过夜。

第二天，每孔加入两毫升CBRTDR荧光素酶病毒上清液，并在32摄氏度下以1， 240 G离心90分钟。对于转导，计数 T 细胞后，吸出病毒上清液并在每毫升含有 30 国际单位的 DMEM 中，每孔接种 200 万个 T 细胞。检查T细胞两天。

当细胞几乎汇合时，使用移液管轻轻地将它们从板底部洗掉，并将每个孔转移到单独的T75烧瓶中。加入9毫升培养基，每个烧瓶总共15毫升体积。第二天，加入15毫升培养基，并通过流式细胞术确认转导成功。

麻醉小鼠后，使用26号针头，在100微升培养基中逆眶注射2000万个T细胞。皮下施用1， 000单位重组IL-2以支持体内T细胞存活。然后眶后或腹膜内给予双特异性抗体。

对于体内成像，在麻醉小鼠中用26号针头通过眶后注射施用100微升三毫克D-荧光素。要捕获图像，请将鼠标放在成像仪的光密室中，使承载异种移植物的侧面朝上。使用采集控制面板，选择发光、照片和叠加。

将曝光时间设置为自动，将像素合并设置为中等，将光圈设置为1并获取图像。在第一张图像之后，设置与第一个图像自动计算的曝光时间相匹配，以便可以直接比较后续图像。用鼠标仰卧拍摄另一组图像以评估肺部T细胞的存在。

武装T细胞比非武装T细胞更快地贩运到肿瘤，提前两天离开肺部。通过生物发光测量T细胞随时间浸润到肿瘤中的定量，并表示为肿瘤轮廓上积分的总群数或每像素的辐射度。注射荧光素酶转导的T细胞后28天可以监测T细胞的运输，从而可以在整个治疗过程中跟踪T细胞的归巢和持久性。

显示 T 细胞转运到 DKO 小鼠中 HER2 阳性人乳腺癌患者来源的异种移植物中。与对照双特异性抗体相比，使用未沉默的FC处理HER2双特异性抗体对肿瘤生长没有影响。相比之下，单独使用含有N297A突变或与K322A突变组合的HER2双特异性抗体治疗能够完全阻止肿瘤生长。

对于具有沉默突变的组，与对照双特异性抗体和未沉默的HER2双特异性抗体相比，T细胞发光信号在注射后第3天达到更高的峰值，并持续处于更高的水平。携带神经母细胞瘤患者来源的异种移植物的小鼠表现出Ly6C阳性巨噬细胞的消耗显着增加了T细胞归向肿瘤，导致肿瘤生长减少并延长生存期。这种效果在骨肉瘤患者来源的异种移植物中更为明显。

在靶向肿瘤抗原STEAP1的双特异性抗体中，IGGL SCFV格式在第一剂T细胞后第六天导致T细胞浸润显着增加，并在治疗期间持续存在。体外细胞毒性测定无法预测此类观察结果。在体内跟踪T细胞后，用户仍然可以进行免疫组织化学，以更具体地确定T细胞在肿瘤或其他正常组织中的位置。